MSTN基因编辑型与野生型牛瘤胃微生物组的比较研究

Comparative Study of Rumen Microbiome between MSTN Gene-Edited and Wild-Type Cattle

摘要

通过宏基因组学方法比较了野生型与MSTN基因编辑牛瘤胃微生物群落结构及功能的差异。试验按基因型选取野生型组（Control，n=4）和MSTN基因编辑组（MSTN，n=4）共8头体况相近的2岁健康母牛。在相同饲养条件下采集各组瘤胃内容物样品进行宏基因组测序，比较两组瘤胃微生物群落结构及功能组成的差异。MSTN基因编辑并未改变瘤胃微生物中核心菌群的相对丰度，但改变了瘤胃中某些低丰度微生物类群的相对丰度。进一步结合CAZy数据库分析表明，MSTN编辑组中淀粉、果胶和纤维素降解相关酶基因丰度显著上调。MSTN基因编辑可通过重塑牛瘤胃中低丰度微生物菌群结构，增强瘤胃微生物代谢产生琥珀酸的能力与对复杂植物多糖的降解能力，从而改善瘤胃发酵特征。

Abstract

This study aimed to investigate differences in rumen microbial community structure and function between wild-type cattle and MSTN gene-edited cattle using metagenomic sequencing.Eight healthy 2-year-old cows with comparable body condition were selected based on genotype and divided into a wild-type group （Control， n=4） and an MSTN gene-edited group （MSTN， n=4）.Rumen contents were collected from all animals under identical feeding and management conditions and subjected to metagenomic sequencing.Comparative analyses were performed to assess differences in rumen microbial community structure and functional profiles between the two groups.MSTN gene editing did not significantly alter the relative abundance of the core rumen microbiota.However， notable shifts were observed in the relative abundance of several low-abundance microbial taxa.Further annotation based on the CAZy database revealed that genes encoding enzymes involved in starch， pectin， and cellulose degradation were significantly enriched in the MSTN group.MSTN gene editing may enhance rumen fermentation characteristics by reshaping the low-abundance microbial community in the bovine rumen， thereby increasing microbial metabolic potential for succinic acid production and improving the degradation efficiency of complex plant polysaccharides.

Graphical abstract

关键词

肌肉生长抑制素 / 基因编辑 / 瘤胃 / 微生物

Key words

myostatin / gene editing / rumen / microbiota

肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）是哺乳动物肌肉骨骼系统生长发育的关键性调控蛋白之一^［1-2］。由于其在调控骨骼肌生长中的关键性作用，MSTN基因已经成为现今研究家畜育种改良的重要基因之一。目前，科研人员已经利用基因编辑技术成功培育出了MSTN基因编辑的羊^［3］、牛^［4］、猪^［5］等，编辑后显著提高了瘦肉率、降低脂肪率，实现了肉质的改良^［6-7］。从生理功能来看，MSTN不仅是骨骼肌生长发育的重要调控因子，还可通过影响机体代谢功能参与葡萄糖与脂肪的代谢调控^［8-10］。然而，近年来研究发现，MSTN基因对动物的影响并非局限于肌肉生长与代谢调控，还会通过改变肠道微生物群落结构^［11-12］，从而间接影响动物性状。

在家畜动物中，牛、羊等反刍动物的消化系统尤为特殊，其特有的瘤胃中生存着数量极其庞大、类群高度复杂的微生物群落。这些微生物能够高效降解反刍动物自身难以消化的植物纤维，并将其转化为乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸^［13］。这些终产物可直接被宿主吸收利用，是反刍动物获取能量的主要来源。瘤胃微生物的多样性与丰度对于反刍动物的健康至关重要^［14］。瘤胃微生物平衡因外界因素遭到破坏，轻则导致反刍动物采食量下降、消化功能紊乱，重则诱发瘤胃酸中毒、瘤胃臌气等代谢性疾病，甚至会导致反刍动物生长停滞、器官损伤等严重后果，对其生存与生产性能造成严重威胁^［15-16］。

瘤胃微生物的多样性与相对丰度受到多种因素影响，包括年龄、饲料组成、季节变化、饲养环境和饲养策略等^［17-20］。近年来研究表明，动物的遗传因素也是影响瘤胃微生物结构的重要因素之一^［21-22］。例如：在MSTN基因编辑猪中，MSTN基因的敲除改变了肠道微生物群落结构，重塑了其肠道微生物生态系统^［11-12］。有其他研究表明，肌肉的发育状态与肠道微生物群落结构存在关联^［23］。对于反刍动物而言，瘤胃微生物是其实现营养吸收功能的基础，直接决定其生长速率与发育状态^［24-25］。鉴于瘤胃微生物对反刍动物生理功能的重要性，本研究使用宏基因组技术，通过对比野生型牛与MSTN基因编辑牛的瘤胃微生物差异，旨在探究MSTN基因编辑对牛瘤胃微生态系统的影响。

1 材料与方法

1.1 试验设计与分组

本团队利用CRISPR/Cas9基因编辑技术结合体细胞核移植技术，成功培育获得MSTN基因编辑牛。试验按基因型选取野生型组（Control，n=4）和MSTN基因编辑组（MSTN，n=4）共8头体况相近的2岁健康母牛。所有试验动物均来自同一品种，从而确保除目标基因编辑外一致的遗传背景。所有试验动物均在内蒙古大学种质创新与育种基地相同饲养条件下饲养。本研究的动物护理及实验方案已获内蒙古大学动物伦理委员会批准（批准号：IMU-CATTLE-2003-061），并严格遵循动物试验伦理规范进行操作。

为控制试验变量，所有试验牛由同一饲养团队在相同条件下统一管理。试验牛群饲喂由牧场统一提供的全混合日粮（饲料成分见表1，精饲料营养成分见表2），以保证饮食一致。动物可自由饮水和活动，光照周期维持恒定。饲养环境定期进行清洁与消毒，以最大限度降低环境因素对试验结果的潜在干扰。

1.2 样品获取与制备

瘤胃液采样在晨饲前，分别采集对照组与MSTN编辑组牛的瘤胃液。采样周期为15 d，每3 d采集一次，并将同一样本的所有批次样品混合，以消除个体牛只单次生理波动对结果的影响。使用连接真空泵的瘤胃套管经口腔抽取瘤胃液，弃去前15 mL以排除唾液污染。随后，将瘤胃液样本经四层无菌纱布过滤，收集滤液至50 mL无菌离心管中，并立即置于-80 ℃超低温冰箱内冷冻保存，用于后续分析^［26］。

1.3 宏基因组测序

为深入研究牛瘤胃微生物群落的不同，对瘤胃液样本进行宏基因组测序分析。使用磁珠法粪便基因组DNA提取试剂盒（预封装）（AU46111-96，Bioteke），根据厂商提供的操作方案对总样品的DNA进行分离和纯化。然后用Qubit 1X dsDNA HS Assay Kits（Q33230，Invitrogen）检测DNA浓度。取200 ng符合QC要求的DNA到0.6 mL低吸附离心管（#MCT-060-L-C）中，补水到52 μL，根据片段长度要求（200~500 bp），调整打断仪（BioruptorTMPico，品牌：Diagenode）参数，对DNA进行打断，使用TruSeq建库试剂盒磁珠纯化回收打断产物，使用Agilent 2100 Bioanalyzer（High Sensitivity DNA Reagents，5067-4627，Agilent）检测片段化产物大小是否符合要求，不符合片段范围要求的样本要重新取样片段化。使用TruSeq Nano DNA LT Library Preparation Kit（FC-121-4001，Illumina）对片段产物进行基因组文库构建，经过末端修复、接头连接、index PCR扩增及纯化完成基因组文库构建，细节参考试剂盒说明书。使用Qubit 1X dsDNA HS Assay Kits（Q33230，Invitrogen）对文库进行定量，最后，使用Illumina Novaseq 6000（LC Bio Technology CO.，Ltd. Hangzhou，China）按照标准操作对其进行双端测序，测序模式为PE150，试剂盒为NovaSeq 6000 XP 4-Lane Kit v1.5（300 cycles）（20043131，Illumina）。

1.4 数据分析

在数据分析与可视化过程中，使用GraphPad Prism 10.1.2软件绘制图表，使用SPSS 26.0软件对试验数据进行统计分析。结果以均值±标准差（SD）形式呈现。采用独立样本t检验（Independent samples t-test）比较MSTN编辑组与野生型对照组间各微生物类群相对丰度的差异。以P<0.05为判定差异具有统计学显著性的标准。

2 结果与分析

2.1 牛瘤胃微生物概况

在瘤胃微生物群落中，细菌（Bacteria）的相对丰度最高，分别为79.07%和79.06%（图1），这表明细菌是瘤胃微生物群落结构的核心组成部分。除细菌这一核心组成部分外，群落中其他的组成部分包括：病毒（Viruses，2.03% vs 2.43%）、古细菌（Archaea，0.86% vs 0.59%）、真核生物（Eukaryota，0.80% vs 0.58%）。结果表明，野生型牛与MSTN基因编辑牛在瘤胃微生物群落组成上表现出高度一致的组成特征。在瘤胃复杂的微生态系统中，细菌占据着绝对的生态优势，其相对丰度远高于其他类群；而病毒、古细菌及真核生物在瘤胃中的相对丰度较低，仅占群落组成的较小部分。

2.2 MSTN基因编辑对瘤胃微生物的影响

2.2.1 门水平上瘤胃微生物的群落差异

在瘤胃微生物群落的门水平结构中，对照组与MSTN编辑组之间有着高度相似的微生物分类单元，见图2（a）。其中196个（占比99.49%）分类单元为共享，仅MSTN编辑组中出现一个特有的分类单元（Fraseribacteriota）。瘤胃微生物组成方面，细菌中的拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Bacillota）相对丰度未出现显著波动，仍然占据着瘤胃微生物群落中的核心地位，见图2（b）。

然而，MSTN基因编辑显著改变了多个低丰度类群的相对丰度（表3）：细菌域中的假单胞菌门（Pseudomonadota，1.23±0.09% vs 1.80±0.04%，P＜0.05）；真菌域中的毛霉门（Mucoromycota，20.61±0.44% vs 21.42±0.19%，P＜0.05）；古细菌域中热原体菌门（Thermoplasmatota，1.37±0.10% vs 3.08±0.67%，P＜0.05）、深古菌门（Bathyarchaeota，0.16±0.01% vs 0.30±0.01%，P＜0.05）；病毒域中的有尾病毒门（Uroviricota，99.18±0.12% vs 99.42±0.18%，P＜0.05）丰度均显著升高。而古细菌域中广古菌门（Euryarchaeota，98.00±0.85% vs 95.18±0.85%，P＜0.05）；病毒域中的纺锤状病毒门（Phixviricota，0.21±0.05% vs 0.11±0.03%，P＜0.05）和逆转录病毒门（Artverviricota，0.07±0.02% vs 0.03±0.02%，P＜0.05）丰度则发生显著下降。在观察到上述低丰度类群的显著变化后，对瘤胃中相对丰度变化最大五个微生物类群进行分析，结果见图2（c），它们均为目前尚未获得纯培养物的候选门级类群。以上结果表明，MSTN基因编辑后并未干扰瘤胃核心微生物群落结构，而是改变了一些相对低丰度微生物类群的组成与结构。

2.2.2 属水平上瘤胃微生物的群落组成情况

在瘤胃微生物群落的门水平结构分析中，观察到了MSTN基因编辑对瘤胃微生物群落组成与结构的影响趋势，为进一步解析这种影响的具体作用与细微差异，从属水平结构进行分析。结果发现，对照组与MSTN编辑组之间瘤胃微生物种类高度相似，共享了98.97%的分类单元。但两组微生物群落中，MSTN编辑组中出现30个特有的属（0.62%），对照组则出现20个特有属（0.41%），见图3（a）。从整个瘤胃微生物群落组成方面来看，瘤胃中相对丰度最高的5个菌属，都来自细菌域中的拟杆菌门与厚壁菌门，包括普雷沃菌属（Prevotella）、木聚糖杆菌属（Xylanibacter）、拟杆菌属（Bacteroides）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）和梭菌属（Clostridium）。如图3（b）所示，其相对丰度在两组微生物群落中均未出现显著变化，这与门水平结论一致，表明核心菌群结构保持稳定。

与此同时，瘤胃中多个低丰度的微生物类群在属水平呈现显著变化（表4）：真菌域中厌氧鞭菌属（Batrachochytrium，2.98±0.14% vs 2.60±0.23%，P＜0.05）与下梳霉属（Coemansia，1.78±0.08% vs 2.00±0.12%，P＜0.05）的相对丰度发生不同程度变化；古细菌域中甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）属虽仍为最优势类群，但其相对丰度在MSTN编辑组中有所降低（91.43±2.64% vs 86.45±3.50%，P＜0.05），与此同时甲烷球形菌属（Methanosphaera，1.04±0.16% vs 1.70±0.49%，P＜0.05）、甲烷杆菌属（Methanobacterium，0.36±0.08% vs 0.63±0.19%，P＜0.05）均有不同程度升高；病毒域中的类群在MSTN编辑组中普遍下降，如布赫尔杜病毒属（Buhlduvirus，0.31±0.05% vs 0.20±0.37%，P＜0.05）和沃特德病毒属（Wotdevirus，0.21±0.03% vs 0.11±0.05%，P＜0.05）。在瘤胃微生物群落中，丰度变化最大的前五个菌属如图3（c）所示，其中瘤胃杆菌属（Ruminobacter，P＜0.05）、产琥珀酸单胞菌属（Succinimonas，P＜0.05）和产琥珀酸弧菌属（Succinivibrio，P＜0.05）是典型的瘤胃功能菌，它们共同构成了瘤胃中琥珀酸代谢网络的核心部分。这些微生物相对丰度的升高，提示在经过MSTN基因编辑后，一定程度上影响了编辑牛的瘤胃发酵能力。

2.3 CAZy功能分析

CAZy（Carbohydrate-Active enZYmes Database，碳水化合物活性酶数据库）是一个致力于分析碳水化合物活性酶（CAZymes）的基因组、结构和生化信息等的数据库^［27］。为进一步解析这些低丰度微生物类群组成与结构的变化对瘤胃发酵能力的影响，进行CAZy功能分析。基于CAZy功能基因相对丰度分析结果显示，MSTN基因编辑显著改变了瘤胃微生物中碳水化合物活性酶的代谢潜能。与对照组相比，MSTN基因编辑组中多个CAZy家族表达模式发生显著改变：参与淀粉降解的GH13_3和GH13_37、负责果胶裂解的PL10_2和PL22_2、纤维素降解相关的GH5_47以及部分半纤维素降解酶相关的GH43_32和GH102表达均呈现显著上调（图4，P＜0.05）。

3 讨论

本研究通过宏基因组学检测分析了野生型与MSTN基因编辑牛瘤胃微生物的差异，从瘤胃微生物角度解释了MSTN基因编辑对宿主瘤胃微生物结构的潜在影响。

两组牛的瘤胃微生物均以细菌为绝对的优势类群，其相对丰度约占微生物总量的79%，其次为古细菌、病毒和真菌。这一组成结构与以细菌为瘤胃核心菌群的经典认知一致^［28-30］。在门水平上，拟杆菌门和厚壁菌门是牛瘤胃微生物群落中的核心菌门，表明MSTN基因编辑并未对瘤胃微生物群落结构产生剧烈干扰，破坏其瘤胃的发酵能力。但值得注意的是，MSTN编辑组中Candidatus_Diapherotrites的相对丰度剧烈上升，并且出现了特异性菌门Candidatus_Fraseribacteriota。人们对于这两种微生物认知还十分有限，仅了解到两种微生物能够通过化能无机营养方式，利用环境中的H₂、CO或还原硫化合物作为电子供体获取能量^［31-32］。在瘤胃环境中，这两种微生物可能以化能无机营养方式，参与瘤胃代谢过程中的电子传递链，但其在瘤胃中更具体的功能还有待研究。

物种分类水平越低，鉴定的物种越精确，同时物种数目也随之增加。在属水平上，注释到了数百个属，且大部分属的丰度很低。由于这部分属所占的比例极低，很难分辨这些丰度较低的物种。因此选择丰度前20的优势物种进行物种注释，将剩余的物种归为一类，设置为Others，再进行相对丰度的计算。与门水平中分析的结论相似，在属水平上，MSTN基因编辑并未改变其核心菌属的相对丰度，但改变了低丰度微生物类群的相对丰度。在这些低丰度类群中，瘤胃杆菌属、产琥珀酸单胞菌属和产琥珀酸弧菌属的丰度变化最为显著。这三种瘤胃微生物均可利用植物多糖产生琥珀酸，是瘤胃琥珀酸代谢网络中的核心功能菌群^［33］。其相对丰度的升高，提示MSTN基因编辑增强了瘤胃微生物代谢产生琥珀酸的能力。琥珀酸产量增加有助于调节瘤胃挥发性脂肪酸代谢，提升纤维与蛋白质的消化效率，最终可促进反刍动物采食量与饲料转化率的提高^［34］。

碳水化合物活性酶（CAZy）参与瘤胃中多种重要的生物过程，包括碳水化合物代谢、植物生物质合成与降解以及蛋白质糖基化等^［35］。本研究对CAZy功能的分析发现，MSTN编辑组中与淀粉（GH13_3、GH13_37）、果胶（PL10_2、PL22_2）和纤维素（GH5_47）降解相关酶基因的丰度显著上调，表明MSTN基因编辑通过改变低丰度瘤胃微生物结构与组成，增强了微生物群落对复杂植物多糖（如果胶、纤维素和淀粉）的降解能力^［36］。该结果从功能基因层面证实，MSTN编辑所引起的微生物结构变化导致了其代谢功能的适应性调整。

4 结论

综上所述，MSTN基因编辑并未破坏瘤胃核心微生物群落（如拟杆菌门、厚壁菌门等）的结构稳定性，但显著改变了低丰度微生物类群的菌落结构与组成。这些低丰度微生物群落结构的变化中，瘤胃杆菌属、产琥珀酸单胞菌属和产琥珀酸弧菌属等琥珀酸代谢的核心菌群显著上升，增强了瘤胃微生物代谢产生琥珀酸的能力。基于CAZy功能分析发现，MSTN编辑组中淀粉、果胶和纤维素降解相关酶基因丰度显著上调，进一步从功能基因层面证实MSTN基因编辑后增强了瘤胃微生物对复杂植物多糖的分解代谢能力。

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基金资助

新疆维吾尔自治区揭榜挂帅项目(2023A02011-1-6)

内蒙古自治区自然科学基金项目(2023MS03004)

内蒙古自治区科技重大专项项目(2021ZD0009)