转录组学比较分析MSTN突变对肉牛小肠的影响

Comparative Transcriptomic Analysis of the Impact of MSTN Mutation on the Bovine Small Intestine

摘要

肌肉生长抑制素（MSTN）属于TGF-β家族，为骨骼肌生长负调控因子，MSTN缺失可导致肉牛产肉能力提升。本研究系统性比较了MSTN突变肉牛与野生型肉牛十二指肠、空肠、回肠的转录组差异。结果显示：3种小肠组织存在一定差异表达并共享核心基因集，富集于胆汁分泌、类固醇与脂类代谢；十二指肠和空肠的脂质摄取/脂蛋白装配能力增强，回肠的屏障与黏膜免疫重塑能力提升，为后续的育种与营养策略提供分子依据和研究基础。

Abstract

Myostatin （MSTN）， a member of the transforming growth factor-β （TGF-β） family， is a key negative regulator of skeletal muscle growth， and loss of MSTN is associated with enhanced meat production capacity in cattle.We systematically compared transcriptomic differences in the duodenum， jejunum， and ileum between MSTN-mutant and wild-type cattle.The results revealed distinct differentially expressed gene profiles across the three intestinal segments， along with a shared core gene set predominantly enriched in bile secretion， steroid biosynthesis， and lipid metabolism pathways. Notably， genes associated with lipid uptake and lipoprotein assembly were upregulated in the duodenum and jejunum， whereas pathways related to intestinal barrier function and mucosal immune remodeling were enhanced in the ileum.These findings provide a molecular basis and mechanistic insight for optimizing breeding strategies and nutritional interventions in MSTN-edited cattle.

Graphical abstract

关键词

肌肉生长抑制素 / 转录组 / 小肠 / 肉牛育种

Key words

myostatin / transcriptome / small intestine / beef cattle breed

肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）属于TGF-β家族，是骨骼肌生长的负向调控因子^［1-2］。其自然突变或功能缺失通常导致肌纤维数量与直径增加，从而提升瘦肉率与胴体出肉率^［3］，因此MSTN基因在肉牛育种中被视为重要的分子改良靶点^［4-5］。作为肝肠循环与营养吸收的关键通道，小肠在脂肪与胆汁酸处理、黏膜屏障与局部免疫等方面发挥核心作用^［6］。因此，研究MSTN基因功能缺失是否会引发小肠不同解剖段（十二指肠、空肠、回肠）的分子层面改变，具有直接的生物学意义与生产应用价值。

现有关于MSTN的研究多聚焦于肌肉组织及全身代谢，对小肠不同段的转录组差异与基因型和组织交互效应缺乏系统证据，尤其缺少对3种小肠进行并行分析的工作。本研究以MSTN缺失肉牛与野生型肉牛为对象，对十二指肠、空肠与回肠进行转录组测序与系统分析，目标包括：比较MSTN缺失肉牛与野生型肉牛在3段小肠中的差异表达情况，识别基因表达改变的规模、方向与代表性基因，探究与MSTN缺失相关的核心通路。通过上述分析，期望为MSTN定向改良背景下的营养策略优化与分子标志物筛选提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和样本采集

选取饲养于内蒙古大学草原家畜种质创新与繁育基地的健康成年雌性“双肌”鲁西牛^［7］（MT）和成年野生型鲁西牛（WT）各5头。实验动物饲喂制度、年龄尽可能匹配，采样前统一禁食与转运条件以降低短期应激。屠宰实验后，在解剖学定位下分别采集十二指肠、空肠、回肠中段各2 cm²左右组织，使用PBS溶液冲洗表面后剪碎成黄豆粒大小，迅速置于液氮中冷冻，随后装入冻存管中-80 °C保存。每种组织的MT与WT各5个重复。所有动物处置与样本采集经内蒙古大学生命科学学院动物伦理委员会批准（批准号：IMU-CATTLE-2024-071）并遵循相关规范。

1.2 RNA提取及文库构建

总RNA采用氯仿法提取，并进行DNase I处理去除残留基因组DNA。以紫外分光光度法评估纯度（A260/A280、A260/A230），并以生物分析仪评估完整性（RIN值），R_IN≥7.0为建库准入阈值，其中R_IN表示RIN值。mRNA采用Oligo（dT）磁珠富集，进行cDNA合成、末端修复、加A、接头连接与PCR富集，目标插入片段约250~350 bp。文库经荧光定量与实时定量校准后混样上机，于Illumina平台进行双端测序（PE150）。样本随机分配至不同通道以降低批次效应，上机批次与位置在两组间均衡。

1.3 原始数据质控与清洗

下机后的原始序列使用Fastqc软件^［8］（https：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）首先进行质量评估（碱基质量、GC含量、接头污染、N含量等）。读段清洗采用Trim Galore软件（https：//github.com/FelixKrueger/TrimGalore）的统一流程：去接头、去低质量碱基（质量阈值为20）、去除长度不足35 nt的读段，并剔除N比例>5%的读段。清洗后再次评估Q20比例、Q30比例与GC含量指标^［9］。样本排除标准预先定义：总体比对率<90%、RIN低于阈值或读段量显著偏低者予以剔除；据此剔除了样本dou_wt1。

1.4 比对与计数

参考基因组采用Bos taurus ARS-UCD1.2及对应注释GTF^［10］。使用Hisat2软件构建含已知剪接位点的索引后进行比对，启用适合下游转录本组装/计数的对齐报告模式^［11］。比对结果以二进制格式排序并建立索引。使用featureCounts软件对基因层面计数，以片段为单位计数（成对读段视为1个片段），启用以下原则：要求成对比对、排除次级（secondary）与可疑嵌合（chimeric）比对、按文库链特异性设置方向参数（根据文库类型设置为非链特异或正/负链特异，其设置在全项目保持一致）。输出包括每个样本的计数矩阵与已分配比例（Assigned）汇总表，用于评估计数有效性^［12］。

1.5 表达量过滤与归一化

原始计数矩阵在进入差异分析前进行低表达过滤：使用DEseq2包进行矩阵转换，输出CPM矩阵^［13］。基因需在至少一定数量的样本中达到最小表达阈值，采用C_PM>1作为判定依据，其中C_PM为每百万比对计数（Counts per million）。过滤后的基因集合同时作为富集分析的基因背景（Background genes）。样本总体结构与表达分布情况使用ggplot2包的负二项分布框架进行规模因子估计与离散度拟合，按基因型比较MT与WT；并用于可视化的PCA、层次聚类、小提琴图与相关性分析。

1.6 差异表达判定、交并关系与功能富集

使用DEseq2包进行分组织比较：在十二指肠、空肠与回肠内分别建立线性模型，设定基因型为主效应并纳入必要协变量进行对比（MT相对WT）^［13］。主判定阈值设置为P<0.05且|log₂F_C|≥1，其中F_C为差异倍数（Fold change，F_C）。输出每个组织的DEG明细表，并在图中统一标注阈值线（竖线：|log₂F_C|=1，横线：P=0.05）。使用UpSet包，对各组织DEG集合在|log₂F_C|>1且P<0.05条件下，计算Venn与UpSet交并；报告3组织共享集合与各组织特异集合的规模与基因列表^［14］。使用clusterProfiler包以及牛（Bos taurus）注释数据库（org.Bt.eg.db）进行功能富集分析^［15-16］；多重检验统一采用Benjamini-Hochberg校正，以校正后的P值（adj.P.Val）<0.05作为显著性阈值。KEGG^［17］与GO^［18］（MF/CC/BP）分析均以过滤后表达基因作为背景集，在可视化中统一呈现通路的基因比例（Gene ratio）、显著基因数量（Count）与校正后的P值（adj.P.Val）。

2 结果

2.1 样本数据结构与表达分布情况

采用双端RNA-seq获得野生型牛和MSTN缺失牛的3种小肠组织样本高质量测序数据。原始读段数在23 284 081~28 687 454范围内（中位数为26 460 008条reads），经去接头、去低质及去除N比例>5%的读段后，保留22 029 373~27 904 565（中位数24 978 190条reads）高质量reads。修剪后reads的Q20与Q30比例分别为98.79%与95.62%，总体GC含量为50.05%。比对至参考基因组（ARS-UCD1.2）后，总体比对率为95.59%，剔除掉其中比对率低于90%的样本dou_wt1。比对结果中，唯一比对率与多位点比对率分别占23.10%与3.19%。按基因注释计数后，featureCounts的已分配比例为65.18%。上述指标表明测序质量可靠，野生型牛和MSTN突变牛的3种小肠组织的测序质量无明显差异，且满足后续差异表达与通路分析的统计前提。

3种小肠组织（十二指肠、空肠、回肠）样本均显示出高度一致的整体表达分布，小提琴图未见异常长尾或多峰异常，提示建库与测序质量均衡（图1）。主成分分析显示，第一与第二主成分能够清晰区分基因型（MSTN突变vs野生型），且各组内样本聚类紧密，反映出基因型是驱动转录组变异的首要因素，其效应在3种组织中均可复现（图2）。样本间相关性热图进一步表明组内相关性高、跨组差异明确，重复性良好（图3）。该结构性证据为后续差异表达与通路分析提供了可靠的统计前提，也在一定程度上排除了由技术批次或文库规模所致的系统性偏倚。

2.2 3种组织的差异表达分析

MSTN突变后在牛的3种小肠组织中均能引起基因表达水平发生改变。以P<0.05且|log₂F_C|≥1为主判定阈值，十二指肠检测到上调1 128个、下调857个差异基因；空肠检测到上调468个、下调370个；回肠检测到上调1 615个、下调1 532个（图4）。火山图密度与对称性显示，在MSTN突变后，回肠对代谢与屏障相关刺激更为敏感；空肠变化幅度最小，但呈现清晰的方向性聚集。结果表明，MSTN突变在牛的3种小肠组织中均引起了明显变化，但差异基因的数量和变化幅度在不同部位之间存在一定差异。

差异表达基因的热图（图5）显示，在3种小肠组织中，MSTN突变牛与野生型牛在表达模式上区分度较高，同一基因型内样本间的表达相似度较高，说明差异表达信号相对稳定。在十二指肠中，MSTN突变牛与野生型牛的差异基因存在较为一致的上下调方向。如表1所示，TDH、THBS3、DDIT4等基因在MSTN突变牛中的表达水平低于野生型牛，TRPV3、CD274、TNFSF13等基因在MSTN突变牛中相对表达量升高。空肠的差异基因同样在两组之间表现出较为一致的表达变化，如表1所示，ABP1、MTTP、GPD1、RDH16、ATP10B、BCHE等基因在MSTN突变牛中均有明显上调。回肠中，REG3G在MSTN突变牛中的相对表达量显著高于野生型牛，而TFF2、KLF4、SATB2、SLC16A11、SLC37A1等基因在MSTN突变牛中的相对表达量低于野生型牛。这些结果表明，MSTN突变在牛的3种小肠组织中均引起了部分差异表达基因表达水平的改变，不同小肠组织中受影响较大的基因不完全相同。

2.3 3种组织的共同差异分析

为进一步检测3种小肠组织中共同表达的基因，通过合并3种小肠组织中检测到的差异基因，评估3种组织的交并关系。维恩图与UpSet图显示，3种小肠组织中存在120个共同差异基因，同时各段仍保留数量可观的特异集合（图6）。该结果表明，MSTN突变后，3种小肠组织存在一定程度的共同表达改变，也存在一定组织特异性的表达变化。

2.4 GO分析和KEGG富集分析

KEGG分析显示差异基因显著富集于Bile secretion（胆汁分泌）、Steroid hormone biosynthesis（类固醇生物合成）、Cytochrome P450（CYP450家族）、Retinol metabolism（视黄醇代谢）、Ascorbate/aldarate metabolism（抗坏血酸/醛酸代谢）及Pentose/glucuronate interconversions（戊糖/葡糖醛酸互变）等通路（图7-A）。GO分析结果聚焦于细胞膜与膜蛋白复合体、内质网腔、顶端膜等细胞组分，以及有机阴/阳离子、胆汁酸与单羧酸等底物的跨膜转运与胞内转运过程（图7-B）。

根据上述结果，认为在MSTN突变后，小肠上皮对脂溶性分子与胆汁酸的处理能力发生一定改变，这种改变主要集中于内质网相关装配与代谢酶系。根据差异表达与富集分析结果，可以发现上述变化是在MSTN功能缺失后由转运体表达量上调（SLC/ABCB等）、内质网/脂蛋白装配（如MTTP）并最终引起胆汁酸与类固醇/视黄醇等脂溶性代谢相关基因的表达量发生变化。

综合3种小肠组织的差异表达与富集结果，可以看出，十二指肠和空肠中与脂质转运、脂蛋白装配相关的差异基因较为集中，而回肠中与分泌因子、黏膜相关分子及部分转运体相关的差异基因比例更高，一定程度上与3种小肠组织在营养吸收和黏膜防御方面的功能相吻合。由于MSTN突变会引起肌肉量和能量利用模式的改变，本研究观察到的小肠转录水平差异可能反映了MSTN基因突变后肠道脂质和胆汁酸相关通路的变化，为后续结合代谢和功能实验进一步解析MSTN与肠道功能之间的关系提供了线索。

3 讨论

MSTN是骨骼肌发生与生长的关键负调控因子，在胚胎期与出生后阶段均通过TGF-β/SMAD途径抑制肌祖细胞增殖与分化^［1］。功能缺失或活性降低可引发肌纤维数目与直径的增加，表现为显著的“双肌”效应与瘦肉率提升^［19］。在育种实践中，MSTN的天然等位突变与定点编辑策略均被用于提高胴体出肉率、扩大背最长肌面积、增加高价值瘦肉分割比例，并常伴随脂肪沉积下降与饲料营养更偏向肌肉合成的营养再分配，这个特性使MSTN成为改良产肉性能的核心靶点^［5］。总体而言，MSTN突变引起了以肌肉量增加与能量向肌合成为特征的全身代谢背景，本研究从转录组层面分析了MSTN缺失（MT）牛相对于野生型牛（WT）在十二指肠、空肠与回肠的表达改变，旨在识别与营养吸收、上皮稳态与局部免疫相关的差异，并在三者之间建立机制性联系。

十二指肠中，MSTN突变后代表性上调基因包括TRPV3、CD274/PD-L1、TNFSF13，提示上皮感觉与黏膜免疫相关通路的激活趋势^［20］；下调基因如TDH、THBS3、DDIT4，反映代谢与细胞应激/基质环境的调整^［21］。整体上，十二指肠呈现出上皮信号与免疫调节增强、部分代谢与基质相关通路下调的组合。

空肠组织中，MSTN突变导致脂质分解与脂蛋白装配增强最为突出：FABP1、MTTP显著上调，同时RDH16、ATP10B、BCHE、ADTRP等指向脂肪酸结合/跨膜转运、脂蛋白装配与维甲酸代谢的系统性提升^［22-23］。这与空肠在脂质吸收环节的生理功能一致，提示在MSTN突变后空肠对脂质摄取-包装-输出等一系列功能发生上调。

回肠组织中出现抗菌应答上调和上皮分化/黏液相关因子下调的组合：REG3G显著上调，提示抗菌肽应答增强^［24］；同时TFF2、KLF4、SATB2等下调，连同SLC16A11、SLC37A1等转运体基因的下降，指向上皮分化/黏液层组成与单羧酸/糖磷酸转运的调整^［25-26］。该模式与回肠承担胆汁酸重吸收与黏膜免疫整合的生理角色相吻合，提示其在MSTN突变后对屏障与底物转运进行再平衡。

交并分析显示，3种小肠组织存在120个共享DEGs，同时各自保留特异集合，说明共性主轴与分段适配并存。功能富集聚焦于Bile secretion（胆汁分泌）、Steroid hormone biosynthesis（类固醇生物合成）、Drug metabolism-CYP（药物代谢-CYP）、Retinol metabolism（视黄醇代谢）等KEGG通路，以及膜/顶端膜、内质网腔与转运相关GO过程。据此，可将MSTN突变后的小肠变化概括为：转运体表达与内质网装配相关程序上调，带动胆汁酸与脂溶性分子处理能力的重塑。该模式与小肠分工的空间梯度一致，为后续从营养管理与肠屏障维护角度开展MSTN缺失突变的研究提供了明确方向和理论基础。

4 结论

本研究表明，MSTN缺失与肉牛十二指肠、空肠和回肠在转录水平的差异表达变化相关，3种组织均检测到一定数量的差异基因；3种组织中存在120个共同差异基因，同时每种组织中仍保留明显的组织特异差异基因。功能富集结果显示，差异基因主要涉及胆汁分泌、类固醇与脂类代谢、药物代谢-细胞色素P450、视黄醇代谢等通路，并集中于膜相关结构、内质网腔及底物转运过程。这些结果为理解MSTN缺失后肉牛小肠组织转录水平变化提供了证据，并为后续育种与营养管理相关研究提供参考依据。

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基金资助

内蒙古准格尔旗重点研发计划项目(2024YF05)