酿酒酵母基因转录区核小体缺乏序列对人干扰素α-2b基因表达的影响

Effect of Nucleosome-Depleted Region in the Gene Transcription Region of Saccharomyces cerevisiae on IFNα-2b Gene Expression

摘要

基因编码序列中同义密码子的使用与基因表达紧密相关。将人干扰素α-2b基因编码序列中的密码子替换成酿酒酵母高表达基因的最适同义密码子，并通过RT-qPCR、蛋白质印迹分析和ELISA等方法对比分析了IFNα-2b基因的表达水平。结果显示，优化后IFNα-2b基因的mRNA相对表达水平和蛋白质表达水平显著提高。已知酿酒酵母基因转录调控区±1核小体和它们之间的核小体缺乏区域（NDR）在基因表达调控中具有重要作用，为了考察NDR序列长度对外源基因表达水平的影响，选取了6个酵母基因的转录调控区，以该区域内±1核小体和它们之间的NDR序列作为外源基因的转录调控序列，构建了IFNα-2b基因表达系统。结果显示：在构建的6个调控序列中，将长NDR序列剪短后，IFNα-2b基因的mRNA相对表达水平和蛋白质表达水平显著降低；将短NDR序列加长后，IFNα-2b基因的mRNA相对表达水平和蛋白质表达水平显著提高。研究表明，以±1核小体和NDR序列为转录调控序列构建的表达体系可以调控外源基因的表达水平，该方法为调控外源基因表达提供了一种新的研究思路。

Abstract

The use of synonymous codons in gene coding sequences is closely related to gene expression. To optimize the expression of the human interferon α-2b gene in S. cerevisiae， we substituted the codons of this gene with those that are optimally synonymous with codons of highly expressed genes. Then， we compared the expression levels of IFNα-2b using RT-qPCR， western blot analysis， and ELISA. The results showed that the relative mRNA expression level and protein expression level of human interferon α-2b gene were significantly increased after optimization. It is known that the ±1 nucleosomes and the nucleosome-depleted region （NDR） between the S. cerevisiae genes have important roles in gene expression. To examine the effect of NDR sequence length on transgene expression， we chose the ±1 nucleosomes and the nucleosome free sequences between the transcriptional regulatory regions of six S. cerevisiae genes as transcriptional regulatory sequences of transgene. Then， the codon-optimized human interferon α-2b gene expression system was constructed. The results showed that the relative mRNA expression level and protein expression level of the IFNα-2b gene were significantly reduced after the long NDR was shortened. After the short NDR was lengthened， the relative mRNA expression level and protein expression level of IFNα-2b gene were significantly increased. It is shown that the constructed expression system with ±1 nucleosomes and NDR sequences as transcriptional regulatory sequences can regulate the expression of transgene. Our method provides a new research idea for regulating transgene expression.

Graphical abstract

关键词

酿酒酵母 / 人干扰素α-2b / 密码子优化 / 核小体缺乏区域 / 基因表达与调控

Key words

Saccharomyces cerevisiae / human interferon α-2b / codon optimization / nucleosome depleted region / gene expression and regulation

基因表达调控是人们一直关注的热点问题^［1］。基因表达是一个复杂的调控过程，通过不同的调控机制确保基因在细胞内表达的时间、地点和方式的精确控制。这些机制包括转录调控、mRNA稳定性和降解，以及染色质重塑等^［2-4］。在转基因工程中，多数研究都是基于基因转录区域的一维序列信息，探讨序列中的调控元件与外源基因表达水平的关系，目的是尽可能地提高外源基因的表达水平^［5-7］。目前，转基因技术多使用微生物工程菌作为宿主。然而，在以真核生物为工程菌的技术中，对于转基因表达调控机制的理解仍是当前研究的难点。

核小体是构成真核生物染色质的基本结构单位，核小体由约147 bp的DNA以左手超螺旋的形式缠绕在组蛋白八聚体周围而形成^［8-9］。酿酒酵母转录起始位点（Transcription start site，TSS）的上下游存在两个定位良好的核小体，分别称为-1核小体和+1核小体。±1核小体之间是一个长度可变的核小体缺乏区域（Nucleosome-depleted region，NDR）^［10-11］。大多数基因的TSS位于NDR的下游或+1核小体内，±1核小体以及它们之间的NDR序列对基因表达调控具有重要影响^［12-14］。对于酿酒酵母^［15］、果蝇^［16］、线虫^［17］、植物^［18］和人^［19］全基因组的核小体定位图谱研究揭示，大多数酵母基因和高等真核生物中的许多基因在转录起始位上游存在一个核小体缺乏区域。NDR是基因转录起始的重要功能元件，富含转录因子（Transcription factor，TF）结合位点。NDR通过与TF结合启动基因转录，TF与NDR的结合速率决定了基因的转录效率^［20-21］。因此，TF与DNA的结合速率与NDR序列的长度紧密关联^［22］。

干扰素α-2b（Interferon alfa-2b，IFNα-2b）是一种具有抗病毒、抗肿瘤、抗增殖、免疫调节等多种生物活性的细胞因子，常用于临床疾病治疗^［23］。表达人干扰素α-2b的工程菌主要有大肠杆菌、酵母菌，也有在人或小鼠细胞中表达人干扰素α-2b的研究。目前，在酵母菌中，大多数研究主要以毕赤酵母GS1115为宿主表达人干扰素α-2b，以酿酒酵母菌为宿主表达人干扰素α-2b的研究很少。本研究以酿酒酵母为宿主，以基因转录调控区±1核小体和它们之间的NDR序列作为转基因的调控序列，以密码子优化后的IFNα-2b基因编码序列作为目的基因，构建了酿酒酵母转基因表达系统，探索NDR序列的长度对转基因表达的影响。

1 IFNα-2b基因密码子优化及胞内表达

1.1 IFNα-2b基因密码子优化

基于课题组前期研究给出的酿酒酵母高表达基因相对同义密码子使用值（Relative synonymous codon usage，RSCU）^［24］，对IFNα-2b基因编码序列进行同义密码子替换，以提高IFNα-2b基因的表达水平，RSCU值见表1。在表1中，RSCU值最高的同义密码子称为最适同义密码子。例如精氨酸（Arg）有6个同义密码子，其中：同义密码子aga的RSCU值最高（4.93），称为最适同义密码子；其次为cgt（0.91），称为次最适同义密码子；cga和cgg的RSCU值为0，称为稀有密码子。

人IFNα-2b基因编码序列的密码子优化方法如下：根据表1中的酿酒酵母最适同义密码子，替换人IFNα-2b基因编码序列中的对应同义密码子。优化过程中避免出现常用酶切位点，若酶切位点出现在前1个密码子的第3位和后1个密码子的第1位，则将前一个最适同义密码子替换为次最适同义密码子。整个优化过程共替换了91个同义密码子（见图1）。通过密码子适应指数（Codon adaptation index，CAI）评估IFNα-2b基因的表达水平。结果显示，优化前IFNα-2b基因的CAI为0.083，优化后为0.912，表明优化后的表达水平显著提高。优化前的基因简称为IFNO，优化后的基因简称为IFNM。

1.2 菌株和培养基

用于IFNα-2b基因胞内表达分析的酿酒酵母菌INVSc1和质粒pYES2购自武汉淼灵生物科技有限公司，用于质粒构建和转化的大肠杆菌DH5α感受态细胞购自Takara公司，用于酿酒酵母的繁殖的YPD培养基购自上海生物工程有限公司，用于酿酒酵母转化子筛选的SD-Ura培养基购自Takara公司。

1.3 优化前和优化后IFNα-2b基因的克隆

将优化前和优化后的IFNα-2b基因送往上海生物工程有限公司合成，分别命名为pUC57-IFNO和pUC57-IFNM。以这两个质粒为模板，用引物GS、GX通过PCR扩增IFNα-2b基因片段，反应程序为：94 ℃预变性5 min，随后进行35个循环（94 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min）。回收目的片段后，使用T₄ DNA连接酶将其连接至pMD19-T质粒，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞获取阳性克隆，最终获得的质粒命名为pMD19T-IFNO和pMD19T-IFNM。

1.4 目的基因重组表达载体的构建

使用KpnⅠ和Xba Ⅰ内切酶酶切质粒pMD19T-IFNO、pMD19T-IFNM和pYES2，回收目的片段。使用T₄ DNA连接酶将IFNO和IFNM基因片段连接至质粒pYES2，获得的质粒命名为pYES2-IFNO和pYES2-IFNM。IFNα-2b基因克隆与表达所用引物见表2。

1.5 目的基因转化酿酒酵母INVSc1细胞及筛选阳性克隆

通过PEG/LiAc法分别将质粒pYES2-IFNO、pYES2-IFNM和pYES2分别转化至酿酒酵母INVSc1感受态细胞，涂布SD-Ura选择培养基，28 ℃培养倒置培养2~3 d，然后使用菌液PCR法鉴定阳性克隆。选取阳性克隆于YPD培养基，28 ℃培养至对数期，收集菌体。

1.6 目的基因转录水平检测

使用Yeast total RNA isolation kit（Takara）提取酵母RNA，并用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）将RNA逆转录为cDNA。反转录在42 ℃条件下反应15 min，85 ℃反应5 s。以cDNA为模板，使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Takara）进行qPCR，反应在Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR仪上完成。qPCR条件：95 ℃变性30 s，随后95 ℃变性5 s，60 ℃变性30 s，共扩增40个循环；溶解曲线温度变化为65~95 ℃，每0.5 ℃递增一次，持续10 s。CT≥37视为无效，采用2^-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量，每个样品设3个生物学重复。

1.7 目的基因蛋白表达检测

在4 ℃条件下，8000×g离心1 min收集细胞，并用无菌PBS（pH 7.4）清洗两次。使用酵母总蛋白提取试剂盒提取酿酒酵母总蛋白，通过BCA法（Takara）测定蛋白浓度。将等量蛋白煮沸5 min后，在12.5% SDS-PAGE胶中分离并转移至PVDF膜。室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h，随后加入GFP兔单克隆抗体（1∶5000，Abcam），4 ℃孵育过夜。次日，用HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶5000，Abcam）孵育1 h，清洗3次后，使用ECL试剂盒（Bio-Rad）检测信号，并通过VILBER Fusion FX6系统成像分析。

1.8 目的基因蛋白定量分析

使用IFNα ELISA试剂盒，参照说明书检测样品中IFNα-2b蛋白质的浓度。使用PBS对样品进行1/100稀释，并进行重复分析。根据稀释说明生成IFNα-2b的标准曲线。使用多功能酶标仪在450 nm处读取样品的OD值。IFNα-2b的单位显示为pg/mL。每个样品设置3个生物学重复。

1.9 结果

本研究使用酿酒酵母基因最适同义密码子和次最适同义密码子（RSUC≥1）优化了IFNα-2b基因的编码序列，并导入酿酒酵母INVSc1做胞内表达分析。采用RT-qPCR法检测了密码子优化前后IFNα-2b基因mRNA的相对表达水平。如图2（a）所示，优化后IFNα-2b基因mRNA的相对表达水平是优化前的1.6倍，t检验结果显示差异显著。随后，使用Western blot和ELISA试剂盒检测了IFNα-2b蛋白质表达量。通过WB分析，在重组酿酒酵母INVSc1细胞中检测到了约20 kDa的蛋白质产物，与IFNα-2b基因的氨基酸序列分子量一致。从图2（b）和图2（c）可知，IFNα-2b基因在酿酒酵母中获得了表达。使用IFNα-2b Elisa试剂盒检测了IFNα-2b蛋白质的含量。图2（d）显示，优化后IFNα-2b蛋白质表达量是优化前的1.75倍，配对样本t检验结果显示两者之间的差异极显著（P<0.05）。IFNα-2b蛋白质表达水平与mRNA相对表达水平趋势一致，说明使用课题组先前给出的酿酒酵母高表达基因的RSUC值来优化外源基因编码序列的方法有效可行。

2 NDR调控IFNα-2b基因表达的分析

2.1 IFNα-2b基因转录系统的构建

根据课题组前期关于NDR与外源基因表达水平间关系的研究结果^［25］，使用前期研究所选取的6个酿酒酵母基因转录区±1核小体序列和NDR序列作为IFNα-2b基因的调控序列。其中长NDR序列3条，称为L-NDR；短NDR序列3条，称为S-NDR。6个基因的转录调控序列信息见表3。

为了确保+1核小体位置不变，在IFNα-2b基因编码区上游插入MFα1基因（GenBank： Z73543.1）的信号肽序列，并选用CYC1-ter序列作为终止序列，以消除基因3’UTR对IFNα-2b表达的影响。+1核小体的中心位置参考Brogaard等^［26］的注释，转录调控序列来源于酿酒酵母基因组数据库（R64版本）。IFNα-2b基因转录系统见图3。

2.2 NDR序列的改造

为了考察NDR长度对IFNα-2b基因表达水平的影响，根据课题组先前研究方法改造了NDR序列的长度，具体改造方法见Wang等^［25］的研究。NDR-和NDR+序列的长度信息见表3。

2.3 菌株和培养基

酿酒酵母BY4741购自武汉淼灵生物科技有限公司，用于AUR基因的克隆和核小体缺乏区域调控IFNα-2b基因表达的研究。质粒和培养基同1.2节。

2.4 酿酒酵母整合型表达载体构建

以酿酒酵母BY4741基因组DNA为模板，使用引物AUR-F和AUR-R通过PCR扩增AUR基因，并在两端添加Hpa Ⅰ和SnaB Ⅰ酶切位点。用Hpa Ⅰ和SnaB Ⅰ分别酶切质粒pYES2和AUR基因，回收线性载体pYES2和目的片段，再用T₄ DNA连接酶将两者连接，获得质粒pYES2-AUR。随后，利用Clon Express® Ultra One Step Cloning Kit（诺唯赞）将6条NDR-/NDR+-IFN序列克隆至pYES2-AUR载体上，构建单拷贝整合表达载体pYES2-AUR-NDR-IFN。

2.5 目的基因转化酿酒酵母及筛选阳性克隆

使用限制性内切酶EcoR Ⅰ线性化pYES2-AUR-NDR-IFN质粒。参照Gietz等^［27］的LiAc法，使用Yeast Transformation System 2将线性化的pYES2-AUR-NDR-IFN导入酿酒酵母BY4741感受态细胞，线性化的pYES2-AUR-NDR-IFN片段以AUR基因为同源臂，通过同源重组的方式整合到酿酒酵母BY4741的第Ⅺ条染色体上，然后在SD-Ura琼脂培养基上筛选阳性克隆。

2.6 目的基因拷贝数的测定

选取阳性克隆，经PCR法检测后，采用绝对定量PCR法，以酿酒酵母单拷贝管家基因TUB1为内参基因绘制标准曲线并确定目的基因的拷贝数。绝对定量PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，循环40次，并进行95~65 ℃溶解曲线分析，设置3个生物重复。

2.7 目的基因转录水平检测

方法同1.6节。

2.8 目的基因蛋白定量分析

方法同1.8节。

2.9 数据统计分析

使用GraphPad Prism 8.0软件对试验数据进行统计分析，数据结果使用平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著。

2.10 实验结果

2.10.1 酿酒酵母中人IFNα-2b基因拷贝数分析

如图4（a）所示，通过同源重组将人IFNα-2b基因整合到酿酒酵母第Ⅺ染色体上的AUR基因位点。从图4（b）发现，重组酿酒酵母菌株中有501 bp的DNA片段，而对照组中没有，结果初步表明IFNα-2b基因整合到了酿酒酵母染色体上。进一步Sanger测序证明目的基因序列与IFNα-2b序列一致，表明IFNα-2b基因成功整合。以单拷贝TUB1基因为参照，采用绝对qPCR法测定酿酒酵母中IFNα-2b编码序列的拷贝数，如图4（c）所示，证明IFNα-2b基因以单拷贝的形式存在于酿酒酵母基因组中。

2.10.2 NDR序列长度影响IFNα-2b基因的表达水平

为了考察NDR序列长度的改变对IFNα-2b基因表达水平的影响，分析了NDR序列长度改变前后IFNα-2b基因表达水平的变化。采用qPCR法检测了YBL025W，YBL032W和YBL071W-A转录调控序列中L-NDR和NDR-两种结构以及YAR008W，YAR027W和YAL030W转录调控序列中S-NDR和NDR+两种结构调控下IFNα-2b基因mRNA相对表达水平。使用ELISA试剂盒检测了转录调控序列L-NDR和NDR-序列以及S-NDR和NDR+序列调控下IFNα-2b蛋白质表达水平。如图5（a）所示，在YBL025W，YBL032W和YBL071W-A转录调控序列中，与L-NDR序列相比，在NDR-序列调控下，IFNα-2b基因mRNA的相对表达水平分别降低了3.29倍、1.6倍和4.31倍，配对样本t检验结果显示两者之间的差异显著（P<0.05）。如图5（b）所示，IFNα-2b蛋白质表达水平分别降低了1.99倍、1.65倍和1.53倍，配对样本t检验结果显示两者之间的差异显著（P<0.05）。

在YAR008W、YAR027W和YAL030W转录调控序列中，与S-NDR序列相比，在NDR+序列调控下IFNα-2b基因mRNA相对表达水平和蛋白质表达水平均获得了提高。如图5（c）所示，IFNα-2b基因的mRNA相对表达水平分别提高了约8.24倍、2.19倍和3.79倍，配对样本t检验结果显示两者之间的差异显著。从图5（d）中发现，在YAR008W中IFNα-2b蛋白质表达水平提高了约2.55倍。配对样本t检验结果显示，在YAR027W和YAL030W中，IFNα-2b蛋白质表达水平的差异不显著（P>0.05）。这些结果表明，改变NDR序列长度对外源基因的表达水平有一定的影响。当NDR序列剪短到150 bp以下时，能下调外源基因的表达水平。当NDR序列加长到150 bp时，能上调外源基因的表达水平。

3 结果与讨论

在外源基因表达的研究中，人们通常从基因转录区域一维序列信息的角度来探讨基因调控元件与基因表达水平的关系。本研究基于课题组前期研究给出的酿酒酵母高表达基因的相对同义密码子使用值（RSCU值），将IFNα-2b基因的编码序列进行了密码子优化，结果表明IFNα-2b基因的表达水平显著提高，表明课题组前期研究提出的密码子优化方法有效可行。

然而，仅从一维DNA序列的角度出发，通过优化组合基因序列中的各个调控元件来探讨基因表达效率存在一定的局限性。为了更全面地探索和理解真核生物基因表达调控机制，还需要从核小体的角度进行研究。真核生物染色体由核小体组成^［28］。核小体能降低启动子DNA的可及性，从而阻碍转录因子与调节元件的结合^［29］。研究表明，大多数基因核小体缺乏区域的长度小于150 bp，且在基因表达调控中具有重要作用^［30-32］。与许多真核生物一样，酿酒酵母中基因表达的调控是一个涉及许多因素的复杂过程，包括核小体的结构和定位^［33］。

本课题组前期研究提出了一种基于-1核小体、+1核小体及核小体缺失区域（NDR）序列的外源基因表达调控方法。研究表明，酿酒酵母基因转录起始区域中-1核小体与+1核小体之间的NDR序列长度与基因表达水平存在显著相关性^［25］。基于前期研究结果，以-1核小体、NDR序列和+1核小体作为转录调控序列，构建了IFNα-2b基因表达系统，探讨NDR长度对IFNα-2b基因表达水平的影响。研究发现，当长NDR长度剪短80 bp至小于150 bp时，IFNα-2b的相对mRNA表达量和蛋白质表达量均显著降低。相反，当短NDR长度延长80 bp至大于150 bp时，IFNα-2b的mRNA相对表达水平和蛋白质表达水平均显著增加。这些结果表明，NDR序列的长度是调控外源基因表达的关键因素，增加NDR序列的长度可以提高外源基因的表达水平。相反，剪短NDR序列的长度可以降低外源基因的表达水平。这一现象与NDR长度影响转录因子结合密切相关。较长的NDR促进转录因子有效结合，提升基因表达量；较短的NDR降低结合效率，导致基因表达下降。

一般来说，NDR的长度与转录效率相关。较长的NDR通常与较高的基因表达相关，而较短的NDR往往对应较低的表达水平。Kubik等^［13］的研究也表明，酿酒酵母基因转录调控区NDR序列的长度小于300 bp，并且与其相关的基因多为高表达基因。课题组前期理论研究发现，TSS上游-1核小体位置的改变会导致基因的转录效率发生改变，且NDR序列长度与基因转录效率有正相关关系^［22］，这与Kubik等^［13］提出的观点相似。不同之处在于，我们认为基因转录效率主要与-1核小体的位置和NDR序列的长度有关。NDR序列长时，基因转录效率高，而当NDR序列短时，基因的转录效率低。我们发现，改变NDR序列的长度可以调控外源基因的表达水平。缩短NDR序列会使-1核小体向上游移动，暴露更多DNA以供转录因子（TF）结合，但此过程耗能较高，降低了TF结合效率和基因转录效率。延长NDR序列则扩展了TF结合的空间，减少了-1核小体移动的需求，从而降低能耗并提高转录效率。本研究基于前期理论成果，通过实验验证了±1核小体与NDR序列对外源基因表达的调控作用，为从核小体阵列角度调控基因表达提供了新思路。

本研究初步探讨了酿酒酵母基因转录调控区NDR长度与外源基因表达之间的关系。目前，尚无法确定酿酒酵母基因的NDR结构是否适用于其他物种的基因组，但已有证据表明NDR在整个进化过程中高度保守。因此，未来还需进一步深入研究，将这一设计思路应用于其他基因组的转基因调控。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31860304)