MSTN基因编辑对肝脏三维基因组的影响

The Impact of MSTN Gene Editing on the Three-Dimensional Genome of the Liver

摘要

肌肉生长抑制素基因（Myostatin，MSTN）是调节肌肉发育的关键基因，其缺失会导致“双肌”表型的出现。本研究旨在探讨MSTN基因编辑对蒙古牛肝脏染色质三维结构的影响，为基因编辑安全性评估提供依据。利用Hi-C技术对MSTN基因编辑蒙古牛与非基因编辑蒙古牛的肝脏组织进行三维基因组测序，通过生物信息学分析比较两组样品在染色质三维结构上的差异。对比分析显示，MSTN基因编辑牛与非基因编辑牛在肝脏的三维基因组结构中无显著差异。MSTN基因编辑未对蒙古牛肝脏的三维基因组结构造成明显影响，这为MSTN基因编辑技术的安全性评估提供了重要的参考依据。

Abstract

Myostatin （MSTN） is a key gene regulating muscle development， and its loss of function is known to result in the double-muscling phenotype.This study aimed to investigate the impact of MSTN gene editing on the three-dimensional （3D） chromatin architecture of the liver in Mongolian cattle， thereby providing evidence for the biosafety assessment of gene-editing technology.Hi-C technology was used to perform 3D genome sequencing on liver tissues from MSTN gene-edited and non-gene-edited Mongolian cattle.Comprehensive bioinformatic analyses were conducted to compare chromatin 3D organization between the two groups.Comparative analysis revealed no significant differences in the 3D genome architecture of the liver between MSTN gene-edited and non-gene-edited cattle.MSTN gene editing did not cause significant alterations to the 3D genome structure of the liver in Mongolian cattle.These findings provide important evidence supporting the genomic structural safety of MSTN gene-editing technology.

Graphical abstract

关键词

肌肉生长抑制素 / 三维基因组 / Hi-C / TAD

Key words

myostatin / 3D genome / Hi-C / TAD

肌肉抑制因子（Myostatin，MSTN）是TGF-β超家族成员，作为骨骼肌生长的天然抑制剂发挥重要作用^［1］，其在许多组织中都有表达，在骨骼肌中尤为突出^［2］。MSTN基因突变可以将肌肉质量增加3倍，使其成为增加牲畜肌肉生长的重要可能性^［3］，该基因突变已在许多动物中被发现^［4-8］。MSTN基因的功能缺失可导致肌肉量增加，这一特性使其成为家畜改良的重要靶点。

然而，传统的基因编辑研究主要关注基因表达和蛋白质功能的变化，忽略了基因编辑对三维基因组结构的潜在影响。近年来，高通量染色体构象捕获技术（High-throughput chromosome conformation capture，Hi-C）的快速发展让我们能够在全基因组范围内研究染色体三维结构，其可以鉴定整个基因组中的所有染色质相互作用^［9］。真核基因组在细胞核内呈现层次化的三维组织结构，从最基本的核小体包装到更高级的拓扑关联结构域（Topologically associating domain，TAD）、A/B区室以及染色体疆域等。在每条染色体上都存在自相互作用并且占据不同的位置区域，这称之为染色体疆域^［10］。研究中通常把基因组分离为A区室和B区室，分别与活性基因表达的常染色质和非活性基因表达的异染色质区域相关^［11］。作为区室结构下游的亚兆碱基层级单元，拓扑关联结构域则在更精细的尺度上组织染色质空间构象，TAD内的相互作用频率会显著高于外部^［12］，TAD的大小约为100 kb至1 Mb。在TAD结构下会存在染色质环（Chromatin Loop，Loop）介导的染色质相互作用，Loop在Hi-C相互作用矩阵中显示出高频的相互作用峰^［13］，这主要是由于环挤压会促进增强子-启动子相互作用。三维基因组结构上的变化会直接影响基因表达调控和细胞分化过程。

基因编辑技术是揭示三维染色质结构在基因调控中的关键作用的重要技术。由基因编辑技术介导的TAD边界删除会导致正常基因组功能的破坏和个体发育异常^［14］。Kabirova等^［15］使用基因编辑删除了Kit 位点的TAD边界，发现TAD边界缺失影响编码酪氨酸激酶受体基因的表达。而对Pitx1基因座的不同片段进行基因编辑，可以控制发育中肢体活性与非活性染色质状态的改变^［16］。这些研究表明基因编辑技术可以解析三维基因组结构变化的影响和不同的调控元件在三维基因组结构的重要意义，为理解基因表达的空间调控模式奠定重要基础。

肝脏作为重要的代谢器官，其基因调控网络复杂，涉及糖脂代谢、解毒、蛋白质合成等多种生物学功能，肝脏也是很多生理过程的一个重要枢纽，包括常量营养素代谢、血容量调节、免疫系统支持、生长信号通路的内分泌控制、脂质和胆固醇稳态以及异生化合物的分解等。功能注释动物基因组（FAANG）项目已对包括牛在内的多种家畜肝脏组织进行了全面的组学分析，包括转录组（RNA-seq）、染色质可及性（ATAC-seq）和染色质构象分析^［17］。研究表明，在肝脏细胞中存在约60 000个mRNA和22 000个长非编码RNA，基因主要富集在免疫和代谢相关通路^［18］。在之前的研究中发现，TAD和表观遗传A/B区室的注释结果与RNA-seq和ATAC-seq数据高度一致，表明三维基因组结构的变化与基因表达调控密切相关^［19］。因此，研究肝脏的三维基因组结构有助于更好地了解MSTN基因编辑对肝脏的影响，深入解析MSTN基因的调控机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物

动物试验已获得内蒙古大学伦理委员会批准（批准号：IMU-CATTLE-2023-065），并严格遵循动物伦理规范进行操作。本研究所用实验组为MSTN基因编辑蒙古牛（MSTN-KO），对照组为非基因编辑蒙古牛（WT）。

1.2 样品采集和处理

屠宰后，取肝脏组织样本，装入冻存管后置入液氮，于-80 ℃保存，送至北京华大基因研究中心有限公司（北京）进行Hi-C测序。

1.3 Hi-C文库构建与测序

Hi-C技术作为解析染色质三维空间构象的核心手段，其文库构建与测序是整个实验流程的关键环节，该过程通过一系列精准的生化处理和分子操作，将细胞内自然状态下染色质的空间邻近关系转化为可通过高通量测序解析的DNA文库，以此捕获全基因组范围内的染色质互作信息。具体的文库构建与测序操作流程如下：

（1）甲醛交联：首先用甲醛固定细胞内自然状态下交联在一起或空间距离非常接近的DNA-蛋白质或蛋白质-蛋白质复合物。

（2）酶切和末端标记：用限制性内切酶消化和分离染色质，末端修复并用生物素标记片段末端。

（3）片段末端连接：利用DNA连接酶将末端连接，形成一个环状的嵌合分子。

（4）纯化和打断：将这些环状分子进行纯化，然后打断成DNA片段。

（5）建立Hi-C文库：使用生物素标记沉淀技术捕获有标记的目标DNA片段，并选择大小合适的DNA片段，建立Hi-C文库。

（6）测序分析：利用高通量测序技术对Hi-C文库进行双末端测序。

1.4 三维基因组结构分析

首先使用fastp软件对原始测序数据进行清洗质控。之后使用Juicer软件处理Hi-C测序数据，定位到牛的参考基因组（Bos_taurus.ARS-UCD1.3）上，接触图是根据M_APQ≥30的读取对生成的，其中M_APQ表示MAPQ的值。

通过生成PC1载体，以100 kb的分辨率定义区室A和B。使用juicer tools调用PC1向量，计算了每个bin中的转录起始位点（Transcription start site，TSS）的数量，作为每个bin的基因密度。使用PC1与每条染色体的基因密度之间的Pearson相关性来确定区室A和B，该相关性由R中的“cor.test”函数计算。如果显示正相关系数，则该染色体中PC1值为正的bin被分配到区室A，而PC1值为负的区间被分配到区室B。相反，如果显示负相关系数，则该染色体中PC1值为正的bin被分配到区室B，而PC1值为负的bin被分配到区室A。使用HiCexplorer调用TAD，分辨率为50 kb。染色质环由hiccup识别，分辨率10 kb，使用hiccupsdiff调用差异环，并使用APA调用差异聚集峰。

1.5 数据处理

组间比较采用Wilcoxon秩和检验，P<0.05表示显著性差异。

2 结果

2.1 数据说明

为了全面探索MSTN-KO与WT肝脏之间染色质结构的重组，分析了MSTN-KO与WT的肝脏的高通量染色质构象捕获图谱，在全局的染色质相互作用图谱中并没有发现MSTN-KO与WT之间的差异（图1-A—B）。通过顺式反式相互作用比（图1-C）、相互作用距离（图1-D）来验证Hi-C数据的接触质量，数据处于合理的范围内，说明得到的数据可以用于后续分析。同时，对数据的最大分辨率进行分析，发现数据能达到的最大分辨率为10 kb（图1-E），之后对MSTN-KO和WT的肝脏在不同的染色质尺度上进行了比较Hi-C分析。

2.2 染色体区室

从更精细的尺度对染色质三维基因组结构进行分析。将基因组分为区室A和区室B（图2-A—B），分辨率为100 kb。将MSTN-KO与WT中的区室状态进行对比，5.68%的基因组区域从A区室转换为B区室，5.69%从B区室转换为A区室，总计11.37%的基因组经历区室重排，其余88.63%的区域保持稳定（图2-C）。

2.3 拓扑关联结构域

TAD分析揭示了MSTN基因编辑对染色体拓扑结构的影响。在分辨率为50 kb时，在MSTN-KO和WT中分别鉴定到了2 660和2 593个TAD（图2-G），发现TAD大部分都小于1 Mb（图2-D—E），对比了两组的TAD大小并没有出现显著性差异（图2-F）。

2.4 染色质相互作用

与TAD相比，loop的分析在更精细的尺度上进行，在组织和发育阶段更具动态性，通常认为与基因表达的调节密切相关。对鉴定到的loop的大小进行了比较，发现WT中环的距离更大（图3-A）。之后对鉴定到的环进行差异分析，在MSTN-KO和WT中分别鉴定到特异性loop为90和30个，对鉴定到的差异环进行了聚集峰分析（图3-B—C）。并将差异环根据锚点进行注释（图3-D），发现启动子区域（特别是≤1 kb的部分）和远端基因间区域占据了数据集的大部分比例，表明这些区域在基因调控和基因组结构中可能具有重要的作用。

3 讨论

本研究对比MSTN基因编辑蒙古牛肝脏三维基因组结构。MSTN表达模式在各个组织中并不相同，在肌肉中，MSTN高表达并且发挥主要的肌肉生长抑制作用^［20］。在肝脏中的MSTN基因表达量相对较低，而肝脏中起的作用主要是代谢调控方面，并不是结构性的调节^［21］。在组织表达模式上的差异解释了为什么MSTN基因编辑对肝脏三维基因组结构影响有限。

三维基因组结构的稳定性是维持细胞身份和功能的重要基础。研究结果中观察到的TAD边界高度保守性以及染色质区室的稳定性，显示了基因组三维结构的内在稳定性机制。TAD作为基因调控的一个基本单位，其边界主要由CTCF结合位点和cohesion复合体来进行维持^［22］。之前的研究表明，TAD边界在进化上是保守的，并且与复杂的遗传特征相关^［23］。本研究中TAD在MSTN-KO与WT中并没有出现显著性差异，符合TAD的高度保守性。之前的研究表明染色质环相互作用可以促进空间结合^［24］，通过拉近启动子和远端调节元件来调节基因的表达水平^［25］。在本研究中，与TAD和A/B区室相比，染色质环在MSTN-KO与WT之间更加动态，但也没有发生广泛的重组。本研究结果显示，MSTN基因编辑并没有导致明显的染色质三维结构的重排，这一观察与之前的研究结果一致，表明基因功能与染色质结构之间的关系更为复杂^［26］，一些基因的功能改变可能通过局部的表观遗传修饰和转录因子结合差异实现，而不需要大规模的染色质重组的变化。

本研究虽然揭示了MSTN基因编辑对三维基因组结构的影响，但存在一些局限性。首先，样本量相对较小，需要更大规模的研究来验证结果的可重复性，同时后面的研究可以结合表观基因组、转录组数据和蛋白质组数据进行多维度的分析，构建MSTN基因编辑对肝脏影响的多组学网络。

4 结论

本研究对Hi-C数据进行对比分析MSTN基因编辑对牛肝脏组织的影响，结果显示MSTN基因编辑并不能引起肝脏三维染色质结构的显著差异。这些三维染色质结构的比较能够为我们解释MSTN基因编辑的分子机制提供新的表观遗传学信息。

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基金资助

内蒙古自治区科技重大专项项目(2021ZD0009)