贝特类降血脂药物的合成及降脂活性研究

Synthesis and Lipid-Lowering Activity of Novel Fibrate Lipid-Lowering Drugs

摘要

贝特类降血脂药物具有高活性和作用速度快等特点，基于蒙药材荜茇的有效成分和药理作用对贝特类药物进行结构修饰，以胡椒酸酰氯、胡椒碱、苯甲酰氯及其衍生物为反应底物，设计并合成了4种新型贝特类衍生物，其结构均经¹H NMR、¹³C NMR和HRMS表征。通过噻唑蓝（MTT）方法测定了4种化合物对293细胞的IC₅₀值，并通过脂质体转染方法（Lipofectamine 2000），转染PPARα/γ、RXR和PPRE-luciferase表达质粒至哺乳动物细胞系293细胞中进行活性测试，结果表明，化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的IC₅₀值分别为130、159、530、479 nmol/L。激活PPARα的活性依次为：Ⅱ＞非诺贝特＞Ⅳ＞Ⅰ＞Ⅲ，4种新合成化合物均有生物学活性。本研究为进一步研发药理活性更高、作用更广泛和副作用更低的贝特类降血脂药物提供了参考依据。

Abstract

Fibrates， a class of lipid-lowering drugs， have the characteristics of high activity and fast action.Based on the study of the active ingredients and pharmacological effects of the Mongolian medicinal herb， the structure of fibrate based drugs was modified to synthesize fibrate derivatives containing monomers of the active ingredients of Piper longum.Vanillin， benzoic acid， and their derivatives were used as the substrates to design and synthesize four novel beta derivatives.Their structures were characterized and confirmed by ¹H NMR， ¹³C NMR， and HRMS.The IC₅₀ values of four compounds on 293 cells were determined by MTT assay， and the activity of mammalian cell line 293 cells co-transfected by PPAR α/γ， RXR， PPRE-luciferase expression plasmids was tested by liposome transfection method （Lipofectamine 2000）.The results show that the IC₅₀ values of compounds Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ and Ⅳ respectively are 130， 159， 530 and 479 nmol/L.The activation activity of PPARα is in the order of Ⅱ > fenofibrate > Ⅳ > Ⅰ > Ⅲ.The four newly synthesized compounds have biological activity.The study provides a reference for further research and development of blood lipid lowering drugs such as beta blockers with higher pharmacological activity， wider range of effects， and lower side effects.

Graphical abstract

关键词

荜茇 / 贝特类药物 / 高活性 / 高脂血症

Key words

Piper / fibrate drug / high activity / hyperlipidemia

高脂血症是一种由脂质代谢异常引发的疾病，是动脉粥样硬化的主要诱因之一，最终可能会诱发冠心病、脑中风和肾衰竭等严重疾病^［1］。随着社会发展和膳食结构的变化，高脂血症的患病率和死亡率逐年上升，严重威胁着公众的健康和生活质量^［2］。

降血脂药物主要通过三大代谢途径干预人体血脂水平，即：外源性脂质的吸收，内源性脂质的合成，体内脂质的代谢、转运和排泄^［3-4］。目前，临床使用的降血脂药物主要有他汀类药物、烟酸类药物、胆酸螯合剂和贝特类药物等。其中，贝特类药物亦称芳氧烷酸类药物，具有活性高和作用速度快等特点^［5-6］。它的作用机制是通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα），刺激脂蛋白脂酶基因的表达，增强低密度脂蛋白（Low density lipoprotein）的活性，减少血液中的甘油三酯脂蛋白，降低甘油三酯水平和增加高密度脂蛋白（High density lipoprotein）水平，从而促进胆固醇的逆向转运，使低密度脂蛋白的结构发生由小而密到大而疏的转变。贝特类药物的这一特点适用于治疗我国常见的由膳食结构引起的高脂血症^［7-9］。

贝特类药物是治疗高甘油三酯血症的首选药物，但长期使用会引起肌酶升高、肝肾功能损害、白细胞减少、贫血、血糖升高和转氨酶升高等不良反应^［10-11］。此外，还存在对受体亚型的选择性不高的缺陷^［12-14］。

胡椒科植物荜茇含有胡椒基，它具有保护心脑血管和保肝护肝的药理作用^［15-16］。胡椒基的药理活性对贝特类药物的不良反应（肌毒性与肝毒性）具有抑制作用，并且可以提高贝特类药物的降血脂效果^［17-18］。使用胡椒基对贝特类药物母体进行结构修饰，有望开发出具有良好选择性与高活性的降血脂药物^{［9，19-20］}。

本研究以胡椒酸酰氯、胡椒碱、苯甲酰氯及其衍生物为反应底物，通过Williamsone成醚反应、Schotten-Baumann酰基化反应和Bargellini反应等设计并合成了4种新型贝特类降血脂化合物，如图1所示，利用¹H NMR、¹³C NMR和HRMS对其结构进行表征，并进行了活性测试。

1 实验

1.1 仪器和试剂

仪器：R-1001N型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；98B电热磁力搅拌器（天津市泰斯特仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；紫外灯波长为254 nm和365 nm（巩义市予华仪器有限责任公司）；薄层层析所用的硅胶为GF₂₅₄（青岛海洋化工有限公司）；质谱仪Thermo scientific Q Exactive（美国Thermo公司）；核磁共振仪Varian INOVA-300 MHz；KQ5200DE型数控超声波清洗器。

试剂：胡椒酸酰氯；胡椒碱；对羟基苯乙胺（玛雅试剂，嘉兴思诚化工有限公司）；苯甲酰氯（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；噻唑蓝（MTT）；对甲氧基苯甲酰氯（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氯化亚砜（天津永晟精细化工有限公司）；丙酮、氯仿、四氢呋喃、正己烷、无水乙醇、二氯甲烷和二甲基亚砜（DMSO）等（天津市津东天正精细化学试剂厂），纯度为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 化合物Ⅰ的合成路线及实验方法

化合物Ⅰ的合成路线如图2所示。

1.2.1.1 中间体2的合成

0.375 g（2.73 mmol）对羟基苯乙胺溶于7.5 mL 2 mol/L NaOH溶液，在冰水浴下，滴加0.504 g（2.73 mmol）胡椒酸酰氯（反应原料）溶于10 mL四氢呋喃溶液，持续15 min，有白色烟雾生成，搅拌24 h。旋蒸，抽滤，得到固体。固体干燥后，加入到20% NaOH溶液中，40~50 ℃下搅拌15 min，至溶液澄清。冷却，用稀硫酸酸化有固体析出，抽滤，干燥后得到中间体2。

1.2.1.2 化合物Ⅰ的合成

0.050 g中间体2溶于7.5 mL丙酮中，加入0.15 g（0.003 7 mol）NaOH细粉，搅拌15 min后，缓慢滴入氯仿0.062 5 mL，反应过夜。旋蒸后得到固体，用15 mL水溶解后加15%盐酸调节pH，然后在该水溶液中通入CO₂气体至不再有沉淀产生，离心分离，取液体部分用15%盐酸酸化至pH=2.5~3.5得到粗产品，经过滤、洗涤、干燥后得到化合物Ⅰ。

1.2.2 化合物Ⅱ的合成路线及实验方法

化合物Ⅱ的合成路线如图3所示。将胡椒碱作为反应原料，中间体4和5按文献［21］的方法合成。中间体6的合成方法如下：1.050 g（4.811 mmol）中间体5、0.700 g（5.103 mmol）对羟基苯乙胺和1.400 g（3.681 mmol）2-（7-氮杂苯并三氮唑）-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）溶于20 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF），搅拌过夜，反应液逐渐变浑浊。反应结束后，在反应液中加入60 mL水，呈黄色浑浊液。用氯仿萃取3次，每次80 mL，合并萃取液，旋蒸氯仿约至90 mL，溶液呈橙红色。用5%的NaOH水溶液萃取，至有机相呈无色，合并水相，用稀硫酸酸化至pH=5析出沉淀，过滤得到粗产品，纯化干燥后得到中间体6。化合物Ⅱ按化合物Ⅰ的合成方法合成。

1.2.3 化合物Ⅲ和Ⅳ的合成路线及实验方法

化合物Ⅲ和Ⅳ的合成路线如图4所示。以苯甲酰氯衍生物作为反应原料，中间体8按中间体2的合成方法合成，化合物Ⅲ和Ⅳ按化合物Ⅰ的合成方法合成。

1.3 MTT方法测定化合物IC₅₀值及活性测试

1.3.1 IC₅₀值的测定

通过MTT方法测定4种化合物对293细胞的IC₅₀值。将293细胞传代到10 cm的培养皿中，细胞汇合度达到80%~90%时用胰蛋白酶消化，用细胞计数板计数，将细胞浓度调至1×10⁴个/mL。用移液枪将细胞吹均匀后在96孔板中铺板，每孔加0.1 mL细胞悬液。细胞完全贴壁后，将细胞培养基换为含0.1%牛血清白蛋白的无血清培养基，同时待测药物按照不同浓度梯度给药，继续培养24 h。然后，每孔加入50 μL 1×MTT，37 ℃孵育4 h。吸出上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，置于平板摇床上摇匀。在酶标仪上检测570 nm处的光密度值。将每孔的光密度值减去没有培养细胞的空白对照组的光密度值，各组取平均值，所得到的数据用Graphpad软件计算药物的IC₅₀值。

1.3.2 PPARα/γ活性实验

用脂质体转染方法（Lipofectamine 2000）转染PPARα/γ、RXR和PPRE-luciferase表达质粒至哺乳动物细胞系293细胞中，转染过程严格按照说明书操作。转染的3种质粒物质的量之比为1∶1∶2。293细胞转染24 h后，用胰酶消化，计数细胞后均分成若干份，分别与加入样品的培养基混合，在24孔细胞培养板中继续培养24 h，此步设计阴性对照（DMSO对照）和阳性对照（非诺贝特），每个样品设置3个复孔。加药浓度为之前检测到的每种药物的IC₅₀值。加药24~48 h后，加入荧光素酶反应底物（Luciferase Assay System，Promega公司），37 ℃细胞培养箱孵育10 min，用全波长扫描式多功能读数仪（Thermo Scientific，美国）测量荧光读数。阳性对照组（非诺贝特）测得的荧光强度设为100%，待测样品的报告基因激活活性为其与阳性对照组相比后所得到的比值（倍数关系）^［7］。

2 结果

2.1 贝特类降血脂药物的合成

以胡椒酸酰氯、胡椒碱、苯甲酰氯及其衍生物作为反应原料，设计并合成了4种贝特类降血脂药物，结构表征如下。

中间体2：黄色固体，产率为48.7%。¹H NMR（500 MHz，DMSO-d₆） δ：8.41~8.39（m，1H），7.41（dd，J=8.1，1.8 Hz，1H），7.35（d，J=1.7 Hz，1H），7.12~7.11（m，2H），6.98（d，J=8.1 Hz，1H），6.76~6.74（m，2H），6.09（s，2H），3.42~3.38（m，2H），2.78~2.73（t，J=7.5 Hz，2H）；¹³C NMR（126 MHz，DMSO-d₆） δ：165.5，156.1，148.9，148.4，138.7，129.9，129.8，123.6，120.9，115.6，109.0，106.7，101.9，56.5，34.9，19.0；HRMS（ESI-MS）m/z：［M+Na］⁺，C₁₆H₁₅NO₆理论值为308.089 3，实测值为308.089 2。

化合物Ⅰ：白色固体，产率为50.2%。¹H NMR（500 MHz，DMSO-d₆） δ：8.41~8.39（m，1H），7.41（dd，J=8.1，1.8 Hz，1H），7.35（d，J=1.7 Hz，1H），7.12~7.10（m，2H），6.98（d，J=8.1 Hz，1H），6.76~6.72（m，2H），6.09（s，2H），3.47~3.41（m，2H），2.76~2.73（t，J=7.5 Hz，2H），1.07~1.04（m，6H）；¹³C NMR（100 MHz，DMSO-d₆） δ：175.6，165.7，162.3，154.1，150.0，147.7，133.2，129.8，129.1，122.4，119.1，108.3，107.7，102.1，78.8，56.5，41.5，34.8，25.5，19.0；HRMS（ESI-MS）m/z：［M+Na］⁺，C₂₀H₂₁NO₆理论值为394.126 1，实测值为394.126 1。

中间体6：黄色固体，产率为37.4%。¹H NMR（500 MHz，DMSO-d₆） δ：9.18（s，1H），8.11~8.04（t，J=5.7 Hz，1H），7.26（d，J=1.7 Hz，1H），7.16~7.11（dd，J=15.0，10.4 Hz，1H），7.01~6.98（m，3H），6.92~6.86（m，2H），6.86~6.83（d，J=15.5 Hz，1H），6.68~6.67（m，2H），6.07~6.06（m，1H），6.04（s，2H），3.31~3.27（m，2H），2.64~2.61（t，J=7.4 Hz，2H）；¹³C NMR（126 MHz，DMSO-d₆） δ：164.9，155.5，147.8，147.6，139.0，137.6，130.8，129.4，129.3，125.2，124.5，122.5，114.9，108.3，105.5，101.1，40.6，34.3；HRMS（ESI-MS）m/z：［M+Na］⁺，C₂₀H₁₉NO₄理论值为360.120 6，实测值为360.120 4。

化合物Ⅱ：黄色固体，产率为22.6%。¹H NMR（500 MHz，DMSO-d₆） δ：8.15~8.14（t，J=5.7 Hz，1H），7.29~7.28（d，J=1.7 Hz，1H），7.15~7.12（dd，J=15.0，10.4 Hz，1H），7.05~6.97（m，3H），6.96~6.93（m，2H），6.90~6.86（d，J=15.5 Hz，1H），6.79~6.77（m，2H），6.11~6.09（m，1H），6.08（s，2H），2.74~2.70（m，2H），2.67~2.66（t，J=7.4 Hz，2H），1.52（m，6H）；¹³C NMR（126 MHz，DMSO-d₆） δ：179.8，165.6，156.1，148.4，148.2，139.6，138.2，131.4，130.0，129.9，125.8，125.1，123.1，115.6，108.9，106.1，101.7，90.1，41.2，34.9，26.1；HRMS（ESI-MS）m/z：［M+Na］⁺，C₂₄H₂₅NO₆理论值为446.157 4，实测值为446.157 5。

化合物Ⅲ：白色固体，产率为45.0%。¹H NMR（500 MHz，DMSO-d₆） δ：8.58~8.56（t，1H），7.82~7.81（m，2H），7.53~7.50（m，1H），7.47~7.44（m，2H），7.14~7.12（m，2H），6.77~6.75（m，2H），3.46~3.42（m，2H），2.79~2.76（m，2H），1.49~1.48（s，6H）；¹³C NMR（126 MHz，DMSO-d₆） δ：175.7，166.7，154.1，146.9，135.1，133.1，131.5，129.5，129.8，128.7，127.6，119.1，118.9，78.7，72.2，52.5，41.4，34.7，25.5；HRMS（ESI-MS）m/z：［M+Na］⁺，C₁₉H₂₁NO₄理论值为350.136 3，实测值为350.136 3。

化合物Ⅳ：白色固体，产率为52.0%。¹H NMR（500 MHz，DMSO-d₆） δ：7.81~7.79（d，J=7.0 Hz，2H），7.00~6.97（t，4H），6.69~6.68（d，J=7.0 Hz，2H），3.83（s，3H），3.81~3.80（d，J=6.0 Hz，6H），3.40~3.37（t，2H），2.71~2.68（t，2H）；¹³C NMR（126 MHz，DMSO-d₆） δ：175.5，167.4，166.0，163.4，161.9，154.1，133.2，131.8，129.8，129.4，127.3，123.5，119.1，114.3，113.9，78.7，55.7，41.4，34.8，25.5；HRMS（ESI-MS）m/z：［M+Na］⁺，C₂₀H₂₃NO₅理论值为380.146 8，实测值为380.146 9。

2.2 IC₅₀值的测定

IC₅₀值是评估药物活性的一个重要指标。通过MTT方法测定4种贝特类化合物对293细胞存活率的影响并计算出每种药物的IC₅₀值（V_{\mathrm{I}{\mathrm{C}}_{\mathrm{50}}}），结果如图5所示。同时为了比较药物活性与效果，对贝特类化合物与非诺贝特进行对照，测定其IC₅₀值。研究结果显示，4种贝特类化合物的IC₅₀值分别为：Ⅰ，130 nmol/L；Ⅱ，159 nmol/L；Ⅲ，530 nmol/L；Ⅳ，479 nmol/L。阳性药物（非诺贝特）的IC₅₀值为148 nmol/L。在后续的荧光素酶报告基因实验中的最终给药浓度采用每种化合物的IC₅₀值。

2.3 生物学活性

贝特类药物的药物靶点是PPARα。贝特类药物通过激活PPARα来调节血脂。本研究采用293细胞作为细胞模型，检测4种新合成化合物的生物学活性，结果如图6所示。

4种新型贝特类化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的生物学活性依次为阳性药物（非诺贝特）生物学活性的78.59%、117.68%、41.32%和96.67%。激活PPARα的活性依次为：Ⅱ＞非诺贝特＞Ⅳ＞Ⅰ＞Ⅲ。合成的化合物对293细胞的毒性依次为：Ⅲ＜Ⅳ＜Ⅱ＜非诺贝特＜Ⅰ，其中化合物Ⅲ、Ⅳ和Ⅱ的细胞毒性显著低于非诺贝特（P＜0.05）。为了探索后续细胞荧光素酶实验中4种药物的最佳给药剂量以及新型药物对293细胞的毒性，本研究采用MTT法进行了细胞毒性实验。通过细胞毒性实验和荧光素酶报告基因实验发现，新型化合物Ⅱ较阳性药物（非诺贝特）具有较低的细胞毒性，同时具有显著高的生物学活性，未来有望成为一种新的低毒且活性更高的高脂血症治疗药物。

3 讨论

贝特类药物是目前治疗血脂水平异常的常用药物之一，本文成功利用荜茇活性单体成分对贝特类药物母体进行结构修饰，得到4种新型贝特类降血脂药物。合成酰胺的方法有酰氯法、缩合剂法和直接合成法等，直接合成法对温度要求高，不利于天然产物的合成。而酰氯法可以得到较高的产率，产物的纯度主要由合成酰氯步骤是否会引入杂质决定。在中间体2、6的合成中尝试过多种合成法，例如酰氯法，酰氯法需要将体系温度降至0 ℃附近，以降低活性。此体系有两种选择，一种是常用的有机溶剂，另一种是经典的Schotten-Baumann酰基化反应所用的碱性水溶液。采用碱性水溶液，反应物对羟基苯乙胺溶解比较充分，而且使用无机碱后处理方法更加简单。

中间体2的合成过程中需要特别注意，在对羟基苯乙胺中滴加NaOH溶液时，一定要缓慢滴加，速度过快会产生大量副产物。化合物Ⅰ、Ⅱ的合成一定要注意NaOH溶液的用量，NaOH溶液的用量会直接影响产物的产率。缩合反应是生成贝特酸结构的经典反应，严格要求用到的试剂和操作无水。

贝特类药物是目前用于治疗血脂异常的常用药物，其主要作用靶点是PPARα，通过激活PPARα，贝特类药物能够调节体内脂质代谢，从而改善血脂水平。

4 结语

本研究成功设计并合成了4种贝特类化合物，并采用MTT方法测定了化合物对293细胞的IC₅₀值，使用293细胞作为细胞模型，检测4种化合物的生物学活性，结果表明4种贝特类化合物均具有生物学活性。

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基金资助

教育部留学回国人员科研启动基金项目(syb15eed)

内蒙古自然科学基金项目(2015MS0207)

内蒙古自然科学基金项目(2020 MS08189)

内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJZY23132)

内蒙古医科大学青年培育项目(YKD2022QN001)