Rho相关BTB结构域蛋白1在舌鳞状细胞癌中的表达及对细胞增殖、侵袭和迁移的影响

Expression of Rho-related BTB domain-containing protein 1 in tongue squamous cell carcinoma and its effect on cell proliferation, invasion, and migration

摘要

目的 研究Rho相关BTB结构域蛋白1（RhoBTB1）在舌鳞状细胞癌（TSCC）细胞中的表达，探讨RhoBTB1对TSCC细胞增殖、侵袭、迁移的影响及其分子机制。 方法 利用生物信息学在线数据库查询分析RhoBTB1在TSCC中的表达状况。选取2024年12月—2025年8月于口腔颌面外科手术中切除的TSCC原发病灶45例，采用免疫组织化学法与蛋白免疫印迹（Western blot）法检测TSCC组织及癌旁组织中RhoBTB1的表达水平。选取TSCC细胞系的2种细胞CAL-27和SCC-25细胞进行体外实验。针对RhoBTB1基因序列设计过表达质粒载体及小干扰RNA，采用瞬时转染法转染TSCC细胞，应用实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）评估转染效率；采用CCK-8实验、Transwell细胞侵袭实验、细胞划痕实验及流式细胞术分别评估TSCC细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡能力；Western blot分析RhoBTB1、Rho相关蛋白激酶1（ROCK1）、磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）、磷酸化的磷酸酶与张力蛋白同源物（p-PTEN）、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化的蛋白激酶B（p-AKT）的表达水平。应用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0软件对实验数据进行统计学分析。 结果 TSCC组织中RhoBTB1的表达水平明显低于癌旁组织（P<0.05）；过表达RhoBTB1可抑制TSCC细胞的增殖、侵袭和迁移，促进凋亡，并下调ROCK1/p-AKT、上调p-PTEN表达，上述差异均有统计学意义（P<0.05），PTEN、AKT的表达则无明显差异（P>0.05）；敲低RhoBTB1则产生相反效应，ROCK1/p-AKT表达上调、p-PTEN表达下调（P<0.05），PTEN、AKT的表达同样无明显差异（P>0.05）。 结论 RhoBTB1在TSCC中低表达，可能通过负向调控ROCK1/PTEN/AKT通路抑制其恶性表型，提示RhoBTB1作为抑癌基因具有成为TSCC治疗靶点的潜力。

Abstract

Objective This study explored the expression of Rho-related BTB domain-containing protein 1 (Rho-BTB1) in tongue squamous cell carcinoma (TSCC) cells; its effects on TSCC cell proliferation, invasion, and migration; and the underlying molecular mechanisms. Methods RhoBTB1 expression in TSCC was analyzed by querying a bioinformatics online database. Forty-five cases of primary TSCC lesions resected during oral and maxillofacial surgery from December 2024 to August 2025 were selected. Immunohistochemistry and Western blot were used to detect RhoBTB1 expression in TSCC tissues and adjacent tissues. Two kinds of TSCC cell lines, CAL-27 and SCC-25, were selected for in vitro experiments. The overexpression plasmid vector and small interfering RNA were designed on the basis of the RhoBTB1 gene sequence. TSCC cells were transiently transfected, and the transfection efficiency was evaluated by real-time quantitative polymerase chain reaction. The proliferation, invasion, migration, and apoptosis of TSCC cells were evaluated by CCK-8 assay, Transwell cell invasion assay, cell scratch assay, and flow cytometry respectively. The expression levels of RhoBTB1, Rho-related protein kinase 1 (ROCK1), phosphatase and tensin homologue (PTEN), phosphorylated phosphatase and tensin homologue (p-PTEN), protein kinase B (AKT), and phosphorylated protein kinase B (p-AKT) were analyzed by Western blot. SPSS 22.0 and GraphPad Pri 8.0 were used to analyze the experimental data. Results RhoBTB1 expression in TSCC tissues was significantly lower than that in adjacent tissues (P<0.05). RhoBTB1 overexpression significantly inhibited the proliferation, invasion, and migration of TSCC cells, promoted their apoptosis, down-regulated ROCK1/p-AKT, and up-regulated p-PTEN (P<0.05); no significant difference in expression was observed between PTEN and AKT (P>0.05). Knockdown of RhoBTB1 yielded opposing effects, with the upregulation of ROCK1 and p-AKT and the downregulation of p-PTEN (P<0.05). No significant differences were observed in the expression levels of PTEN and AKT (P>0.05). Conclusion RhoBTB1 is lowly expressed in TSCC and may inhibit its malignant phenotype by negatively regulating the ROCK1/PTEN/AKT pathway, suggesting its potential as an oncogene and therapeutic target.

Graphical abstract

关键词

舌鳞状细胞癌 / Rho相关BTB结构域蛋白1 / Rho相关蛋白激酶1 / PTEN/AKT信号通路 / 增殖 / 侵袭 / 迁移

Key words

tongue squamous cell carcinoma / Rho-related BTB domain-containing protein 1 / Rho-related protein kinase 1 / PTEN/AKT signaling pathway / proliferation / invasion / migration

舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）作为口腔最常见的恶性肿瘤之一，约占口腔恶性肿瘤的25%~40%，同时也是头颈部最致命的癌症类型之一，具有极强的侵袭性、局部浸润性且复发率高^[1]。

目前，舌癌的首选治疗方法是手术，其次是根据肿瘤病理分期进行放疗或化疗。尽管多模式诊断和治疗技术有了相当大的改进，但患者5年生存率仍低于50%，且研究^[2]发现TSCC呈现年轻化趋势。因此，深入探究TSCC发生发展的分子机制，对明确其生物学特性、实现早期诊断及靶向治疗具有重要意义。

Rho相关BTB结构域蛋白（Rho-related BTB domain-containing protein，RhoBTB）1与同源家族成员RhoBTB2、RhoBTB3被鉴定为Rho家族小分子鸟苷三磷酸酶（Rho family of small guanosine triphos-phatases，Rho GTPases）的一个新亚家族^[3]。RhoBTB1由1个N端GTPase结构域、1个富含脯氨酸的结构域、2个Bric a brac、Tramtrack和Broad complex（BTB）结构域和1个羧基末端结构域组成^[4]。RhoBTB1作为Rho GTPase家族的非典型成员，与经典Rho GTPases（如RhoA、Rac1）依赖三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）/二磷酸鸟苷（guanosine diphosphate，GDP）循环的活性调控不同，RhoBTB1的GTPase结构域同源性较低（仅为40%~50%），且缺乏关键催化残基，提示其可能通过非经典途径发挥作用^[5]。RhoBTB1表达在肾癌、乳腺癌和胃癌及结肠癌组织中降低，但在TSCC中的功能和作用机制目前仍不清楚^[6]。

本研究利用生物信息学分析网站查询Rho-BTB1在TSCC中的表达，通过过表达和敲低Rho-BTB1，观察TSCC细胞系CAL-27、SCC-25细胞的增殖、侵袭、迁移、凋亡变化，旨在探索Rho-BTB1成为TSCC的诊断生物标志物和新治疗靶点的潜在可能性，并探讨通过调控ROCK1/PTEN/AKT信号通路发挥作用的机制，为该疾病的临床诊疗策略优化提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 临床资料

本研究纳入2024年12月至2025年8月期间，在康复大学青岛医院（青岛市市立医院）口腔颌面外科接受舌部肿物切除术，且术后病理确诊为TSCC的45例患者，其中男性31例，女性14例；年龄范围43~79岁，平均年龄（68.11±9.93）岁。研究人员对45例患者进行全面临床评估，确保其符合研究和治疗标准。纳入标准：1）术后病理明确诊断为原发性TSCC；2）术前均未接受放疗、化疗及靶向治疗；3）肿瘤原发于舌体，而非复发或转移灶。排除标准：1）患有其他部位或类型的恶性肿瘤病史；2）临床资料不全或无法配合随访的患者。手术过程中，研究人员切取舌部肿瘤组织中心区域获取样本，同时在距离肿瘤边缘至少2 cm处收集周围正常舌组织，即癌旁组织。收集所得组织样本即刻保存在-196 °C液氮环境中，以待后续用于免疫组织化学和蛋白免疫印迹（Wes-tern blot）实验。

在进行样本收集前，45例患者均已充分了解研究内容，签署知情同意书。本研究经青岛市市立医院伦理委员会批准（批准编号为KTLL2024-060），确保患者的隐私和数据安全。

1.1.2 材料和试剂

人TSCC细胞系CAL-27、SCC-25（武汉普诺赛生命科技有限公司）；胎牛血清、高糖型改良杜氏伊格尔培养基（Dulbecco’s modified eagle me-dium，DMEM）、青霉素/链霉素、0.25%胰蛋白酶（武汉普诺赛生命科技有限公司）；Gencefe Trans-Exp通用型转染试剂（江苏赛索飞生物科技有限公司）；Super FastPure CELL RNA Isolation Kit、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技有限公司）；小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）-RhoBTB1、pcDNA3.1质粒载体（江苏赛索飞生物科技有限公司）；实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polyme-rase chain reaction，qRT-PCR）引物Rho-BTB1、β-actin（上海生工生物工程有限公司）；放射免疫沉淀测定（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（5-ethynyl-2’- deoxyuridine，EdU）试剂盒、流式细胞术试剂盒（武汉Elabscience生物科技股份有限公司）；Transwell小室（广州洁特生物过滤股份有限公司）；3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（Abcam公司，英国）；兔抗人多克隆抗体RhoBTB1（武汉Abclonal生物科技有限公司）；Rho相关蛋白激酶1（Rho-related protein kinase 1，ROCK1）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；磷酸酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）、磷酸化的磷酸酶与张力蛋白同源物（phosphorylated phosphatase and tensin homolog，p-PTEN）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、磷酸化的蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-AKT）抗体（CST公司，美国）；辣根过氧化物酶二抗（ASPEN公司，美国）。

1.2 研究方法

1.2.1 生物信息学分析

通过TCGA数据库（https://cancergenome.nih.gov/）和GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）查询RhoBTB1在TSCC中的表达情况。具体步骤如下：收集TCGA-HNSC、GSE34105及GSE34155数据集，从中仅纳入TSCC样本及其相应的对照样本；提取目标基因RhoBTB1的表达量数据后，采用Wilcoxon秩和检验（Wilcoxon test）对表达量进行统计学分析和比较；利用ggplot2绘制箱线图，对每个数据集的正常样本与TSCC样本中RhoBTB1表达差异进行统计学分析。

1.2.2 苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色

将45例患者TSCC及癌旁组织的石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各10 min；梯度乙醇水化，各5 min；水洗后放入苏木精染色6 min；1%盐酸乙醇分化数秒，镜检核清，流水返蓝，伊红复染1 min；梯度乙醇脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，中性树胶封片。

1.2.3 免疫组织化学染色

将TSCC及癌旁组织进行石蜡包埋，连续4 μm切片，烘烤后经二甲苯脱蜡，下行梯度乙醇水化，PBS漂洗，柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复，将组织切片置于3%H₂O₂摇床上震荡以消除组织中内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗，5%正常山羊血清室温封闭30 min，滴加稀释后的一抗，4 ℃过夜孵育，PBS冲洗后加入二抗，室温孵育30 min。加入DAB显色，复染苏木素显核，经脱水、透明、封片、自然晾干后于显微镜下观察。根据染色强度和阳性细胞的百分比来评分，RhoBTB1在细胞核和（或）细胞质出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达。染色强度评分：无染色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。阳性细胞百分比评分：阳性细胞占比0%~5%记0分，6%~25%记1分，26%~50%记2分，51%~75%记3分，76%~100%记4分。总评分=染色强度评分+阳性细胞百分比评分。总评分0~1分为阴性（-），2~3分为弱阳性（+），4~5分为阳性（++），6~7分为强阳性（+++），其中弱阳性、阳性和强阳性均归入阳性表达组。

1.2.4 细胞培养

人TSCC细胞系CAL-27和SCC-25细胞，采用含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM高糖和DMEM/F12培养基，于37 ℃、5% CO₂环境下培养。当细胞密度达到70%~80%时进行传代，用胰蛋白酶消化细胞后加入等量的培养基中和消化酶，离心后收集细胞，重新悬浮后按照1∶3的比例进行传代。

1.2.5 细胞转染

选择状态良好、处于对数生长期的CAL-27和SCC-25细胞。转染分组分别为过表达组（pc-DNA3.1-RhoBTB1）和空载体阴性对照组（pc-DNA3.1-NC）、敲低组（siRNA-RhoBTB1）和阴性对照组（siRNA-NC）。

转染前1 d，在6孔板中以每孔2×10⁵个细胞接种于2 mL含抗生素的培养基中，待细胞长至50%融合开始转染。严格按照Gencefe TransExp通用型转染试剂说明书进行操作，转染6 h后更换成完全培养基，37 ℃培养24 h后进行转染效率及mRNA的检测。

1.2.6 提取细胞RNA进行qRT-PCR实验

转染24 h后，弃净细胞培养基上清，充分裂解细胞，利用Super FastPure CELL RNA Isolation Kit得到各组细胞中的总RNA，去除基因组DNA，使用紫外分光光度仪精确检测RNA纯度及浓度，采用HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）把提取的RNA逆转录成cDNA，各组均取2 μL互补DNA为模板，通过ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix进行扩增反应。每组均设3个副孔，实验重复3次。选用β-actin作为内参。引物序列见表1。qRT-PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共设置40个循环。

反应结束后，采用2^-ΔΔCt法比较转染后Rho-BTB1的mRNA在不同组间基因表达水平的差异。

1.2.7 Western blot实验

收集各组细胞，使用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂）提取总蛋白，BCA法测定蛋白质量浓度。用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿转法转移到聚偏二氟乙烯膜上，将转好的膜加入封闭液室温封闭1 h。根据各抗体稀释比例，将膜与指定的一抗RhoBTB1（1∶1 000）、ROCK1（1∶5 000）、PTEN（1∶1 000）、p-PTEN（1∶500）、AKT（1∶1 000）、p-AKT（1∶3 000）、GAPDH（1∶10 000）在4 ℃下孵育过夜。回收已稀释的一抗，用三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（tris buffered saline with tween 20，TBST）洗膜3次。加入稀释好的二抗（1∶10 000），室温孵育30 min，用TBST洗4次，增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）检测试剂盒显色，暗室曝光。采用Image J分析软件计算条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH灰度值的比值反映目的蛋白的表达水平。

1.2.8 CCK-8细胞增殖实验

CAL-27和SCC-25细胞转染24 h后，调整细胞密度为每孔2×10³个细胞，在96孔板中加入100 μL细胞悬液，同时设不加细胞但加入同体积培养基的空白孔。分别于0、24、48、72 h后，在避光条件下，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h。用酶标仪测定在450 nm处的光密度（optical density，OD）值，每组设5个孔，实验重复3次。记录数值并绘制生长曲线，比较各组之间的差异。

1.2.9 EdU实验

将各组细胞接种于96孔板中培养过夜。加入EdU染色液37 ℃孵育2 h，去除培养基，用含4%多聚甲醛的PBS固定细胞，用含3% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的PBS清洗后，加入含0.3% Triton X-100的PBS，孵育20 min，以通透细胞膜，再次用含3% BSA的PBS清洗后进行荧光标记染色，用含3% BSA的PBS清洗后进行DNA染色，最后通过PBS清洗后，在荧光显微镜下观察EdU标记的细胞。通过EdU阳性细胞率（EdU阳性细胞数与总细胞数的比值）来表示增殖比例。

1.2.10 Transwell侵袭实验

将4 ℃解冻的基质胶与无血清培养基以1∶8比例混匀后，取60 μL垂直加入上室，均匀平铺在底部，将小室放入培养箱中孵育3 h，使其聚合成膜，吸去液体，上下室各加入500 μL无血清培养基，于培养箱孵育2 h水化基底膜。转染48 h后，消化细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为每毫升2×10⁵个。下室加入500 μL完全培养基，上室加入200 μL细胞悬液，放入培养箱48 h。吸去上下室培养基，PBS冲洗2次。4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色30 min，PBS冲洗3次，棉签擦去未与细胞接触的结晶紫。每个小室在显微镜下取3个视野进行拍照，计算穿膜细胞数，实验重复3次。

1.2.11 细胞划痕实验

CAL-27和SCC-25细胞转染24 h后，消化细胞，制备细胞悬液，调整细胞密度，6孔板每孔接种5×10⁵个细胞，培养至80%~90%融合时，换无血清培养基培养4 h以抑制细胞增殖，确保细胞处于静止期。用200 μL的枪头垂直于6孔板底部中央进行划痕。PBS冲洗去除脱落的细胞。每孔加入2 mL无血清培养基，在倒置显微镜下拍照后，放入培养箱中进行培养。于24、48 h后重复拍摄。使用Image J分析软件定量测量相对愈合率。计算公式：相对愈合率=（0 h划痕宽度-24 h或48 h划痕宽度）/0 h划痕宽度。实验重复3次。

1.2.12 流式细胞术

转染24 h后，胰酶消化细胞，离心后弃上清，PBS洗涤重悬。调整细胞密度为每毫升5×10⁵个。取1 mL细胞悬液，300×g离心5 min，弃上清，PBS洗涤，加500 μL稀释的1×Annexin V Binding Buffer重悬。依次加入5 μL的Annexin V-FITC Reagent和5 μL的PI Reagent（50 μg/mL）。轻轻混匀后，室温下避光孵育20 min，立即上机检测。实验重复3次。

1.3 统计学分析

使用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0软件分析数据。Shapiro-Wilk检验（S-W检验）检测正态性。实验数据以均数±标准差表示，两组间的比较用独立样本t检验，多组间的比较用单因素方差分析，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 生物信息学分析

生物信息学查询结果见图1：3套数据集中RhoBTB1的表达量，肿瘤组RhoBTB1的表达量与正常组相比均显著下调（P<0.01）。

2.2 TSCC和癌旁组织病理分析

HE染色结果见图2：TSCC肿瘤细胞（红色箭头）呈浸润性生长，呈巢团状排列且可见明显异型性，细胞间可见细胞间桥（蓝色箭头），胞浆丰富，细胞核异型性显著，核仁明显，染色质呈粗颗粒状，肿瘤周围间质内纤维组织疏松水肿，可见较多炎症细胞（绿色箭头）浸润；癌旁组织表面鳞状上皮（黑色箭头）完整，细胞未见明显异型性（图2）。

2.3 RhoBTB1在TSCC组织中的表达

免疫组织化学染色结果显示：RhoBTB1主要在细胞质中呈阳性表达，呈棕黄色（图3）。在本研究的45例TSCC组织样本中，有26例（57.78%）呈现RhoBTB1阳性表达，19例（42.22%）为阴性表达。相较之下，癌旁组织样本中，33例（73.33%）呈现RhoBTB1阳性表达，而12例（26.67%）为阴性表达。上述数据表明，RhoBTB1在癌旁组织中的表达明显高于TSCC组织，差异具有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果进一步证实，癌旁组织中RhoBTB1蛋白表达明显高于TSCC组织，差异具有统计学意义（P<0.05，如图4所示）。

2.4 转染后各组细胞转染效率的检测

qRT-PCR结果显示：转染后，CAL-27和SCC-25细胞系中，过表达组RhoBTB1的mRNA表达水平高于空载体对照组，差异具有统计学意义（P< 0.05，图5A、B）。同时在敲低实验中，与各自的阴性对照组相比，siRNA-RhoBTB1#1、siRNA-RhoBTB1#2和siRNA-RhoBTB1#3组均表现出Rho-BTB1 mRNA的相对表达量下降，差异具有统计学意义（P<0.05，图5C、D），其中siRNA-RhoBTB-1#3组的转染效率最高，因此选择该组进行后续实验研究。

2.5 转染后ROCK1/PTEN/Akt信号通路相关蛋白的表达

Western blot结果显示：在CAL-27和SCC-25两种细胞系中，RhoBTB1过表达组与阴性对照组相比，ROCK1和p-AKT的蛋白相对表达量下调，而p-PTEN的蛋白相对表达量升高，差异均有统计学意义（P<0.05，图6A、B）；PTEN和AKT的蛋白相对表达量的差异无统计学意义（P>0.05，图6A、B）。敲低RhoBTB1后则相反，与对照组相比，ROCK1、p-AKT的蛋白相对表达量上升，p-PTEN的蛋白相对表达量下降，差异均有统计学意义（P<0.05，图6C、D）；PTEN和AKT的蛋白相对表达量未见明显变化（P>0.05，图6C、D）。这些结果提示：RhoBTB1可能通过负向调控ROCK-1/PTEN/Akt信号通路，可能在TSCC的生物学过程中发挥作用。

2.6 RhoBTB1对TSCC细胞增殖的影响

EdU实验结果见图7~9。在CAL-27细胞系中，过表达RhoBTB1后，细胞的增殖率明显低于其阴性对照组（pcDNA3.1-NC组为0.211±0.025，pc-DNA3.1-RhoBTB1组为0.112±0.013，差异具有统计学意义，P<0.05）；相反，敲低RhoBTB1后，细胞增殖率明显高于其阴性对照组（siRNA-NC组为0.202±0.017，siRNA-RhoBTB1组为0.364±0.027，差异具有统计学意义，P<0.05）。在SCC-25细胞系中，过表达RhoBTB1同样导致细胞增殖率低于其阴性对照组（pcDNA3.1-NC组为0.197±0.021，pcDNA3.1-RhoBTB1组为0.123±0.019，差异具有统计学意义，P<0.05）；敲低RhoBTB1后，细胞增殖率明显高于其阴性对照组（siRNA-NC组为0.190±0.016，siRNA-RhoBTB1组为0.399±0.024，差异具有统计学意义，P<0.05）。以上结果提示：RhoBTB1可抑制TSCC细胞的增殖。

CCK-8实验结果显示：在SCC-25、CAL-27两组细胞系中，当RhoBTB1过表达时，相较于阴性对照组，细胞OD值自24 h起即呈下降趋势；至48 h和72 h，这种差异进一步扩大，TSCC细胞的增殖能力被显著抑制，且差异具有统计学意义（P< 0.05，图10）。与之相反，当RhoBTB1被敲低时，与阴性对照相比，细胞OD值从24 h开始上升，48 h和72 h时该趋势更显著，促进了TSCC细胞增殖，且差异具有统计学意义（P<0.05，图10）。上述结果提示，RhoBTB1具有抑制TSCC细胞增殖的作用。

2.7 RhoBTB1对TSCC细胞侵袭的影响

Transwell实验结果显示：在CAL-27细胞中，过表达RhoBTB1后，与阴性对照组相比，穿膜细胞数量明显减少（pcDNA3.1-NC组：413.21±37.19，pcDNA3.1-RhoBTB1组：221.48±26.12；且差异具有统计学意义，P<0.05，图11）。相反，敲低RhoBTB1后，穿膜细胞数量明显高于其阴性对照组（siRNA-NC组：445.80±36.42，siRNA-Rho-BTB1组：856.64±42.06；且差异具有统计学意义，P<0.05，图11）。同样，在SCC-25细胞中，过表达RhoBTB1后，与阴性对照组相比，穿膜细胞数量明显减少（pcDNA3.1-NC组：351.83±30.00，pc-DNA3.1-RhoBTB1组：165.35±23.11；差异有统计学意义，P<0.05，图11）。敲低RhoBTB1后穿膜细胞数明显高于其阴性对照组（siRNA-NC组：365.37±39.02，siRNA-RhoBTB1组：711.03±34.25；差异有统计学意义，P<0.05，图11）。以上结果表明，RhoBTB1可抑制TSCC细胞的侵袭能力。

2.8 RhoBTB1对TSCC细胞迁移的影响

细胞划痕实验结果见图12~14。CAL-27细胞在培养24 h后，过表达RhoBTB1组的细胞迁移率相较于其阴性对照组明显降低（pcDNA3.1-NC组为35.85%±3.76%，pcDNA3.1-RhoBTB1组为19.80%±2.35%；差异具有统计学意义，P<0.05），相反，敲低RhoBTB1后的细胞迁移率相较于阴性对照组升高（siRNA-NC组为34.17%±2.94%，si-RNA-RhoBTB1组为56.83%±5.65%；差异具有统计学意义，P<0.05）；48 h后，过表达RhoBTB1的细胞迁移率明显低于其阴性对照组（pcDNA3.1-NC组为67.34%±5.17%，pcDNA3.1-RhoBTB1组为46.97%±4.04%；差异具有统计学意义，P<0.05），敲低RhoBTB1后的细胞迁移率明显高于其阴性对照组（siRNA-NC组为65.40%±4.72%，siRNA-RhoBTB1组为85.29%±6.95%；差异具有统计学意义，P<0.05）。

SCC-25细胞在培养24 h后，过表达RhoBTB1的细胞迁移率相较于其阴性对照组明显降低（pc-DNA-3.1-NC组为35.08%±2.42%，pcDNA3.1-Rho-BTB1组为18.44%±3.11%；差异具有统计学意义，P<0.05），相反，敲低RhoBTB1后细胞迁移率相较于阴性对照组明显升高（siRNA-NC组为36.08%± 2.92%，siRNA-RhoBTB1组为58.65%±7.15%；差异具有统计学意义，P<0.05）；48 h后，过表达RhoBTB1的细胞迁移率明显低于其阴性对照组（pcDNA3.1-NC组为63.71%±6.12%，pcDNA3.1-RhoBTB1组为45.02%±4.07%；差异具有统计学意义，P<0.05），敲低RhoBTB1后细胞迁移率明显高于其阴性对照组（siRNA-NC组为63.17%± 4.71%，siRNA-RhoBTB1组为82.86%±6.10%；差异具有统计学意义，P<0.05）。以上结果表明：RhoBTB1可抑制TSCC的迁移能力。

2.9 RhoBTB1对TSCC细胞凋亡的影响

流式细胞术Annexin FITC/PI染色结果见图15。在CAL-27细胞系中，过表达RhoBTB1后，细胞凋亡率明显高于阴性对照组（pcDNA3.1-NC组为5.38%±0.41%，pcDNA3.1-RhoBTB1组为9.06%± 0.53%；差异具有统计学意义，P<0.05），而敲低RhoBTB1后，细胞凋亡率明显低于阴性对照组（siRNA-NC组为4.93%±0.33%，siRNA-RhoBTB1组为2.86%±0.25%；差异具有统计学意义，P<0.05）。在SCC-25细胞系中，过表达RhoBTB1后，细胞凋亡率明显高于阴性对照组（pcDNA3.1-NC组为3.42%±0.27%，pcDNA3.1-RhoBTB1组为6.04%±0.45%；差异具有统计学意义，P<0.05），而敲低RhoBTB1后，细胞凋亡率明显低于阴性对照组（siRNA-NC组为3.29%±0.21%，siRNA-Rho-BTB1组为1.44%±0.11%；差异具有统计学意义，P<0.05）。以上结果表明：RhoBTB1可促进TSCC的凋亡。

3 讨论

TSCC是口腔癌中最常见的类型之一，当疾病进展至晚期，TSCC会表现出明显的侵袭转移特征，肿瘤细胞极易通过血行转移到肺部等远处器官，同时区域淋巴结转移的情况也频繁发生。这种晚期转移特性导致患者预后情况差，严重影响其生存质量与生存时间。深入研究其分子机制，寻找新的治疗靶点具有重要意义。

RhoBTB1属于Rho GTPase家族的非典型成员，它的结构特征和功能调控机制较为特殊，二者都和肿瘤的发生发展存在密切关联。经典的Rho家族蛋白依靠GTP/GDP循环来进行调控，而Rho-BTB1可通过BTB结构域介导蛋白二聚化，结合Cullin3依赖性泛素连接酶复合体，参与底物蛋白泛素化^[7]。既往研究^[8]已经证实：在乳腺癌细胞中，RhoBTB1会对METTL7B的表达进行调控，以此来维持高尔基体结构的完整性；当RhoBTB1的表达出现缺失时，会使高尔基体发生碎片化，进而对细胞极性造成破坏，同时增强细胞的侵袭能力。在结肠癌中，miR-31通过靶向敲低RhoBTB1的表达，导致RhoBTB1功能缺失，最终促进肿瘤细胞迁移和增殖^[9]。目前针对RhoBTB1在TSCC中所发挥作用的研究还比较少。本研究发现TSCC组织中RhoBTB1表达低于癌旁组织，这一现象表明RhoBTB1可能对TSCC的恶性进展过程起到负向调控的作用。进一步研究还发现，当RhoBTB1出现功能缺失时，会导致细胞的侵袭能力增强，细胞产生凋亡抵抗，这些结果都提示RhoBTB1有可能成为治疗TSCC的潜在靶点。

ROCK1作为Rho GTPase家族中的关键效应分子，广泛参与肿瘤的发生、发展和转移等多种生物学过程，其过度激活会增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力。ROCK1是细胞迁移和细胞骨架重组的核心调控因子，通过磷酸化下游靶蛋白，调控细胞的运动、黏附、增殖及凋亡等过程^[10]。研究^[11]表明：ROCK1能通过磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亚基1（myosin phosphatase target subunit 1，MYPT1）等下游信号分子，促进肿瘤细胞对细胞外基质的降解，进而增强肿瘤细胞的浸润和转移能力。同时，ROCK1还能通过磷酸化肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）及抑制肌球蛋白磷酸酶（myosin light chain phosphatase，MLCP）的活性，增强肌动球蛋白收缩力，驱动细胞后端收缩和前缘伪足延伸，从而促进细胞迁移^[12]。这一调控过程还涉及桩蛋白（paxillin）的磷酸化，通过完成黏着斑的动态组装与解聚，为肿瘤细胞侵袭提供机械力支撑，最终促进肿瘤细胞的运动和扩散^[13]。研究^[14]发现：RhoBTB1的Rho结构域发生E-64A/K197A双突变时，会通过协同构象变化，显著增强其与ROCK1的蛋白激酶C相关激酶同源区域1（protein kinase C-related kinase homology region 1，HR1）样区域的结合能力，进而抑制ROCK1的激酶活性。RhoBTB1通过其BTB结构域与Cullin3结合形成泛素连接酶复合体，通过其Rho结构域与ROCK1结合并介导其泛素化降解，从而负向调控ROCK1的蛋白表达水平^[5,15]。在本研究中，当TSCC细胞中过表达RhoBTB1时，ROCK1的表达受到抑制，细胞的增殖和迁移能力降低，同时凋亡率升高；而敲低RhoBTB1的表达则会引发相反效应。这些发现提示：RhoBTB1可能通过与ROCK1结合来抑制其蛋白表达，进而调控细胞骨架的动力学过程，影响肿瘤细胞的黏附与迁移能力，最终实现对TSCC转移的抑制作用。

PTEN是重要的抑癌基因，和多种肿瘤的生长进程存在紧密关联，PTEN的异常表达不仅可作为肿瘤发生和发展的重要分子标志物，还可能成为未来癌症治疗的潜在靶点。PTEN表达水平下调，会增强肿瘤细胞的侵袭与迁移能力，促进血管生成，同时降低肿瘤细胞对化疗和靶向治疗的敏感性^[16]。乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌和胶质母细胞瘤等多种恶性肿瘤的发生，都与PTEN基因缺失、突变或表观遗传修饰导致其功能丧失有关^[17-19]。ROCK1通过促进PTEN的C-末端磷酸化，抑制PTEN单分子酶的活性，去磷酸化过程使PTEN能够二聚化，募集到细胞膜上并发挥其肿瘤抑制功能^[20-21]。在本研究中，当TSCC细胞中过表达RhoBTB1后，ROCK1的表达降低，p-PTEN的表达升高，敲低Rho-BTB1后则有相反的表现。由此可见，RhoBTB1可能通过靶向抑制ROCK1，解除ROCK1对PTEN的磷酸化抑制，进而抑制TSCC的恶化。

AKT可通过磷酸化雷帕霉素哺乳动物靶标（mammalian target of rapamycin，mTOR）、糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3 beta，GSK-3β）、胱天蛋白酶9（caspase 9，CASP9）等多种下游效应分子，在细胞生存、增殖、代谢、凋亡及血管生成中发挥重要作用^[22]。AKT激活mTOR后，能促进细胞生长和蛋白质合成，抑制Bcl-2相关死亡促进因子（BCL2 associated agonist of cell death，BAD）和半胱天冬酶-9酶原（proenzyme of cysteinyl aspartate-specific proteinase-9，procaspase-9）等细胞凋亡相关蛋白的活性，从而抑制细胞凋亡^[23]。AKT通过磷酸化Forkhead家族等转录因子，调控下游基因的表达，进而影响细胞周期以及细胞凋亡进程。AKT还可上调细胞周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）等细胞周期相关基因的表达，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡^[24]。AKT还参与调节脂肪酸合成和糖酵解等代谢过程，促进快速细胞分裂^[25-26]。这种代谢的调控机制，一方面为肿瘤细胞的生存和发展提供能量，另一方面提升肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。PTEN通过其脂质磷酸酶活性，将磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸[phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate，PIP₃]去磷酸化为磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP₂），从而抑制AKT的磷酸化激活^[27]。在本研究中，当TSCC细胞中过表达Rho-BTB1后，p-PTEN的表达升高，p-AKT的表达降低，敲低RhoBTB1后则有相反的表现。由此推测，RhoBTB1可能会通过增强PTEN磷酸酶活性，进而抑制AKT信号通路的异常激活，最终对TSCC细胞增殖、侵袭和迁移产生抑制作用。

本研究发现RhoBTB1与ROCK1之间可能存在潜在的相互作用关系，影响肿瘤细胞的迁移和侵袭。RhoBTB1缺失会解除对ROCK1/PTEN/AKT信号通路的抑制，进而降低PTEN磷酸化水平，并促进AKT蛋白磷酸化，从而在肿瘤发生、细胞侵袭和迁移中发挥关键作用。而当RhoBTB1过表达时，PTEN蛋白的磷酸化上调，AKT蛋白的磷酸化下调。这些结果表明ROCK1/PTEN/AKT信号通路可能是RhoBTB1的重要下游靶点，在介导Rho-BTB1的生物学功能以及在细胞生长的抑制作用中发挥重要作用。

综上所述，RhoBTB1在TSCC中表达水平显著降低，RhoBTB1可能通过负调控ROCK1/PTEN/AKT信号通路抑制TSCC细胞增殖、侵袭、迁移，促进凋亡，为TSCC临床诊断和靶向治疗提供了新的研究方向。上述发现尚未在体内实验中进行验证，关于RhoBTB1在TSCC微环境中是否通过调控上皮-间质转化对肿瘤细胞转移进程产生影响、与PTEN/AKT通路的交互作用是否存在组织特异性差异，以及对于RhoBTB1在TSCC发生发展过程中的生物学功能和机制，将在未来进行进一步深入研究。

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基金资助

山东省医药卫生科技项目(202308020420)

青岛市医药卫生科研指导项目(2023-WJZD164)