藻蓝蛋白通过调节肠道菌群和代谢物改善NASH小鼠肝损伤及机制研究

Investigating the Protective Effects and Mechanism of Phycocyanin against Liver Injury in NASH Mice via Modulation of Gut Microbiota and Metabolites

摘要

为探究藻蓝蛋白（Phycocyanin，PC）对非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH）的影响及机制，构建肝细胞脂肪堆积模型和NASH小鼠模型并给予PC干预，结合16S rRNA测序和非靶向代谢组学进行综合分析。结果显示，PC干预显著降低脂肪堆积模型IL-1β（P<0.01）及小鼠血清天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶和总胆固醇水平（P<0.05），减轻肝脂肪变性及IL-1β、IL-6水平（P<0.01），抑制有害菌并促进有益菌增殖，并通过影响鞘脂代谢等通路改善代谢物水平，且关键代谢物鞘氨醇、亚油酸与有益菌呈正相关；缬氨酸、溶血磷脂酰胆碱LPC（13：0）与其呈负相关。综上，PC可能通过重塑肠道菌群、影响宿主代谢，改善NASH的病理损伤。

Abstract

To investigate the effects and underlying mechanisms of phycocyanin （PC） on non-alcoholic steatohepatitis （NASH）， a hepatocellular lipid accumulation model and a NASH mouse model were established and treated with PC.Integrated analyses of 16S rRNA sequencing and untargeted metabolomics were performed.The results showed that PC intervention significantly reduced IL-1β levels in the lipid-loaded hepatocyte model （P<0.01） and decreased serum AST， ALT， and total cholesterol （TC） levels in NASH mice （P<0.05）.PC markedly alleviated hepatic steatosis and reduced hepatic IL-1β and IL-6 levels （P<0.01）.Moreover， PC suppressed the abundance of harmful gut bacteria while promoting the proliferation of beneficial microbial taxa.Metabolomic analysis revealed that PC modulated host metabolic profiles， particularly by regulating sphingolipid metabolism.Key metabolites， including sphingosine and linoleic acid， were positively correlated with beneficial bacteria， whereas valine and lysophosphatidylcholine LPC（13：0） showed negative correlations.Collectively， these findings suggest that PC exerts protective effects against NASH by reshaping gut microbiota composition and modulating host metabolic pathways.

Graphical abstract

关键词

藻蓝蛋白 / 非酒精性脂肪性肝炎 / 非靶向代谢组学 / 炎症反应 / 肠道菌群

Key words

phycocyanin / non-alcoholic steatohepatitis / untargeted metabonomics / inflammatory response / intestinal microbiota

非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH）作为非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）发展的关键阶段，可进一步演变为肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌^［1］。其发病机制涉及肝细胞内脂质堆积、炎症级联反应、肠道屏障功能受损和肠道微生态失衡等多个环节^［2］。目前研究表明，肠道菌群失调与NASH的发病机制密切相关。肠道菌群失调会导致肠道屏障功能受损，通透性增加，使细菌及其代谢产物（如脂多糖LPS、短链脂肪酸SCFAs和胆汁酸）进入血液循环^［3］。LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，通过激活Toll样受体4（TLR4）和NLRP3炎症小体，诱导肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素8（IL-8）等炎症因子释放，进而导致肝损伤^［4］。SCFAs的组成和含量变化也会影响肝脏代谢和炎症反应。例如，丁酸等SCFAs具有抗炎作用，能够通过刺激核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）并抑制NF-κB通路，从而减轻炎症反应^［5］。随着人们的生活方式改变和高热量饮食摄入增加，全球代谢性疾病的发病率急剧上升，NASH的发病率也逐年攀升，已成为重大公共卫生挑战^［6］。然而，目前尚缺乏安全有效的针对性治疗药物，临床需求迫切。

藻蓝蛋白（Phycocyanin，PC）是一种从蓝藻、螺旋藻等藻类中提取到的天然色素蛋白，具有独特的结构和多种生物活性，包括抗炎、护肝和抗氧化等作用^［7］。PC具有显著抗炎活性，可通过TLR/NF-κB通路抑制炎症反应^［8］。研究显示，PC可以减轻化学性肝损伤、酒精性肝损伤以及免疫性肝损伤等多种类型的肝脏损伤。在CCL₄诱导的肝损伤模型中，PC处理后能够显著降低血清ALT、AST、尿素和肌酐水平，减轻肝细胞的变性和坏死，提升抗氧化酶活性并改善肝脏组织病理学变化^［9］。PC还可以通过提高谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶活性，减少氧化应激诱导的细胞损伤和凋亡，从而保护肝细胞功能^［10］。鉴于NASH与氧化应激以及炎症反应等密切相关，PC在NASH的防治中展现出潜在的应用价值，已成为当前肝病研究领域的热点之一。然而，PC改善NASH的作用机制还不明确。

本研究旨在通过构建NASH小鼠模型，并利用棕榈酸联合油酸刺激HepG2细胞构建肝细胞脂肪堆积模型，结合16S rRNA测序与非靶向代谢组学分析，深入探究PC调节肠道菌群及其代谢物进而改善NASH的作用，为NASH的临床治疗提供新的候选药物与理论依据。

1 材料

1.1 药品与试剂

藻蓝蛋白，购自内蒙古自治区鄂尔多斯市鄂托克旗螺旋藻产业园康晟藻业有限责任公司（批号：E1820240618）；高脂饲料（60%脂肪供能），购自江苏美迪森生物公司；DMEM培养基、胎牛血清，购自上海VivaCell公司；0.25%胰蛋白酶、青-链霉素双抗，购自美国Gibco公司；CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒，购自安徽Biosharp公司；天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、总胆固醇（Total cholesterol，TC）检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

超高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；T2600紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；天平（Sartorius）；超声仪（深圳市雷德邦电子有限公司）；匀浆机（上海净信科技有限公司）。

1.2 实验动物

本研究采用4~6周龄雄性C57BL/6J小鼠，购自维通利华实验动物技术有限公司，小鼠饲养室的温度控制在22~24 ℃，相对湿度保持在50%~60%，采用12 h光照、12 h黑暗的固定周期。动物实验经内蒙古医科大学伦理委员会批准（批准号：YKD202001015），按照《实验动物护理与使用指南》执行。

1.3 细胞

人肝癌细胞HepG2，购自河南北纳创联生物科技有限公司。

2 方法

2.1 细胞模型及给药

取生长状态良好、对数生长期的HepG2细胞，吸弃原培养基，PBS清洗两次，弃去PBS后加入胰酶消化细胞，37 ℃孵育3 min后弃去胰酶。加入新鲜的10% DMEM完全培养基，移液枪轻轻吹打后，制成细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，用1 mL完全培养基重悬。将HepG2细胞以1×10⁶/孔的密度接种于6孔板，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO₂培养箱中贴壁培养后弃去板中的原培养基，使用棕榈酸和油酸混合药物处理。分为对照组（NC）、模型组（MC）、FFA+50 μg/mL PC组（L-PC）、FFA+100 μg/mL PC组（H-PC）。FFA按照棕榈酸∶油酸=1∶2比例配制。分别加入各浓度药物2 mL。诱导分化48 h，建立肝细胞脂肪堆积模型。

2.2 CCK-8检测PC对HepG2细胞活力的影响

取生长状态良好、对数生长期的HepG2细胞，重悬后接种在96孔细胞培养板中（8×10³细胞/孔），在5% CO₂、37 ℃的培养箱中贴壁培养后，弃去培养基，加入不同浓度PC（50、100、200 μg/mL）继续培养48 h，之后每孔加入10 μL CCK-8检测液继续培养1 h，酶标仪检测每孔450 nm下的吸光度数值，依据细胞活力公式计算细胞活力。

2.3 动物造模、分组及给药

本研究采用4~6周龄雄性C57BL/6J小鼠24只，适应性喂养1周后，随机分为对照组（NC）、模型组（MC）、藻蓝蛋白（200 mg/kg）组（PC），每组8只小鼠。除对照组喂养正常维持饲料外，其余各组小鼠给予含60%脂肪供能的高脂饲料，其具体成分为（按质量分数计）：蛋白质26.2%，脂肪34.9%，碳水化合物26.3%，微量元素12.6%，喂养4周的同时各组均腹腔注射10% CCl₄-橄榄油混合溶液，剂量为1 mL/kg，每周3次，连续4周，建立NASH模型。给药组在造模的同时灌胃0.2 mL PC（200 mg/kg，经纯化后色价为18），每日1次；模型组、对照组给予等体积蒸馏水。

2.4 样本收集

小鼠灌胃4周后，经三溴乙醇麻醉后，眼眶后静脉丛取血，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清，-80 ℃冰箱保存。处死后，称量肝脏重量，取肝脏、结肠及结肠内容物。结肠内容物取出后液氮速冻后于-80 ℃保存，进行16S rRNA测序及非靶向代谢组学测序。其余组织分成两部分，一部分经4%多聚甲醛固定并包埋在石蜡中，制作病理切片；一部分于-80 ℃保存。

2.5 血清生化指标检测

按照试剂盒说明书检测血清中AST、ALT、TC和肝组织中TG的含量。

2.6 RT-qPCR

通过RT-qPCR检测肝脏和肝炎细胞模型中炎症相关指标IL-1β、IL-6以及FASN的mRNA表达水平。利用Trizol法提取小鼠肝脏以及细胞RNA。使用超微紫外分光光度计测定总RNA浓度。取适量RNA进行反转录，总体系20 μL。取1 μL cDNA进行扩增，总体系20 μL，以GAPDH作为内参。读取扩增结果，使用2^-ΔΔCt 法进行mRNA相对表达量的计算。引物序列见表1。

2.7 肝组织病理学检查

取各组小鼠完整大叶肝脏组织，经4%多聚甲醛固定48 h后，梯度脱水，再用二甲苯透明两次后移入56~58 ℃熔融石蜡中浸蜡3次，最后包埋于包埋框内，制成蜡块。将包埋后的蜡块于切片机切成4~5 μm厚的蜡片，在水中进行展片，于烤片机上烤干。对切片进行HE染色，显微镜下观察并拍照保存。

2.8 16S rRNA高通量测序

2.8.1 文库构建和测序

取50 ng基因组DNA，使用带有样本特异性Barcode索引序列的引物，对16S rRNA基因的可变区进行PCR扩增。扩增产物经磁珠纯化后，进行第二轮PCR以添加Illumina平台测序所需的完整接头。使用磁珠对最终扩增产物进行纯化与片段筛选，并对文库进行质控。不同index标记的DNA文库按一定比例混合后，进行PE250双端测序。数据下机后由生物信息分析工程师完成数据分析。对测序结果原始图像数据利用软件bcl2fastq进行图像碱基识别，初步质量分析，得到测序样本的原始数据。使用软件cutadapt对测序原始数据进行质量控制（去除引物及接头序列，截去两端质量值低的碱基，去除含N碱基的序列，根据长度和质量过滤低质量读段），得到后续信息分析用的Clean Data。

2.8.2 数据分析

基于优化后的Clean Data，使用FLASH进行双端序列的拼接，得到原始标签序列。随后使用质量控制软件QIIME 2，通过去噪方法将序列精确地校正为扩增子序列变体，以生成特征表。为了对ASV进行物种分类学注释，使用分类器软件QIIME 2内的feature-classifier与参考数据库进行比对，得到每个ASV从门到属的分类学信息。基于特征表和物种注释结果，统计各个样本在各个分类水平下（门、纲、目、科、属）各物种的丰度信息。

2.9 代谢组学测序

采用约25 mg样本，加入500 μL-40 °C预冷的内标提取液（甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1），加入钢珠后在35 Hz匀浆4 min、冰水浴超声5 min，重复该步骤3次；随后于-40 ℃静置1 h。取300 μL上清至96孔过滤板，将过滤板-收集板组合放入正压装置，缓慢加压至41.4 kPa并持续3 min，取下后取等量上清混合成QC样品。使用Vanquish超高效液相色谱仪，搭配Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）进行分离，A相为含25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L氨水的水相，B相为乙腈，样品盘温度4 ℃，进样体积2 μL；质谱检测采用Orbitrap Exploris120质谱仪，在Xcalibur 4.4软件控制下采集一、二级质谱数据。下机数据处理时，原始数据经ProteoWizard V3.0.24054软件转为mzXML格式，使用R包结合inhouse database进行代谢物鉴定，并开展可视化分析。

2.10 统计学分析

采用GraphPad Prism10.1.2软件进行数据分析与绘图，所有数据以均数±标准差（\overline{x}±s）表示。两组比较使用t检验，多组间比较使用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 PC降低HepG2细胞炎症因子表达

3.1.1 PC对HepG2细胞活力的影响

CCK8实验结果显示，与对照组相比，50、100和200 μg/mL的PC对HepG2的细胞活力无影响（图1）。随后以50 μg/mL和100 μg/mL浓度用于后续实验。

3.1.2 HepG2细胞中炎症因子IL-1β的mRNA表达

RT-qPCR结果显示，与对照组相比，MC组的IL-1β的mRNA表达水平显著增高（P<0.01），PC处理后IL-1β的mRNA表达水平显著降低（图2，P<0.01）。

3.2 PC改善NASH小鼠肝损伤与炎症反应

与对照组相比，模型组小鼠肝脏重量、肝脏指数显著增高；血清ALT、AST和TC水平显著升高；肝脏TG水平显著增高；RT-qPCR结果显示，模型组的IL-1β、IL-6和FASN的表达升高；HE染色结果显示，对照组小鼠肝小叶结构完整，肝细胞呈放射状环绕中央静脉排列，细胞形态规整，模型组小鼠的肝组织结构紊乱，肝细胞呈气球样变，在汇管区和中央静脉周围有大量炎性细胞浸润，部分区域还存在肝细胞脂肪变性的情况（图3-A—L）。以上结果表明，NASH模型建立成功。与模型组相比，PC组的肝脏重量、肝脏指数显著降低（图3-A—B）。血清生化实验结果显示，与模型组相比，PC处理后，显著降低了ALT、AST、TC和TG水平（图3-C—F）。结果表明PC对肝损伤有保护作用。RT-qPCR结果显示，与模型组相比，PC组的IL-1β、IL-6和FASN的水平显著降低（图3-G—I）。HE染色结果显示，经PC处理后，肝脏脂质堆积状况得到改善，脂肪空泡数量减少，没有明显的炎性渗出，肝细胞形态较规整（图3-L）。以上结果表明，PC能够缓解NASH小鼠肝脂肪变性，改善肝损伤与炎症反应。

3.3 PC可以显著调节NASH小鼠肠道菌群改变

通过16S rRNA测序分析，绘制Venn图分析不同样品组之间特有或共有的物种，发现2个组共有528个类群，MC组有277个独有类群，PC组有254个独有类群，表明PC处理对样本中微生物菌群产生了影响，进而改变其原有的微生物群落结构（图4-A）。Anosim分析显示，组间差异显著（P<0.05，R=0.74），基于样本间距离的秩排序结果以箱线图呈现（图4-B），进一步表明两组样本间存在显著差异。此外，MC组的α多样性指数相对较低，PC干预后ACE、chao1指数均较MC组显著上升（P<0.05；图4-C—D），提示PC能够提高NASH小鼠肠道菌群的物种丰富度。

进一步评估了门、科和属水平上细菌相对丰度的变化（图5-A—C）。在门水平上，厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门最常见。厚壁菌门在微生物群落中表现出最高的相对丰度，占63.66%。与MC组相比，厚壁菌门与拟杆菌门的比值（Firmicutes/Bacteroidetes）显著降低。在科水平上，PC组存在于前5个的微生物家族分别为毛螺菌科、丹毒丝菌科、鼠杆菌科、乳酸杆菌科和颤螺菌科。在属水平上，主要由Muribaculaceae、乳酸杆菌属、Ileibacterium和Dubosiella组成。与MC组相比，PC组显著增加了Muribaculaceae、Alistipes和Allobaculum的丰度；显著降低了f_Erysipelotrichaceae_Unclassified的丰度。根据LEfSe分析［L_DA>3，P<0.05，其中L_DA表示LDA分值（LDA score）］，确定了两组间产生显著性差异影响的菌属。厚壁菌门丰度在MC组中显著增加，而PC组Allobaculum、Ileibacterium、Muribaculaceae、Prevotellaceae_UCG_001、Acetatifactor和Alistipe的丰度显著增加（图5-D—E）。

3.4 肠道菌群与NASH相关指标的Spearman分析

选择了相对丰度≥1%的菌属进行Spearman秩相关性分析。如图6-A所示，PC处理后，Acetatifactor、［Eubacterium］_coprostanoligenes_group、Ileibacterium、Muribaculaceae、Allobaculum和NK4A214_group与TC、AST、ALT、FASN、炎症因子和肝指数均呈负相关，Desulfovibrio、Erysipelotrichaceae和Rikenella与ALT、AST和炎症因子呈正相关。与对照组（图6-B）相比，PC组（图6-C）肠道菌属间相互作用更强，且以正相关协同作用为主，具体表现为：［Eubacterium］_coprostanoligenes_group与Ileibacterium、Alistipes、Muribaculum呈正相关，Muribaculaceae与f＿Lachnospiraceae_Unclassified、［Eubacterium］_ventriosum_group、Tuzzerella呈正相关，Alistipes与Ileibacterium、Muribaculum、 f＿Ruminococcaceae_Unclassified呈正相关。

3.5 PC对NASH小鼠粪便代谢的影响

对小鼠肠道内容物进行了非靶向代谢组学分析。如图7-A所示，MC组与PC组的样本点明显分布在不同区域，表明两组样本的代谢物存在显著差异，提示PC处理对样本的代谢谱产生了可区分的影响。

为了进一步明确两组样本间的代谢差异并排除无关变异的干扰，采用了正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA），结果如图7-B所示，MC组与PC组的样本点同样呈现出清晰的分组趋势，进一步验证了两组样本间代谢物的差异性。接下来对OPLS-DA模型进行验证，结果显示OPLS - DA模型具有良好的拟合度和预测能力，能够准确反映两组样本间的代谢差异（图7-C）。

基于上述分析，结合单元变量和多元变量统计分析结果，以VIP大于1且P值小于0.05为标准，共筛选出差异代谢物507个。其中上调的差异代谢物320个，下调的差异代谢物187个（图7-D）。进一步鉴定出69个核心差异代谢物。与MC组相比，PC组的鞘氨醇、亚麻酸、亚油酸、棕榈酰乙醇酰胺水平显著增高，乳清酸、甘油磷酸胆碱和缬氨酸显著降低。

对组间的差异代谢物进行代谢通路富集分析，发现这些代谢物主要涉及鞘脂代谢、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成以及β-丙氨酸代谢通路。表明PC可能通过调节多种代谢通路来改善NASH（图7-E）。

3.6 差异代谢物与NASH相关指标的Spearman分析

对粪便代谢物和NASH相关指标进行了Spearman秩相关性分析。如图8所示，溶血磷脂酰胆碱和甘油磷酸胆碱与AST、ALT以及炎症因子呈正相关；丙酸、Sph（d18：0）与AST和炎症因子呈显著负相关；乳清酸与TC、FASN和肝指数呈显著正相关；黄酮类化合物（3'，5'-Dimethoxy-3，5，7，4'-tetrahydroxyflavone）与其呈显著负相关。

3.7 PC改变肠道菌群和代谢物的综合分析

采用Spearman秩相关性系数分析PC干预后的NASH小鼠肠道菌群和代谢物之间的关系。结果显示，Alistipes、Ileibacterium、Muribaculaceae和Alloprevotella与亚油酸、亚麻酸、γ-亚麻酸、丙酸呈正相关，而与乳清酸、溶血磷脂酰胆碱（Lysophosphatidylcholine，LPC）LPC（13：0）、PC（14：0/14：1（9Z））和PC（18：0/14：0）呈负相关；Eubacterium_coprostanoligenes_group与鞘氨醇、Sph（d18：0）呈正相关（图9）。上述结果表明，PC可以通过调节肠道菌群和相关代谢物来改善NASH。

4 讨论

NASH作为NAFLD的进展阶段，相较于单纯性脂肪肝，其肝脏损伤更为严重，炎症和细胞损伤的存在使病情更容易向肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的方向发展^［11］。PC是一种从蓝藻中提取的天然色素蛋白，具有显著的抗炎活性，能够抑制多种炎症因子的产生和释放。研究表明，PC可有效抑制脂多糖诱导的炎症反应，减少TNF-α和IL-6等炎症因子的分泌^［12］。然而，PC对NASH的影响及其潜在机制尚未明确。

本研究通过构建NASH小鼠模型，使用PC干预，发现PC干预显著降低了NASH小鼠血清中的TC、ALT和AST水平，同时肝脏IL-1β、IL-6和FASN的mRNA表达量显著下调。肝脏组织学染色显示，模型对照组（MC）小鼠肝脏表现出严重的脂肪变性，并伴有大量炎性细胞浸润。PC处理后，可显著减轻肝脂肪变性和小叶炎症。以上结果表明，PC具有保护NASH小鼠肝功能及减轻肝脏病理损伤作用。

目前研究显示，肠道菌群失调与NAFLD、NASH的发病机制和进展密切相关^［13］。与健康人群相比，NASH患者的肠道菌群在多样性和组成上存在显著差异，表现为潜在有益菌相对丰度减少，而有害菌相对丰度增加^［14］。为阐明PC治疗NASH的潜在机制，本研究对小鼠粪便进行了16S rRNA测序分析，结果显示，PC干预能够显著影响小鼠肠道菌群。与MC组相比，PC干预后，厚壁菌门与拟杆菌门的比值显著降低。厚壁菌门与拟杆菌门的比值被认为是反映肠道菌群健康状态的重要指标之一，在许多代谢性疾病，如肥胖、糖尿病以及NASH中，该值往往会发生改变^［15-16］。此外，PC干预后菌群丰富度显著增加，提示PC恢复了NASH小鼠的菌群多样性。Erysipelotrichaceae在NASH中常呈现富集趋势，其丰度与肥胖、高胆固醇血症等正相关，高脂/西式饮食会促进其增殖，且其丰度增加与回肠通透性增加和炎症反应增强有关^［17-19］。这与本研究结果一致，PC干预后其丰度显著降低，且其与炎症因子呈负相关。LEfSe分析进一步鉴定出肠道微生物群组的多个家族。Muribaculaceae因能产短链脂肪酸（SCFAs）以调节肠道屏障，被视为是潜在的下一代益生菌^［20］。研究发现，在肝硬化、NAFLD和NASH患者中，Alistipes丰度下降，Alistipes是产SCFAs细菌，通过SCFAs抑制Th17细胞活化，减少肝脏炎症^［21］。Allobaculum可以促进SCFAs的产生，增强肠道抗氧化能力，改善肠道健康^［22］。在本研究中，Alistipes、Muribaculaceae和Alloprevotella与TC、AST、ALT、炎症因子以及丙酸呈正相关。Prevotellaceae_UCG-001是与肠道炎症指标呈负相关的有益菌^［23］。PC治疗后显著增加了以上细菌的相对丰度。综上所述，PC可能通过重塑肠道菌群——即抑制有害菌并促进有益菌增殖，在NASH治疗中发挥积极作用。

使用非靶向代谢组学分析小鼠粪便代谢物，PCA和OPLS-DA显示，PC干预后，其代谢物发生改变。对两组间的差异代谢物进行了代谢通路富集分析，结果显示，PC可能通过影响鞘脂代谢、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成等代谢通路缓解NASH。现有研究表明，肝脏鞘脂代谢紊乱与代谢功能障碍相关脂肪性肝炎密切相关^［24］。鞘氨醇是具有生物活性的主要鞘脂之一，研究显示，g.Eubacterium_coprostanoligenes_group作为产鞘氨醇菌，可以通过上调鞘氨醇水平，改善血脂^［25-26］。使用PC干预NASH小鼠后，发现鞘氨醇、Sph（d18：0）显著增加，并与Eubacterium_coprostanoligenes_group呈正相关，与上述报道相符。亚油酸是一种必需omega-6多不饱和脂肪酸，其血清共轭亚油酸水平与NAFLD严重程度和肥胖呈负相关，且可通过调控脂代谢预防肝脂蓄积^［27-28］。本研究显示，MC组降低的代谢物以不饱和脂肪酸为主，包括亚油酸和亚麻酸。PC给药后其水平显著增加，且与Muribaculaceae呈显著正相关。支链氨基酸（BCAAs）包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸。NAFLD患者血清BCAAs水平高于健康人群，且BCAAs与高血压、血脂异常等代谢异常相关，其水平受饮食、肠道菌群、脂联素（APN）等调控^［29-30］。本研究结果显示，PC处理后可显著降低缬氨酸，且缬氨酸与Muribaculaceae、Allobaculum呈显著负相关。在NASH发病机制中，脂毒性起着关键作用，而LPC是毒性脂质的一种，在动物模型和人类NASH中其水平升高。LPC能诱导内质网应激，激活JNK下游的凋亡通路（如PUMA），导致肝细胞损伤和死亡；可结合G蛋白偶联受体（GPCRs）G2A、GPR和Toll样受体，激活下游通路，诱导免疫细胞迁移、促炎因子释放及氧化应激，从而加剧NASH的病理损伤^［31-32］。本研究结果显示，PC显著降低了小鼠LPC（13：0）、LysoPC（18：4（6Z，9Z，12Z，15Z））水平，且其与Muribaculaceae、Allobaculum呈显著负相关；与炎症因子呈正相关。乳清酸可快速抑制肝脏VLDL分泌，阻断TAG排出，加剧肝脏脂质积累^［33］。然而，PC可显著降低乳清酸水平，且乳清酸与TC、FASN和肝指数呈显著正相关。综上，上述代谢物的变化很可能与PC改善NASH小鼠肝损伤和血脂异常的作用密切相关。

综上所述，PC可能通过调节肠道菌群结构，靶向特定微生物群，进而影响宿主代谢，改善NASH的病理损伤。本研究还存在不足之处，例如在肠道菌群分析中只分析到属水平，未来将进一步完善菌群分类层级，结合代谢产物研究菌群功能，并通过扩大样本量和开展功能实验加以验证。

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基金资助

内蒙古自治区自然科学基金面上项目(2025MS08075)

内蒙古自治区第“十三批”草原英才创新团队滚动支持

内蒙古“兴蒙工程”青年拔尖人才项目

内蒙古医科大学2023年校级重点科研课题(YKD2023ZD003)

大学生创新创业训练计划资助项目(101322025134)