一种靶向肿瘤干细胞智能纳米给药系统的制备与性能研究

Synthesis and Functional Assessment of a Smart Nanoscale Drug Delivery System for Cancer Stem Cell Targeting

摘要

为解决传统化疗非特异及肿瘤干细胞清除难题，构建了顺铂（Cis）-蒙脱土（MMT）-透明质酸（HA）-壳聚糖（CS）-海藻酸钠（SA）纳米给药系统（CMHCS）。MMT负载顺铂，HA赋予CD44靶向，CS-SA水凝胶包封。XRD/TEM显示MMT剥离均匀。体外释放具有pH敏感性，64 h累积释放在pH 6.5时为pH 7.4的3倍。CMHCS显著抑制干细胞增殖（IC₅₀为44.02 μg/mL），成球抑制提高2.53倍，凋亡率提高1.08倍，侵袭抑制提高2.86倍。CMHCS可实现肿瘤选择性释放及干细胞清除，为克服耐药复发提供新策略。

Abstract

To address the issues of non-specificity in conventional chemotherapy and the difficulty in eliminating cancer stem cells， a cisplatin （Cis）-montmorillonite （MMT）-hyaluronic acid （HA）-chitosan （CS）-sodium alginate （SA） nano-drug delivery system （CMHCS） was constructed. MMT was used to load cisplatin， HA conferred CD44 targeting， and the system was encapsulated with a CS-SA hydrogel.XRD and TEM analyses showed uniform exfoliation of MMT.In vitro release exhibited pH sensitivity， with the cumulative release at pH 6.5 being three times higher than that at pH 7.4 over 64 hours.CMHCS significantly inhibited stem cell proliferation with an IC₅₀ of 44.02 μg/mL， suppressed sphere formation by 2.53-fold， increased the apoptosis rate by 1.08-fold， and reduced cell invasion by 2.86-fold.In summary， CMHCS enables tumor-selective drug release and effective elimination of cancer stem cells， offering a promising strategy to overcome drug resistance and tumor recurrence.

Graphical abstract

关键词

靶向给药 / 肿瘤干细胞 / 智能给药系统 / 纳米载体

Key words

targeted drug delivery / cancer stem cells / intelligent nano-drug delivery system / nanocarrier

胃癌在全球范围内具有高发病率和高死亡率，严重威胁人类健康^［1］。由于早期症状隐匿，多数患者确诊时已处于中晚期，化疗成为其主要治疗手段^［2-5］。然而，传统化疗药物如顺铂，因缺乏选择性，在杀伤快速增殖的肿瘤细胞的同时，也会对骨髓、消化道等正常组织造成严重毒副作用，极大限制了其临床应用，降低了患者生活质量^［6-8］。更为关键的是，化疗难以清除肿瘤内部具有自我更新和多向分化潜能的肿瘤干细胞（Cancer stem cell，CSC）^［9-13］。大量研究证实，CSCs是肿瘤发生、发展、耐药、转移和复发的根源，若不能将其根除，则难以实现肿瘤的根治性治愈^［14-17］。

因此，开发能够精准靶向并高效清除CSCs的新型给药策略具有重要的临床意义。近年来，纳米技术的飞速发展为解决上述难题提供了新思路^［18-21］。其中，基于肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）响应的智能递药系统备受关注。TME具有弱酸性（pH 6.5~6.8）、缺氧等特征，与正常组织（pH 7.4）存在显著差异^［22］。利用这一差异，可设计pH敏感的纳米载体，实现药物在肿瘤部位的特异性释放。同时，针对CSCs表面高表达的特异性标志物，如CD44，引入相应的靶向配体（如透明质酸），可实现药物的主动寻靶与精准递送^［23-25］。

基于此，本研究设计并构建了一种多级智能纳米递药系统CMHCS。该系统以具有高比表面积的蒙脱土作为顺铂的纳米载体，以增强药物的跨膜转运能力；纳米载体表面修饰透明质酸，赋予其主动靶向胃癌干细胞表面CD44受体的功能；并在外层包裹pH敏感的壳聚糖-海藻酸钠水凝胶，实现TME响应的药物控释。本研究通过系列实验系统考察了CMHCS的结构特性、pH响应释药行为、对胃癌干细胞增殖能力和自我更新能力的影响及其体外抗肿瘤活性，旨在为开发更安全、高效的胃癌靶向治疗药物提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 原材料

蒙脱土（MMT，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、透明质酸（HA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、壳聚糖（CS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、海藻酸钠（SA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、顺铂（上海生工）、HGC27胃癌细胞（上海碧云天生物科技有限公司），表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子（Novoprotein），B-27血清替代剂（Gibco）。

1.2 载药纳米复合物的制备

首先，向140 mL去离子水中加入顺铂421 mg，超声振荡30 min。待完全溶解后，再加入硝酸银473 mg，避光搅拌48 h。避光条件下，将反应液以5 000 r/min离心两次，每次30 min，取上清液用0.1 μm过滤器过滤，得到水合顺铂溶液。将反应液置于透析袋（MWCO：100）中，每2 h换水一次，共换3次。最后冷冻干燥，得到顺铂。将顺铂与蒙脱土按质量比1∶1溶于去离子水，室温搅拌过夜，制得顺铂-纳米蒙脱土复合物分散液（Cis-MMT，以顺铂计1 mg/mL）。

随后，将1.0 mL的Cis-MMT分散液缓慢滴入2.0 mL透明质酸溶液中（5 mg/mL），搅拌1 h后，经高速离心（25 000 r/min，30 min）纯化，重新溶解于2.5 mL超纯水中，得Cis-MMT-HA复合物。

最后，将12.5 mg SA与20 mg CS加入上述复合物溶液中，40 ℃搅拌3 h形成均相，滴加5%稀盐酸交联成形，脱气后浸入10% CaCl₂溶液中强化24 h。所得产物经去离子水洗涤、60 ℃干燥48 h，即得顺铂-纳米蒙脱土-透明质酸-壳聚糖-海藻酸钠智能纳米给药系统（CMHCS）。

1.3 智能纳米给药系统结构表征

采用X射线衍射仪（XRD，D/MAX2500HB+/PC，日本理学）分析样品中MMT的层间距变化，扫描范围2°~10°，步长0.02°。采用透射电子显微镜（TEM，JEM-2010，日本电子）观察CMHCS的内部微观结构，加速电压120 kV。

1.4 体外药物释放行为考察

采用动态透析法考察CMHCS的体外释药行为。精密称取CMHCS置于透析袋（MWCO 3500）中，分别浸入pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）和pH 6.5的醋酸盐缓冲液（ABS）中，于37 ℃恒温振荡。在预设时间点取样，并补充等温等体积的新鲜介质。用高效液相色谱法测定释放介质中顺铂的含量，计算累积释放率并绘制释药曲线。

1.5 胃癌干细胞增殖实验

通过无血清悬浮培养富集HGC27细胞系中的胃癌干细胞。取生长状态良好的干细胞球，消化后以5×10⁴个/mL密度接种于96孔板。培养24 h后，分别加入含不同浓度CMHCS（顺铂终浓度：0，3.75，7.50，15.00，30.00，60.00，120.00 μg/mL）的培养液。继续培养48 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液孵育2 h，于450 nm处测定吸光度（OD）值，计算细胞增殖抑制率及半数抑制浓度（IC₅₀）。

1.6 胃癌干细胞成球实验

取1.5节中生长状态良好的干细胞球，消化后重悬于无血清DMEM/F12培养基（含2% B27、20 ng/mL表皮生长因子、10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子）。向超低黏附96孔板每孔中接种2 000个细胞，分为对照组、游离顺铂组（IC₅₀浓度）和CMHCS组（等效顺铂IC₅₀浓度）。37 ℃、5% CO₂培养箱中培养14 d后，在显微镜下计干细胞球的数目。

1.7 胃癌细胞凋亡实验

将对数生长期的HGC27细胞以5×10⁵个/mL密度接种于6孔板，分为对照组、游离顺铂组（IC₅₀浓度）和CMHCS组（等效顺铂IC₅₀浓度）。药物作用48 h后，收集细胞，用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒染色，流式细胞仪（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）检测细胞凋亡率。

1.8 胃癌细胞侵袭实验

在预铺Matrigel基质胶的Transwell小室上室加入200 μL含5×10⁵个/mL对数生长期HGC27细胞的无血清悬液，下室加入600 μL含20%血清的完全培养基。分组与给药同1.6节。培养48 h后取出小室，擦去上室未侵袭细胞，下室面细胞经4%多聚甲醛固定、结晶紫染色后，于倒置显微镜下随机选取5个视野计数穿膜细胞数。

2 结果

2.1 智能纳米给药系统的结构表征

XRD图谱显示，原料MMT在2θ=5.8°处出现特征衍射峰，对应层间距约为1.5 nm。而在CMHCS样品中，该特征峰完全消失，表明MMT的周期性层状结构被破坏，成功剥离为纳米单片（图1）。

TEM观察进一步证实，剥离后的MMT纳米片在CMHCS复合物中呈均匀分布，无团聚现象（图2）。这一结构为顺铂的高效负载和后续递送奠定了基础。

2.2 体外药物释放行为

CMHCS在不同pH条件下的体外释药行为如图3所示。在模拟正常生理环境（pH 7.4）的PBS中，CMHCS释放顺铂非常缓慢，64 h累积释放率仅为13.4%。而在模拟肿瘤微环境（pH 6.5）的ABS中，顺铂的释放速率明显加快，64 h累积释放率达到39.8%，约为中性条件下的3倍。该结果表明，CMHCS具有良好的pH响应控释性能，可在肿瘤弱酸性微环境中实现药物的快速、持续释放。

2.3 癌细胞增殖实验结果

CCK-8实验结果显示（图4），CMHCS对HGC27胃癌干细胞的增殖具有显著的抑制作用，且呈现明确的剂量依赖性。经计算，CMHCS对胃癌干细胞的IC₅₀值为44.02 μg/mL（以顺铂计），表明其能有效杀伤耐药性更强的胃癌干细胞。

2.4 胃癌干细胞成球实验结果

成球实验结果（图5）显示，对照组、顺铂组和CMHCS组所形成干细胞球的数量分别为85.13、16.33和6.47个。与游离顺铂组相比，CMHCS处理组的干细胞球的数量显著降低了2.53倍。这表明CMHCS能够有效抑制胃癌干细胞的自我更新。

2.5 癌细胞凋亡实验结果

流式细胞术检测结果（图6）显示，对照组、顺铂组和CMHCS组的细胞总凋亡率分别为4.60%、8.96%和18.64%。与游离顺铂组相比，CMHCS处理组的细胞凋亡率显著提高了1.08倍。这表明CMHCS能更有效地诱导胃癌细胞，尤其是对凋亡具有抵抗性的肿瘤干细胞发生凋亡。

2.6 癌细胞侵袭实验结果

Transwell侵袭实验结果表明（图7），对照组细胞穿膜数量最多，显示出较强的侵袭能力。顺铂处理后，穿膜细胞数显著减少。而CMHCS处理组的穿膜细胞数进一步减少，仅为顺铂组的35%，说明其对胃癌细胞侵袭能力的抑制效果是游离顺铂的2.86倍。这一优势可能归因于CMHCS对具有高侵袭特性的胃癌干细胞的有效清除。

3 讨论

本研究成功构建了一种兼具“肿瘤微环境响应释药”与“肿瘤干细胞主动靶向”功能的多功能纳米递药系统CMHCS。该系统通过巧妙的材料复合与结构设计，旨在同时应对化疗药物体内分布非特异性和肿瘤干细胞难以清除的两大临床困境。

研究结果显示，CMHCS的设计目标均得以实现。首先，XRD和TEM结果证实，MMT在制备过程中被成功剥离成单层纳米片。这不仅为顺铂提供了巨大的负载空间，更重要的是，纳米级的MMT可以借助纳米尺寸效应（如EPR效应）及细胞内吞作用，高效携带顺铂穿透细胞膜，有望克服肿瘤细胞的多药耐药^［26-31］。其次，pH响应释药实验清晰地证明了CS-SA水凝胶外壳的“智能阀门”功能。在中性生理条件下（pH 7.4），致密的凝胶网络有效限制了内部药物的泄漏，这预示着CMHCS在血液循环中具有良好的稳定性，能最大程度地降低对正常组织的毒副作用。一旦进入肿瘤组织的弱酸性微环境（pH 6.5），CS-SA凝胶中的氨基和羧基质子化，导致氢键破坏、凝胶网络溶胀甚至部分解离，从而开启药物释放的“开关”，实现顺铂在肿瘤部位的选择性富集和可控释放^［32］。这种“按需释药”特性是实现精准治疗的关键。

更为重要的是，CMHCS通过引入HA，获得了精准识别并杀伤胃癌干细胞的能力。大量文献表明，CD44是包括胃癌在内的多种实体瘤干细胞的标志性表面抗原，而HA是其天然配体^［33-35］。本研究中，HA被整合进CMHCS体系。我们的实验结果强有力地证实了HA靶向策略的有效性：与无差别杀伤的游离顺铂不同，CMHCS处理能够显著抑制胃癌干细胞的自我更新能力。这意味着CMHCS不仅能在肿瘤微环境中释放药物，更能进一步将药物“导航”至肿瘤干细胞，实现对这一“种子”细胞的特异性杀伤。这合理解释了为何在凋亡和侵袭实验中，CMHCS的效果远超游离顺铂，因为传统的凋亡和侵袭实验主要反映对普通肿瘤细胞的作用，而肿瘤干细胞正是凋亡抵抗和侵袭转移的主要驱动者^［14-17］。

综上所述，CMHCS通过“MMT纳米载体增效、pH敏感凝胶控释、HA主动靶向”的三位一体协同作用，成功将传统化疗药物顺铂升级为一种能够精准识别并根除胃癌干细胞的智能制剂。本研究不仅为胃癌治疗提供了一种极具潜力的候选新药，更重要的是，其所展示的“靶向识别-屏障突破-精准释药”集成设计理念，为未来开发更高效、更安全的抗肿瘤药物提供了重要的理论依据和实践范式。

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基金资助

内蒙古自治区重点研发和成果转化项目(2022YFHH0095)

内蒙古自治区重点研发和成果转化项目(2023KJHZ0023)