MSTN突变牛与野生牛的肉质性状差异分析

Analysis of Meat Traits between MSTN-Mutant Cattle and Wild-Type Cattle

摘要

为了探究MSTN突变牛与野生牛屠宰后的肉质性状变化，对野生型和突变型牛在屠宰后早期阶段不同类型肌肉pH、肉色、剪切力和保水性进行测定与分析。在MSTN突变牛中，肉僵直速度快于野生型牛肉。僵直期的突变型牛肉相较于野生型牛肉，肉色没有明显变化，剪切力和蒸煮损失明显提高。MSTN突变可以加速牛肉的成熟同时不影响肉的质量，这对于提升牛肉的产业化水平具有重要意义。

Abstract

This study aimed to investigate post-slaughter changes in meat quality traits between MSTN-mutant cattle and wild-type cattle.Key meat quality parameters， including pH， meat color， shear force， and water-holding capacity， were measured and analyzed in different muscle types during the early postmortem period in both wild-type and MSTN-mutant cattle.Rigor mortis occurred more rapidly in MSTN-mutant cattle than in wild-type cattle. During the rigor mortis phase， MSTN-mutant beef exhibited no significant differences in meat color compared with wild-type beef， whereas shear force and cooking loss were significantly higher.MSTN mutation accelerates postmortem meat maturation while maintaining overall meat quality， suggesting potential advantages for improving efficiency and consistency in industrial beef production.

Graphical abstract

关键词

肌肉生长抑制素 / 牛肉 / 僵直 / 肉质性状

Key words

myostatin / beef / rigor mortis / meat traits

肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN），又称生长分化因子8（growth differentiation factor 8，GDF8），是转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）超家族成员。MSTN主要在骨骼肌中表达，并在肌肉发育中发挥负调节作用^［1］。目前，已经有大量研究报道了MSTN基因突变家畜的制备，Luo等^［2］利用锌指核酸酶技术成功培育MSTN基因敲除牛；Wang等^［3］通过CRISPR/Cas9技术获得MSTN基因敲除猪；Yu等^［4］运用TALEN技术培育出MSTN基因敲除山羊。这些不同的MSTN敲除动物均表现出肌纤维数量增加且肌纤维横截面积增大，体现出“双肌”表型的同时不会影响动物体健康。本实验室通过基因编辑技术和体细胞克隆技术培育出纯种MSTN突变西门塔尔牛，其产肉量较野生型显著提高^［5］。

肉的成熟过程可分为三个阶段：僵直前期、僵直期和嫩化期^［6］。僵直期的肌肉伸展性下降，导致肉质变硬^［7］。牛肉风味和嫩度的变化取决于成熟方式、成熟时间以及其他内在因素，如性别、品种和肌肉类型等^［8］。屠宰后，血液循环停止，有氧代谢暂停，但肌肉仍通过糖酵解途径维持代谢能力^［9］。由于屠宰后机体缺乏有效的消除机制，糖酵解的终产物乳酸和ATP水解产生的氢离子（H⁺）在肌肉中积累，最终导致pH值的下降^［10］。此外，屠宰后肌糖原水平的下降意味着维持肌肉松弛状态的可用能量也减少。这些因素的综合作用导致僵直现象的发生和进一步肉成熟的发展。目前，有研究对我国秦川牛和鲁西牛的背最长肌、腰大肌和半膜肌的肉质特性进行了测量和分析^［11］，并对夷陵牛生长性能、屠宰性能及肉质性状进行分析^［12］。然而，对于纯种MSTN突变西门塔尔牛肉质的相关报道尚未见到。

本研究的目的是探讨MSTN突变牛背最长肌、里脊、半腱肌和腿肌中pH值、肉色、嫩度和保水性的变化，这增加了对于MSTN突变牛肉质性状特性的了解，可为未来MSTN编辑牛肉的产业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与取材

动物试验已获得内蒙古大学动物伦理委员会批准（批准号：IMU-CATTLE-2022-073），并严格按照该委员会的动物实验指南进行。根据文献［13］，采用CRISPR/Cas9与体细胞核移植技术，成功培育出MSTN突变型西门塔尔牛。野生型牛未进行基因编辑，均为纯种西门塔尔牛。

从内蒙古大学草原家畜种质创新与繁育基地选取了6头野生型公牛和6头MSTN突变型公牛，年龄均为2~3岁。野生型牛的体重控制在350±50 kg，突变型牛的体重控制在550±50 kg。屠宰前24 h停止喂食，屠宰过程严格按照GB/T 40469—2021《畜禽屠宰加工设备 牛屠宰成套设备技术条件》进行。放血后迅速采集背最长肌、里脊、半腱肌和腿肌。所有样品分别在4 ℃下储存1、12、24、48、72和120 h。

1.2 实时荧光定量PCR

使用HiPure Total RNA Mini Kit（美吉生物，中国）提取肌肉的总RNA。RNA浓度使用Nano-Drop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）进行测定。总RNA使用HiScript Ⅳ All-in-One Ultra RT SuperMix for qPCR（诺唯赞，中国）进行反转录。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（诺唯赞，中国）进行mRNA的定量。根据对肉成熟过程中内参基因表达稳定性的筛选结果^［14］，TATA盒结合蛋白（TBP）被用作本研究中的内参基因。相对表达量通过公式n=2^-ΔΔCt 计算。引物序列见表1。

1.3 pH值测定

便携式pH计（希玛仪表，中国）提前在缓冲液中进行校准，随后插入样品中使pH计电极与肌肉组织完全接触。当读数稳定后，记录数值。该方法参考了文献［15］的研究方法。所有样本在屠宰后第1、12、24、48、72和120 h进行测量。

1.4 肉色测定

肉色根据文献［16］使用CM-5分光测色计（柯尼卡美能达，日本）测定。对每个样本随机选取3个点进行颜色测定。从仪器直接读取颜色参数：亮度（L*）、红度（a*）和黄度（b*），并取平均值进行统计分析。

1.5 剪切力测定

剪切力的测定方法参照文献［17］的研究方法。从每块牛肉中切取6个直径为1.27 cm的柱状样本，使用质构分析仪（TA-XT2i，Stable Micro Systems，英国）沿垂直肌纤维的方向剪切。每个柱状样品的平均测量值即为最终剪切力值（N）。

1.6 加压损失测定

加压损失按照Wang等^［18］的方法进行测定。取肉样称重记为M₁（g），随后，样品用双层纱布覆盖，并在其上下垫上18层滤纸，使用YYW-2型应变式控制式无侧限压力仪进行测定。压力调整至35 kg，加压5 min后立即称重记为M₂（g）。加压损失率（R_PR，%）的计算公式如下：

R_{\mathrm{P}\mathrm{R}}=\left(M_{\mathrm{1}}-M_{\mathrm{2}}\right)/M_{\mathrm{1}}\times \mathrm{100}。

1.7 蒸煮损失测定

根据文献［19］描述的方法，取质量为M₃（g）的肉样密封于烹饪袋中，将其置于恒温71 ℃的水浴中加热35 min，随后取出冷却至室温。去除表面水分后，称量样品并记录质量为M₄（g）。蒸煮损失率（R_CL，%）的计算公式如下：

R_{\mathrm{C}\mathrm{L}}=\left(M_{\mathrm{3}}-M_{\mathrm{4}}\right)/M_{\mathrm{3}}\times \mathrm{100}。

1.8 数据分析

野生型或MSTN突变型牛各选择6头牛用于生物重复，本研究中各指标均进行了3次独立重复，每次实验均设置3个平行。所有数据和图表均使用GraphPad Prism 9.4.0软件（GraphPad Software，美国）进行处理，采用独立样本t检验进行两组间比较。结果用“平均值±标准差”表示。当P<0.05时，认为差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 MSTN在野生型和突变型牛肌肉中的表达

为了探究MSTN突变牛不同肌肉的肉质性状变化，我们首先对背最长肌、里脊、半腱肌和腿肌4种肌肉的mRNA水平进行检测，结果显示，MSTN突变的背最长肌、里脊、半腱肌和腿肌中MSTN的表达量显著减少（P<0.01，图1），这也证明本实验选取的肌肉是MSTN基因表达减少的肌肉。

2.2 牛肉早期成熟过程中pH值的变化

pH值的变化通常作为肉成熟过程的一个指标，在屠宰后早期阶段最低pH值代表着肉僵直的发生^［20］。我们对四种肌肉进行pH值的测量，结果显示，MSTN突变的肌肉在宰后第12 h达到最低pH值，而野生型肌肉在第48 h达到最低pH值（图2）。这些结果意味着突变MSTN会促进肌肉达到僵直。除此之外，发现在宰后第120 h，突变型和野生型的肌肉pH值没有显著差异（图2），这也表明MSTN突变并不会影响肉最终的pH值。这些结果提示MSTN突变会加快屠宰后早期阶段肉的成熟过程。

2.3 僵直期肉色、嫩度和保水性的变化

肉色是食品的关键属性，对消费者的初始选择和最终评价都至关重要。亮度（L*）、红度（a*）和黄度（b*）是检测肉色的3个指标^［21］。先前对牛肉肉色的研究表明，pH值和肉色之间存在相关性^［22］。我们对不同肌肉肉色进行测定，发现L*仅在MSTN突变的里脊中升高，而在其他肌肉中没有明显变化（图3-A）。此外，a*（图3-B）和b*（图3-C）在不同肌肉中均没有显著变化。这些结果说明尽管MSTN突变导致肌肉pH的变化，但几乎没有影响到肉色。

肉的嫩度取决于动物的多种内在因素（品种、年龄、肌肉类型）和外在因素（屠宰前处理、屠宰条件以及屠宰后处理）的共同作用^［23］。有研究报道，牛肉嫩度与最低pH值相关，达到最低pH值的肉经过适当成熟后可获得令人满意的嫩度^［24］。本研究中发现，僵直期MSTN突变后的不同肌肉剪切力均显著增加（P<0.01，图3-D），这进一步表明MSTN突变加速了牛肉的成熟。

保水性是屠宰后肉成熟过程中发生变化的性状之一，肌肉中水分的流失进而会影响肉的嫩度。加压损失和蒸煮损失是衡量肌肉保水性的重要指标，它们与肌肉保水能力呈负相关^［25］。我们发现除了腿肌的加压损失在MSTN突变后没有明显变化，其余肌肉的加压损失率（P<0.01，图3-E）和所有肌肉的蒸煮损失率（P<0.01，图3-F）均在MSTN突变后升高。腿肌的加压损失没有变化可能是由于其是主要参与运动的肌肉，具有不同的肌纤维结构^［26］，进而导致了不同的保水性。

2.4 MSTN突变牛肉质相关性分析

如图4所示，在背最长肌、里脊、半腱肌和腿肌中，MSTN的表达与pH值呈显著正相关（P<0.01），与剪切力和蒸煮损失呈显著负相关（P<0.01）。除此之外，MSTN的表达与里脊中的L*值呈负相关，在背最长肌、里脊和半腱肌中与加压损失呈负相关。这些结果表明，突变MSTN可以影响西门塔尔牛的肉质相关性状。

3 结论

本研究发现在MSTN突变西门塔尔牛中，肉僵直速度快于野生型牛肉。僵直期的突变型牛肉相较于野生型牛肉，肉色没有明显变化，剪切力和蒸煮损失明显提高。这一发现证明MSTN突变牛肉可以加速肉的成熟，这对于提升牛肉的产业化水平具有重要意义。

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基金资助

内蒙古自治区科技计划项目(2023KJHZ0028)