MSTN基因影响肌卫星细胞NOTCH1受体和DLL1配体的表达

The MSTN Gene Affects the Expression of NOTCH1 Receptor and DLL1 Ligand in Muscle Satellite Cells

摘要

肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）是肌肉发育的负调控因子，NOTCH1基因同样是肌肉损伤中的调控基因，但两者关系尚不明确。本研究旨在探讨MSTN基因是否影响NOTCH1受体和DLL1配体的表达。采用流式分析、RT-qPCR以及Western blot方法检测发现，稳定敲减MSTN mRNA的肌卫星细胞（Satellite cells，SCs），处于G0/G1期的比例显著大于对照组SCs，且S期细胞比例显著大于对照组，说明MSTN mRNA表达量降低会促进DNA合成和细胞分裂，即促进细胞周期进程；此外，发现敲减组SCs中，NOTCH1受体和DLL1配体的mRNA和蛋白表达量均降低。MSTN基因会影响NOTCH1受体和DLL1配体的表达。

Abstract

Myostatin （MSTN） is a negative regulator of muscle development， while NOTCH1 plays a key role in muscle injury， but their relationship remains unclear.This study aimed to investigate whether MSTN influences the expression of the NOTCH1 receptor and DLL1 ligand.Flow cytometry， RT-qPCR， and Western blot were used to analyze muscle satellite cells （SCs） with stable MSTN knockdown.MSTN knockdown SCs showed a significantly higher proportion of cells in G0/G1 and S phases， indicating enhanced DNA synthesis and cell cycle progression. Furthermore， both mRNA and protein levels of NOTCH1 and DLL1 were decreased in MSTN knockdown SCs.MSTN modulates the expression of NOTCH1 and DLL1， providing a basis for further studies on its regulatory role in muscle development and repair.

Graphical abstract

关键词

肌肉生长抑制素 / 肌肉发育 / NOTCH1受体 / DLL1配体

Key words

myostatin / muscle development / NOTCH1 receptor / DLL1 ligand

肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）属于转化生长因子β（Transforming growth factor β，TGF-β）超家族成员，主要在骨骼肌中表达，在肌肉发育过程中起着负调控作用^［1］。研究表明，敲除或降低MSTN基因能够显著增强骨骼肌的水平^［2］，并且最终导致个体表现出“双肌”表型的特征。这一现象在自然界中普遍存在，例如某些特定品种的牛和羊，由于MSTN基因的突变或功能缺失，它们表现出肌肉发育异常增大的表型^［3］。著名的比利时蓝牛“双肌”现象就是由MSTN基因突变引起的^［4］。

NOTCH信号通路由NOTCH受体、NOTCH配体、γ-分泌酶和DNA结合蛋白组成。哺乳动物细胞中，NOTCH受体包括NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4^［5］，配体包括Jagged1、Jagged2、Delta-like1、Delta-like3和Delta-like4。研究发现，Notch信号不仅在胚胎和出生后发育过程中调控骨骼肌的形成，而且在维持肌肉再生潜力方面发挥重要作用^［6］。Notch信号的激活会抑制成肌细胞分化，并阻碍MyoD介导的成纤维细胞分化^［7］。肌肉损伤增加了NOTCH1的表达，并可能通过DLL1配体诱导激活Notch信号^［8］。DLL1配体的表达在老年小鼠中下降，但激活Notch信号显著恢复了肌肉再生，并且年轻小鼠的血清可以恢复老年成肌细胞中DLL1的表达和增殖^［9］。在维持正常肌卫星细胞（Satellite cells，SCs）的情况下，Notch信号会延迟肌源性分化标志物MyoD和MyoG的表达，并上调Pax3/Pax7的表达，从而促进肌源性细胞从静止状态向活跃状态转化^［8］。在衰老过程中，骨骼肌中的Notch信号减少，导致SCs的增殖能力下降^［10］。这些发现表明Notch信号促进了SCs的增殖，从而促进了肌纤维的生长。本研究探究了通过降低MSTN基因的表达而增加成肌细胞的增殖，是否会影响NOTCH1受体和DLL1配体的表达，旨在为后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 牛成肌细胞

对照组牛SCs和敲减组牛SCs均来自内蒙古大学牛遗传改良与生物育种实验室冻存细胞。

1.2 细胞培养

牛SCs培养：DMEM F12（Gibco，US）、20% FBS（Gibco，US）、10% HS（Solarbio，CN），培养条件为38.5 ℃，5% CO₂，饱和湿度。

1.3 细胞传代

通过镜检待细胞融合到90%，弃掉培养液，PBS洗1次。用2 mL胰酶消化3 min，终止消化。将细胞转移至15 mL离心管，1 500 r/min离心5 min。弃掉上清液，使用培养液将细胞重悬起来，按照1传3的比例将细胞液加到100 mm培养皿中，补加培养液至10 mL，置于培养箱继续培养（38.5 ℃、5% CO₂，饱和湿度）。

1.4 细胞冻存

通过镜检待细胞融合到90%，弃掉培养液，PBS洗1次。用2 mL胰酶消化3 min，终止消化。将细胞转移至15 mL离心管，1 500 r/min离心5 min。弃掉液体，使用冻存液（DMEM∶FBS∶DMSO=7∶2∶1）将细胞重悬起来，将500 μL细胞液转移至冻存管中，-80 ℃冻存24 h，最后在液氮中进行长期保存。

1.5 流式细胞术

使用500 μL PBS轻轻洗涤细胞，250 μL胰蛋白酶消化5 min，并用等体积的培养基转移到1.5 mL离心管中。1 500 g离心5 min，PBS洗涤后再次离心。然后将细胞重悬在1 mL 70%酒精中，冰箱4 ℃固定4 h，离心以去除上清。将500 μL碘化丙啶染液加入到细胞中，混匀后37 ℃避光孵育30 min，使用流式细胞仪进行流式细胞术分析。

1.6 实时荧光定量PCR

qPCR检测采用ViiA 7 Real-Time PCR系统（Applied Biosystems，US）。每个7 μL qPCR反应体系包括3.5 μL SYBR Green Universal Master Mix （Applied Biosystems，US），25 ng基因组DNA，每种引物0.4 μL。热循环参数为95 ℃ 10 min，40个循环95 ℃ 30 s和60 ℃ 30 s，然后72 ℃ 30 s。相对表达量采用2^-ΔΔCt 方法分析。所有实验重复3次以上。

1.7 RT-PCR

PCR反应体系：cDNA 1.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，LATaq酶（TaKaRa，CN）12.5 μL，补充ddH₂O至25 μL。反应程序：95 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次。利用琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物鉴定。

1.8 Western blot

细胞在RIPA缓冲液（Thermo，US）和蛋白酶抑制剂（Beyo-time，CN）中裂解。裂解液在冰上孵育30 min，然后在12 000 g下离心15 min，以去除不溶性成分，并在-20 ℃下保存。通过BCA试剂盒（Thermo，US）和牛血清白蛋白标准品测定蛋白质浓度。样品与上样缓冲液（Solarbio，CN）混合，95 ℃热失活10 min。使用聚丙烯酰胺凝胶（Thermo，US）进行电泳，之后将蛋白质转印到PVDF膜（Solarbio，CN）上。随后使用MSTN抗体（Abcam，US）孵育过夜。二抗孵育1 h（Proteintech，CN），显影后拍照成像。

1.9 数据统计分析

每组实验至少设置3个重复，取平均值。所有统计分析均使用GraphPad Prism软件进行。数据分析应用t检验法检验样品的显著性。

2 结果与分析

2.1 鉴定MSTN基因表达

基于之前的研究，成功构建了连有MSTN-crRNA的LwaCas13a crRNA backbone质粒，并通过质粒转染和流式分选，获得了5株敲减组牛SCs。对获得的牛SCs进行RT-PCR和Western blot，以检测其中MSTN mRNA和蛋白表达量是否降低。结果显示，获得的牛SCs中MSTN mRNA和蛋白表达量均降低（图1）。

2.2 MSTN调控牛SCs细胞周期

SCs在正常状态下处于G0期，维持骨骼肌稳态。当肌纤维受损时，会释放生长因子激活Notch信号通路，促使细胞进入增殖阶段^［8］。为了研究MSTN mRNA表达量降低是否会影响SCs的细胞周期，我们对敲减组SCs和对照组SCs进行流式分析细胞周期。结果显示，敲减组SCs处于G0/G1期的比例显著大于对照组，且S期细胞比例显著大于对照组。这些结果表明MSTN的敲减会促进DNA合成和细胞分裂，即促进细胞周期进程（图2）。

2.3 MSTN影响NOTCH受体与配体的表达

文献［11］指出，NOTCH1基因调控鸡成肌细胞增殖和分化，并且MSTN基因是肌肉发育的负调控因子。基于此，我们推测MSTN基因表达下调的SCs中Notch信号通路发生改变，所以采用RT-qPCR和Western blot方法检测了NOTCH1受体和DLL1配体的表达。结果显示，MSTN基因表达下调的SCs中，NOTCH1受体和DLL1配体的mRNA和蛋白表达水平均上调（图3）。

3 讨论

骨骼肌是哺乳动物中分布最广泛的组织，起源于近轴中胚层体节，形成具有多核结构、收缩功能和特定生理特性的肌纤维^［12］，在运动、新陈代谢和稳态中起着至关重要的作用^［13］。哺乳动物出生后，肌纤维开始增大，这一现象称为肌肉肥大^［14］，在此过程中，肌卫星细胞发挥着重要作用^［15］。肌卫星细胞通常处于静止状态^［16］，在生长因子的刺激下，肌卫星细胞被激活，从原有位置迁移至基膜外，进入细胞周期并表达生肌调节因子。在这种调控机制下，部分成肌细胞逐步退出细胞周期^［17］，并开始激活和表达肌肉特异性基因，从而分化为单核的终末分化肌细胞。脊椎动物的骨骼肌纤维数量通常在出生时已基本确定，随着动物的生长发育，肌纤维的大小和类型会发生显著变化^［18］，这些变化直接影响哺乳动物的肉质品质和体型特征。一直以来，我们课题组致力于MSTN基因编辑，以促进骨骼肌肉的生长发育。

MSTN基因是TGF-β家族的重要成员^［19］，自1997年被发现以来，逐渐成为研究热点^［20］。MSTN主要在骨骼肌组织中表达，并且通过抑制成肌细胞的增殖与分化，从而限制肌肉组织的增长。我们采用CRISPR/Cas13基因编辑技术，将连有MSTN-crRNA的LwaCas13a crRNA backbone质粒转染到牛SCs中，通过流式分选，获得了5株敲减组牛SCs。并且发现，敲减组SCs处于G0/G1期的比例显著小于对照组，且S期细胞比例显著大于对照组。这些结果表明MSTN mRNA表达量降低会促进DNA合成和细胞分裂，即促进细胞周期进程。

Notch信号通路在细胞间通讯、调控细胞分化、增殖和凋亡等方面具有高度保守性^［21］。NOTCH1是一种通过与邻近细胞膜上的跨膜配体相互作用而激活的跨膜受体，其部分丧失功能性突变会造成果蝇翅膀边缘缺口，所以将其命名为NOTCH1^［22］。近年来，人们对NOTCH1基因及其功能进行了广泛的研究，发现肌肉损伤增加了NOTCH1基因的表达，并可能通过DLL1配体诱导激活Notch信号^［8］。凌暄泽^［11］发现miR-34a-5p可以降低NOTCH1基因的相对表达水平，从而使鸡成肌细胞的增殖和分化能力受到明显抑制。基于此，我们探究了降低MSTN基因的表达，是否会影响NOTCH1受体和DLL1配体的表达。结果显示，MSTN基因表达下调的SCs中，NOTCH1受体和DLL1配体的mRNA和蛋白表达水平均上调。因此，本研究发现MSTN基因的表达下调，会使NOTCH1受体和DLL1配体的表达上调。

4 结论

结果显示，我们之前获得的敲减组SCs中MSTN mRNA和蛋白表达量均降低；MSTN mRNA表达量降低会促进DNA合成和细胞分裂，即促进细胞周期进程；MSTN基因表达量降低，促使NOTCH1受体和DLL1配体的mRNA和蛋白表达量均上调。上述结果说明，MSTN基因的表达会影响NOTCH1受体和DLL1配体的表达。

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基金资助

呼和浩特市高校院所协同创新项目(XTCX2023-06)