喀斯特洞穴细菌群落的生境特异性及其潜在功能：以广西桂林盘龙洞为例

Niche Specificity and Potential Functions of Microbial Communities in Karst Caves as Exampled by Panlong Cave in Guilin City, Guangxi

摘要

开展岩溶洞穴不同生境微生物与环境因子间的研究，对阐明深部生物圈微生物的多样性、潜在功能及环境驱动机制具有重要意义.以广西桂林盘龙洞为例，通过对细菌16S rRNA高通量测序系统研究了洞穴7种小生境细菌群落的空间分布特征及其与环境因子之间的关系.研究发现温度是驱动盘龙洞细菌群落组成的重要因素，微生物群落组成及潜在生态功能均具有生境特异性，不同生境具有独有的细菌指示类群.滴水、干燥石笋表面生物膜、湿润石笋表面生物膜3个生境与洞穴氮循环密切相关，风化结皮、沉积物、岩壁3个生境与洞穴微生物固定二氧化碳关系紧密.此外，洞穴细菌通过密切的代谢交换形成协作的正相关关系，暗示着微生物在洞穴这一极端环境中的生存策略.

关键词

喀斯特洞穴 / 地下生物圈 / 碳固定 / 氮循环 / 共现网络 / 地质微生物

Key words

karst cave / subsurface biosphere / carbon fixation / nitrogen cycle / co-occurrence network / geomicrobiology

0 引言

喀斯特（Karst）地貌是具有溶蚀能力的水对可溶性岩石进行化学溶蚀、机械侵蚀和垮塌等过程综合作用形成的一种特殊地貌（Kranjc，2011）.喀斯特洞穴作为喀斯特地貌特有的组成部分之一，具有长期黑暗、空气流动性低、高湿度、营养物质贫乏、与外界环境相对隔离等特征，因此被认为是一种极端的陆地生态系统（Barton et al.，2014）.尽管如此，洞穴内依然蕴含着丰富的微生物群落，洞穴每克岩石中微生物的平均数量可达10⁶个（Mozafari et al.，2020）.此外，由于洞穴多分布于偏远地区、较难进入，受人类活动的干扰较小，因此被认为是研究地下生物圈的天然实验室.我国喀斯特面积约3.44×10⁶ km²，拥有世界上面积最大的碳酸盐岩区，是全世界洞穴资源最为丰富的国家（Zeng et al.，2019），因此深入了解洞穴中微生物的多样性、分布特征及其潜在地球化学作用，揭示微生物与环境的相互作用机制对推动我国深地计划的开展和实施具有重要的参考价值.

近年来，人们对微生物在洞穴不同生境中的分布特征及环境驱动机制的研究逐渐深入.研究人员陆续对洞穴岩壁（Gulecal-Pektas，2016）、滴水（Yun et al.，2018）等小生境中的微生物群落组成进行了研究.不同洞穴中微生物群落的组成以变形菌门（23.04%~55.29%）和放线菌门（20.25%~47.88%）为主，但相对丰度在不同洞穴中差异较大（Zhu et al.，2019）.由于洞穴内部小生境的多样性以及水文条件的变化，不同洞穴中微生物多样性及其对环境条件的响应等可能存在差异.如和尚洞中的微生物群落分布主要受pH、总有机碳和钾离子浓度的影响（Yun et al.，2016），而针对和尚洞洞穴滴水的长期监测结果表明，温度的升高会使洞穴内微生物的多样性增加（Yun et al.，2016）.化能自养型岩溶生态系统中硫化物的含量显著影响微生物的群落组成（Porter et al.，2009），而喀斯特天坑生态系统中的微生物群落分布则主要与土壤的温度、湿度、pH以及坡度有关（Pu et al.，2019）.对意大利西西里岛某洞穴的研究发现，地表径流会显著地改变洞穴微生物群落的组成及结构（Davis et al.，2020）.此外，洞穴微生物的群落变化可能受到如风化过程等地质作用的影响（Jones et al.，2008）.但由于洞穴本身发育的地质条件、水文条件（程顺波等，2021）、洞内温度、二氧化碳浓度等因素在不同洞穴中差异显著（Veress，2020），因此，查明不同洞穴中环境因子对洞穴微生物群落的影响能帮助我们更加深刻地揭示洞穴微生物群落对环境因子的差异响应.

微生物在洞穴的形成和元素循环中起着重要的作用，微生物可以通过促进碳酸盐矿物的生物风化或加速碳酸钙的生成来促进喀斯特地貌的形成（Lian et al.，2017）.洞穴古菌和细菌活跃参与洞穴的氨氧化（Tetu et al.，2013）；洞穴微生物大气甲烷氧化菌（USC类群）还能够氧化大气中痕量CH₄（Zhao et al.，2018；Cheng et al.，2021a），证明喀斯特洞穴可能是一个潜在的大气甲烷汇.对贵州喀斯特洞穴细菌的分离培养及宏基因组研究发现，细菌广泛参与洞穴中的碳、氮、硫元素循环 （Zhu et al.，2021）；通过宏基因组的分析，发现洞穴微生物中可能具有潜在的新型碳、氮元素循环途径以适应贫营养的地下环境（Ortiz et al.，2014）.尽管如此，目前人们对于洞穴微生物生态功能的了解依然十分薄弱.

深入开展洞穴生态系统中微生物群落的组成、分布特征，查明微生物群落间及环境因子间的关联性，揭示微生物群落潜在的生态功能，是深入认识洞穴地下生物圈的关键.因此，本研究选取广西桂林市盘龙洞为研究对象，通过对盘龙洞7种不同生境的系统性采样及分析，全面评估喀斯特洞穴生态系统细菌群落的空间分布特征及其与环境因子之间的关系，为深入了解环境变化对喀斯特洞穴微生物生态系统的潜在影响提供了具体案例.

1 材料和方法

1.1　样品采集

盘龙洞（24°57′39.2″N，110°21′17.4″E）位于广西桂林市南部38 km的报安村的岩溶峰丛洼地中，是一个典型的亚热带温润地区岩溶峰丛洼地，母岩为上泥盆统融县组（D₃r）灰岩.灰岩质纯，局部有页岩夹层，上覆岩层厚度为60~150 m.洞口标高200 m，实测洞长251 m，洞高6~15 m，南端因淤塞仅0.2~2.0 m，洞宽11~23 m.于2019年1月份对盘龙洞内的沉积物（sediment，S）、岩壁（wall，W）、风化结皮（weathered crust，WC）、上覆土壤（overlying soil，OS）、湿石笋表面生物膜（biofilm on the surface of wet stalagmite，WS）、干石笋表面生物膜（biofilm on the surface of dry stalagmite，DS）、滴水（dripping water，DW）7种生境进行了系统采样，每个样本采集3个生物学重复（图1）.采样从洞穴入口处到洞穴最深处均匀分布，1至10号点位均采集岩壁和沉积物样品，7号和10号点处取风化结皮样品，7号、8号、9号点采集湿石笋表面生物膜样品，7号、8号、10号点采集干石笋表面生物膜样品，上覆土壤样品取于洞顶.利用1 L气袋（MBT41，Dalian Hede Technologies Corporation，China）采集空气样本，同时利用电子温度计（Vario MACRO cube，Elementar，Germany）原位测量洞穴内部温度.采样过程中，沉积物、岩壁和土壤样本采用五点取样法，混匀后用50 mL无菌康宁管封装，迅速置于冷藏箱中保温并送回实验室保存于-80 ℃冰箱，用于后续DNA的提取.采集石笋表面样品时，使用无菌刷子和无菌去离子水对石笋表面进行冲刷，冲刷得到的水样置于1 L无菌聚乙烯塑料瓶中，运回实验室后和滴水样品进行同样的处理.用无菌漏斗和10 L无菌塑料桶收集滴水，分装部分滴水至250 mL无菌玻璃瓶中，置于4 ℃冰箱保存样品，酸化后用于后续测试.滴水的理化参数如温度、溶解氧、氧化还原电位、电导率等在原位进行测定.滴水样本在野外进行抽滤，将微生物细胞收集在0.22 μm滤膜（0.22 µm，47 mm；Supor-200，Pall Corporation，USA）上，随后将富集有微生物细胞滤膜装入50 mL无菌离心管中，并保存于-80 ℃冰箱，用于后续DNA的提取.

1.2　DNA提取及测序

将上覆土壤、岩壁、沉积物及风化结皮样品从-80 ℃冰箱里取出一部分，经过真空冷冻干燥（ALPHA 1-2 LD，Christ，Germany）后研磨成粉末，利用PowerSoil^® DNA 提取试剂盒（QIAGEN，USA）和PowerWater^® DNA提取试剂盒（QIAGEN，USA）分别提取固体样品的DNA和保存在滤膜上的滴水样品的总DNA.随后利用微量核酸蛋白检测仪（Nanodrop 2000，Thermo Fisher，USA）检测DNA浓度及质量.将DNA浓度大于10 ng/L，OD260/280值处于1.8~2.0的样品，利用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3）/806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物对细菌16S rRNA的V3-V4区进行PCR扩增（Claesson et al.，2009），所得PCR产物进行扩增子高通量测序（上海派森诺生物有限公司Illumina MiSeq PE250平台）.所有原始测序数据均上传至National Omics Data Encyclopedia（NODE，https://www.biosino.org/node/），项目号为OER094505.

1.3　理化参数测定

利用便携式多参数水质分析仪（HQ30D，HACH，Loveland，USA）对滴水样品的部分理化参数进行现场测定.将冷冻干燥后的固体样品研磨过200目筛后，取6 g加入30 mL去离子水，在振荡器上振荡5 min后使用离心机中以6 800 ×g 的转速离心10 min，用0.22 µm的滤膜过滤上清液，取出部分过滤后的上清液，测定样品的pH（便携式多参数水质分析仪）.另一部分上清液和已过膜的滴水样品一起进行阴离子（NO₃ ^-、SO₄ ^2-等）（离子色谱ICS-600，Thermo，USA）和阳离子（K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺等）的测定（电感耦合等离子体-发射光谱ICP-OES iCAP 7600+，Thermo，USA）.固体样品需用盐酸进行酸化处理去除无机碳，所得酸化产物中的总氮（TN）及总有机碳（TOC）使用元素分析仪（Vario TOC cube，Elementar，Hanau，Germany）进行碳、氮含量测定，随后利用差量法换算得到固体样品中相应离子的含量.

1.4　数据处理及分析

利用QIIME2软件（QIIME2-2019.7）对原始下机数据进行质控（Caporaso et al.，2010），使用DADA2方法（Edgar et al.，2011）进行质控去除嵌合体，从而得到优质序列.质控后的序列经过QIIME2处理后得到ASV（amplicon sequence variant），使用生成的Feature表格进行后续的数据分析（Edgar，2010）.使用Silva数据库（Release 134，http://www.arb-silva.de）和已发表数据库（Cai et al.，2020）进行物种注释.并将所有样本序列进行均一化处理，使每个样本中reads数均为29 111.之后使用QIIME2软件计算样本的α多样性指数及β多样性.

LEfSe分析在Galaxy平台（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy）进行.使用R软件中的vegan包基于bray-Curtis距离矩阵对不同生境的微生物群落进行非度量多维尺度分析（NMDS），细菌群落及环境因子的冗余分析（RDA）通过Canoco 5.0实现（Bokulich et al.，2014）.使用Tax4fun2数据库对16S rRNA基因序列进行功能预测分析（Herbst et al.，2018）.使用R软件中的“psych”包计算物种与环境因子的Spearman相关性，只保留占比在0.04%以上的reads，继续使用R中的“psych”包计算得出ASV间相关系数矩阵，计算ASV间两两的Spearman相关系数，过滤相关系数|r|大于0.8，P值小于0.05为有效关系（Wang et al.，2020）.导入Gephi软件进行可视化（https://gephi.org），计算网络的拓扑特性并将其按模块和门类分别进行着色.

2 结果分析

2.1　洞穴不同生境中细菌群落结构特征

根据在不同分类单元水平上识别出的多样性指数，计算盘龙洞洞穴不同生境的α多样性指数（表1）.Chao1指数和ACE指数用以反映细菌群落的丰富度，Shannon指数和Simpson指数用以反映细菌群落的多样性.ANOVA检验显示，α多样性指数在不同生境中存在显著性差异（P<0.05）（表1）.在7种生境中，上覆土壤细菌丰富度最高，滴水微生物丰富度最低，干、湿石笋表面生物膜细菌丰富度相差不大，且高于沉积物及岩壁生境.Shannon指数和Simpson指数均显示滴水生境的细菌多样性指数最低，且与其他6种生境存在显著性差异（表1）.干石笋表面生物膜细菌多样性指数最高，略高于上覆土壤.Shannon指数由高到低依次为干石笋表面生物膜>上覆土壤>湿石笋表面生物膜>沉积物>岩壁>风化结皮>滴水.

盘龙洞7个生境33个点位共计99个样品细菌测序后共计得到29 111个ASVs，分属于35个门，每个生境中相对丰度位于前10的细菌门的群落组成如图2所示.湿石笋表面的细菌群落与上覆土壤中的细菌群落组成相似，岩壁和风化结皮样品中的细菌群落组成相似，滴水的微生物群落组成与其他样品聚类关系较远（图2a）.变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、蓝细菌门（Cyanobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）（图2a）等在所有样品中均占据优势.其中放线菌门和变形菌门的相对丰度在固体样本（土壤、岩壁、风化结皮、沉积物等）中较高（>50%），而在滴水样本中则以变形菌门为主.在土壤样品中，变形菌门（27.9%）的相对丰度略高于放线菌门（25.8%）（图2a）.而石笋表面生物膜中变形菌门的相对丰度则显著高于放线菌门，干、湿石笋表面生物膜中变形菌门的相对丰度分别为41.5%和48.3%，而对应的放线菌门的相对丰度则分别为29.5%和25.1%.滴水生境中变形菌门（83.7%）占显著的主导地位，放线菌门（11.4%）次之（图2a）.但在岩壁和风化壳生境中，放线菌门的相对丰度（44.9%、45.4%）显著高于变形菌门（28.2%、28.5%）.酸杆菌门在所有生境中的相对丰度均位居第3，其相对丰度处于0.01%和14.4%间（图2a）.滴水生境中芽单胞菌门、硝化螺旋菌门、蓝细菌门和绿弯菌门的相对丰度极低，但除风化结皮外蓝细菌门在其他所有小生境中均发现（图2a）.

所有样品中相对丰度位居前15的属均来自放线菌门、变形菌门和酸杆菌门（图2b）.沉积物生境中嗜糖假单胞菌属（Pelomonas）、大气甲烷氧化菌USCγ （upland soil cluster γ）及芽单胞菌属（Gemmatimonas）的相对丰度分别为19.0%、17.4%和16.3%，其余属的相对丰度较低. USCγ在岩壁生境中的相对丰度占比高于其他属（24.9%）.嗜糖假单胞菌属在上覆土壤和湿石笋表面也拥有较高的相对丰度，分别为36.5%和36.0%.风化结皮和湿石笋表面样品中相对丰度较高的属均为酸土单胞菌属，相对丰度占比分别为24.0%和32.2%.滴水生境中不动杆菌属（Acinetobacter）占据显著的主导地位，相对丰度高达到83.2%，且在除风化结皮外的所有生境中均有出现.

基于ASV水平的NMDS聚类分析（图2d）将广西桂林盘龙洞洞穴各生境的细菌群落分为7个不同的群组（stress < 0.2，P < 0.001）.滴水和上覆土壤样品中的微生物群落与其他样品中微生物群落的差异较大，岩壁与风化结皮的细菌群落分组较为接近，这与物种聚类结果吻合（图2a）.

对盘龙洞不同生境细菌群落组成进行多级物种差异判别分析（LEfSe），寻找对样本划分产生显著性差异影响的物种，即指示类群.采用LDA对数据进行降维，评估差异显著的指示类群的效应值（LDA=4），将具有显著差别的不同分类水平的指示类群以树图的形式表现出来.Lefse分析（图2c）展示了不同生境微生物群落的指示类群.例如，干石笋表面生物膜的指示类群为类芽孢杆菌属（Paenibacillus），湿石笋表面生物膜的指示类群为酸杆菌科的Gp-6、假单胞菌属（Pseudomonas）和黄单胞菌科（Lysobacter）；滴水微生物群落的指示类群为假单胞菌目（Pseudomonadales）等；上覆土壤中微生物群落的指示类群为分枝杆菌属（Mycobacterium）和诺卡氏菌科（Nocardiaceae）；沉积物微生物群落的指示类群为芽孢杆菌属（Bacillus）和酸杆菌科的Gp-7；岩壁微生物群落的指示类群为着色菌目（Chromatiales）；风化结皮微生物群落的指示类群为嗜热油菌属（Thermoleophilum）.不同生境样品微生物群落的指示物种均不相同，进一步证明了生境对细菌群落具有显著影响.

2.2　盘龙洞微生物群落与环境因子之间的关系

除4、5号点位的土壤样本外，本研究中所有样本均呈现弱碱性，pH 变化范围为7.19~9.14（表2）.随着采样点向洞穴内部的深入，温度逐渐升高；岩壁样本的TOC浓度显著高于沉积物样本.SO₄ ^2-的变化幅度较大（14.46~1 682.04 mg/Kg），在沉积物中的变化尤为显著（表2）.

细菌群落组成与环境因子的冗余分析（RDA）（图3a）显示，温度（P = 0.002）是唯一显著影响盘龙洞细菌群落结构的环境因子，解释度高达37.4%.不同物种及其与环境因子的相关性分析结果显示，在相对丰度前10的细菌门类中，变形菌门、硝化螺旋菌门与温度呈显著正相关，而放线菌门则与温度呈显著负相关；SO₄ ^2-的浓度与硝化螺旋菌门的微生物呈显著负相关（图3b）.

2.3　细菌群落功能预测

基于细菌16S rRNA，通过Tax4fun2数据库对细菌潜在的功能进行预测，重点对参与碳氮循环的酶进行检测，结果表明洞穴中可能有多种酶参与洞穴内的碳氮循环（图4）.如参与糖酵解途径的己糖激酶［EC：2.7.1.1］，甘油醛3-磷酸脱氢酶［EC：1.2.1.12］和丙酮酸激酶［EC：2.7.1.40］；参与戊糖磷酸途径的己糖-6-磷酸脱氢酶［EC：1.1.1.47 3.1.1.31］，异二硫还原酶亚单位D ［EC：1.8.98.1］；参与甲烷生成的甲基-辅酶M还原酶α亚单位［EC：2.8.4.1］.此外与微生物6种固定二氧化碳途径相关的酶均可在盘龙洞中被预测到，如参与羟基丁酸循环的4-羟基丁酰-辅酶A脱水酶［EC：4.2.1.120 5.3.3.3］（图4b）.

与碳循环相关的酶相比，在盘龙洞中可预测到参与氮循环的酶相对偏少，它们主要涉及到固氮、反硝化、异化硝酸盐还原、同化硝酸盐还原、硝化作用及全程硝化作用（图4a）.如参与固氮过程的固氮酶铁蛋白NifH ［EC：1.18.6.1］；参与反硝化途径的羟胺氧化酶［EC：1.7.3.4］，铁氧蛋白-硝酸还原酶［EC：1.7.7.2］和参与同化硝酸盐还原反应的同化硝酸还原酶电子转移亚单位［EC：1.7.99-］.

不同生境中，参与碳氮循环的酶的相对丰度也不同.干燥石笋表面生物膜是唯一一个拥有完整氮循环通路的小生境，且氨到羟胺的转化只在干燥石笋表面生物膜中发生.滴水生境在部分氮循环过程中占据主导地位，如滴水是硝化作用、全程硝化作用、反硝化作用、同化及异化硝酸盐还原作用这4种氮循环途径预测丰度最高的场所，硝酸盐、亚硝酸盐、氨和羟胺4种物质的循环主要发生在滴水生境中.湿润石笋表面生物膜上也可预测到多种与氮循环相关的通路，洞穴中的同化硝酸盐还原作用及异化硝酸盐还原作用主要在此生境中发生，湿石笋表面生物膜上存在丰富的与亚硝酸盐、一氧化氮、一氧化二氮、氮气、氨这5种物质相互转化相关的酶；沉积物生境中的固氮作用最为强烈.整体而言，除硝化作用外，氮循环相关通路可以在盘龙洞的所有小生境中被预测到，滴水和石笋表面生物膜是与氮循环最为息息相关的小生境.

盘龙洞与碳固定密切相关的生境和与氮循环密切相关的生境并不相同，且不同生境中参与碳固定的酶丰度差异较大（图4b）.在盘龙洞中可以预测到全部6种微生物固定二氧化碳的途径，它们分别是磷酸乙酰转移酶-乙酸激酶途径、不完全柠檬酸循环、还原性乙酰辅酶A循环、3-羟基丙酸循环、三羧酸循环循环和羟基丁酸循环.风化结皮和沉积物生境在洞穴二氧化碳的固定具有举足轻重的地位，例如：在不完全柠檬酸循环中，风化结皮中拥有最多与二氧化碳被固定为丙酮酸相关的酶，沉积物生境中与二氧化碳被固定为异柠檬酸盐和与二氧化碳被固定为2-氧代戊二酸相关的酶丰度颇高；在厌氧乙酰辅酶A循环中，二氧化碳被固定为甲酸盐主要发生在风化结皮生境中，二氧化碳转化为一氧化碳这一过程也主要在风化结皮中发生，而一氧化碳被固定为乙酰辅酶A这一过程仅在沉积物和风化结皮生境中被预测到.在还原性乙酰辅酶A循环中，5-甲基四氢叶酸被转化为四氢叶酸相关的酶只在岩壁生境中可被预测到.整体而言，风化结皮、沉积物、岩壁生境是与洞穴原核生物固定二氧化碳关系最为密切的生境.

2.4　洞穴中细菌共现网络分析

盘龙洞细菌群落的共现网络共包含291个点，1 605个正相关（99.94%）和一个负相关（0.06%）的边.网络具有很强的模块化结构，模块化指数为0.79（大于0.40）（图5a），共现网络的平均路径长度和直径分别为5.67和14.放线菌门和变形菌门在网络中分布广泛，占全部节点的68.28%.根据中介中心性评分，排名前三的属被认定是关键类群，它们分别是着色菌目（Chromatiales）、大气甲烷氧化菌（USCγ）和放线菌目（Actinomycetales）.节点度反映了节点的作用，根据每个节点的节点度，可以获取在共现网络中的重点分类单元，如变形菌门、放线菌门都呈现较大的节点度，证明在细菌的共生网络中，这两个门类的微生物的贡献更为突出，蓝细菌门虽然出现次数较少，但也拥有较大的节点度，证明蓝细菌门在微生物的相互作用中占有重要的地位.

共发生网络大部分节点被划分为8个主要模块（图5a），其中前6个模块占比达91.76%.每个模块的节点对洞穴生境的偏好不同（图5c）.在模块1、3、5中，节点主要来自岩壁和沉积物样品；模块2中大部分节点来自沉积物样品；模块4中节点主要来自石笋表面生物膜；模块6中，绝大部分节点（97.85%）来自滴水样品（图5c）.

3 讨论

3.1　盘龙洞细菌群落的生境特异性及其影响因子

尽管喀斯特洞穴是无光的极端寡营养环境，但盘龙洞中依然检测到丰富的细菌多样性.从门水平看（图2a），变形菌门是除岩壁和风化岩壁所有生境中的主要类群.变形菌门可以利用微量碳源，在其他洞穴中也分布广泛（Wang et al.，2012；Gulecal-Pektas，2016）.放线菌门是盘龙洞相对丰度位于第二的门类，在岩壁和风化结皮中，放线菌的相对丰度高于变形菌.前人研究发现，放线菌能产生具有生物活性的化合物，常生长在洞穴的岩壁上，可吸收大气中的二氧化碳（Sauro et al.，2020）.拟杆菌门和酸杆菌门的微生物能够分解环境中的有机化合物（Bastida et al.，2015），特别是酸杆菌门中的寡营养类群，它们的相对丰度与营养水平呈负相关（Smit et al.，2001）.绿弯菌门是绿色非硫细菌，可以固定二氧化碳，也是一种在洞穴中广泛分布的微生物（Riquelme et al.，2015）.硝化螺旋菌门的存在对氮循环至关重要，硝化螺旋菌门中的亚硝酸盐氧化菌可以进行硝化作用，从而为贫营养条件下的生态系统提供氮源（Lavoie et al.，2017）.厚壁菌门在各个生境中都有发现，可能与它们对营养胁迫的抗性和在极端生境下具有良好的生存能力有关.值得注意的是，从属水平看，USCγ类群在岩壁和沉积物这两大主要生境中均占有较高的相对丰度（图2b），这与和尚洞、罗汉肚洞和新村屯洞穴中的研究结果一致 （Zhao et al.，2018；Cheng et al.，2021b），表明高亲和力的大气甲烷氧化菌在喀斯特洞穴中广泛存在，为洞穴作为陆地生态系统中潜在的大气甲烷汇提供了生物学证据.嗜糖假单胞菌属在沉积物、上覆土壤及湿石笋表面生物膜中都拥有较高的相对丰度，这与对美国7个洞穴微生物群落的研究相符（Yang et al.，2017）.滴水生境中不动杆菌属占显著的主导地位，这与前期对湖北和尚洞滴水中的微生物群落进行动态监测结果一致（Yun et al.，2018）.

洞穴生境是影响微生物存活的重要因素（Cheng et al.，2021b），如蓝细菌门在风化岩壁生境中并不存在.此外，不同生境微生物群落的指示类群也不相同，这表明洞穴微生物存在生境偏好性，也暗示着不同生境中的微生物群落潜的生态功能的差异.滴水生境的指示类群为γ变形菌纲的假单胞菌目，假单胞菌目可以同化二氧化碳和氧化硫化物，在碳、硫循环中起重要作用（Zhang et al.，2021），且假单胞菌目常被报道存在于根际土壤中，其功能也与氮循环密不可分（Han et al.，2020； Sun et al.，2022）.沉积物的指示类群为芽孢杆菌属，其可形成抗逆性极强的芽孢，因而具有很强的环境适应性（Radita et al.，2018）.岩壁和风化结皮的指示类群分别为来自放线菌门的着色菌目和嗜热油菌属，放线菌被认为是岩壁微生物群落的先锋物种，大多数放线菌的适宜生长条件为弱碱性（Lewin et al.，2016），本研究中岩壁及风化结皮均呈弱碱性，适合放线菌的生长.湿石笋表面生物膜的指示类群为酸杆菌科，酸杆菌科通常是寡营养、低pH环境中的优势类群，具有降解环境中有机化合物的能力（Ivanova et al.，2020）.

pH通常被认为是影响土壤微生物群落的重要因素（Puissant et al.，2019；Wang et al.，2020），也被证实是影响湖北和尚洞以及广西桂林新村屯洞穴微生物群落组成的重要环境因子，但在盘龙洞内微生物群落同pH的关系并不显著相关.通过微生物群落组成与环境因子的冗余分析发现，影响盘龙洞微生物群落组成的主要因子为温度.温度可通过影响微生物的生长、矿化速率、酶活性等对微生物产生直接影响，也可通过影响土壤水分、养分的有效性等对微生物产生间接影响（Bradford et al.，2019）.在前人针对全球变暖开展的原位增温实验研究中发现，短期增温会使微生物的硝化作用和氮固定作用速率升高，使土壤碳损失增加，对于微生物活性以及呼吸作用也产生强烈影响，长期增温会使微生物改变其自身结构或调节代谢过程产生适应（Melillo et al.，2017；Wang et al.，2019）.考虑到洞穴内部温度相对稳定，冬季的温度显著高于外界土壤的温度，其微生物的硝化作用和固氮作用速率可能高于土壤微生物，但有关推测尚需实验结果的验证.

3.2　洞穴生态系统中微生物的共生网络及其潜在的生态功能

盘龙洞微生物共现网络由多个正边组成，负边极少，这种物种共生模式表现为不同门之间合作、协同关系，这与湖北、广西、重庆、四川等地洞穴微生物群落的共生网络的结果一致（Zhu et al.，2019；Ma et al.，2021）.前人研究发现，在营养有限的环境中检测到代谢交换（Zelezniak et al.，2015），代谢合作可以驱动细菌的共生模式，并形成相互协作的关系（Morris et al.，2013），揭示了微生物的相互依赖性，我们的研究结果与前人的结果相吻合，说明洞穴中微生物群落相互作用模式的普遍性.

盘龙洞的细菌共生网络具有不同的拓扑性质和复杂的物种相互作用，表明细菌群落中存在稳定复杂的相互作用和较好的模块化结构.较低的共现指数、较高的聚类系数表示细菌群落具有较高的合作性.以往的研究表明，大多数生态网络的关联度值较低（Poisot and Gravel，2014），在盘龙洞的共现网络中也得到了相同的结果.着色菌目（Chromatiales）、USCγ类群和放线菌目（Actinomycetales）是盘龙洞中细菌共现网络的关键类群.着色菌目（Chromatiales）是变形菌门中的一类能够进行光合作用的细菌，也被称为紫硫细菌.着色菌目的细菌是厌氧生物，常生活在富含硫磺的泉水或静水中，它们能将硫化氢氧化成颗粒状的硫，颗粒硫会被进一步氧化为硫酸（Proctor，1997）.USC类群被认为是大气甲烷氧化菌的唯一类群，曾在多种生境中被发现（Knief，2015），USCγ类群在系统进化上更接近Ⅰ型的可培养甲烷氧化菌Methylococcaceae，它们可以消耗大气中的痕量甲烷（Knief et al.，2003），降低大气甲烷的温室效应.它们的存在使喀斯特洞穴成为陆地生态系统中除土壤以外的一个大气甲烷汇，具有重要的生态学意义.此外，USCγ类群在盘龙洞岩壁和沉积物中也表现出较高的丰度，该类群作为盘龙洞共生网络中的关键类群，通过氧化大气中的痕量甲烷参与生物能源和营养物质的生成（Pratscher et al.，2018），进而在维持洞穴生态系统中起到关键作用.放线菌在盘龙洞生态系统中分布广泛且丰度极高，有研究认为，放线菌可吸收大气中的二氧化碳，并溶解岩石生成碳酸钙晶体（Fang et al.，2017）.因此，盘龙洞细菌群落中的关键类群可能会在洞穴生态系统的碳循环、硫循环中发挥重要作用.

为了应对寡营养的环境，化能微生物可以利用硫和金属离子在洞穴生态系统中生成生物能源和营养物质（Tang et al.，2009）.此外，微生物还可以通过固氮、固碳等来获取营养物质，从而维持洞穴生态系统（He et al.，2007；Lavoie et al.，2017）.洞穴中的自养细菌可以同时充当初级生产者和公共能量输入者（Reitschuler et al.，2016）.在本研究中，与二氧化碳固定相关酶具有丰富的多样性，表明自养细菌在洞穴中也具有多样性.除了卡尔文循环外，细菌在极端环境中还可能利用其他几种特定的固碳途径.如根据先前报道的研究，4-羟基丁酰辅酶A脱水酶在贫营养环境中大量存在，并参与洞穴环境中的碳同化过程（Ortiz et al.，2014）；3-羟基丙酸循环是另一种自养碳固定途径，丙二酰辅酶A还原酶作为3-羟基丙酸循环的关键酶，在绿弯菌门中被发现（Lavoie et al.，2017）.

对于氮循环，研究人员通过对Nullarbor区域Weebubbie洞穴的黏液帷幔16S rRNA基因文库及基因组数据进行分析后认为，洞穴中的黏液帷幔可能代表了一种新的由硝化作用驱动的化能自养微生物群落（Tetu et al.，2013）.在本研究中预测到的与氮循环的相关酶不仅涉及硝化作用，还涉及到固氮、反硝化、硝酸盐同化还原和硝酸盐异化还原，表明由于洞穴生态系统中氮资源极其匮乏，细菌可以通过多种的策略和代谢途径生获取氮源（Cheeptham et al.，2013）.

由于细菌群落的生境特异性，使得不同生境中细菌的生态功能也产生差异.在盘龙洞的7种小生境中，滴水、石笋表面生物膜这3种生境与氮循环的关系最为密切.变形菌门在这3种生境中都具有相当高的丰度，前人研究发现，变形菌门是土壤中氮循环参与度最高的门类（Nelson et al.，2016），本研究结果表明变形菌门也可能高度参与洞穴中的氮循环，可见不同生境中的变形菌门均与氮循环关系十分密切.滴水生境中不动杆菌属占据绝对的主导地位（图2b），该属与环境中的硝酸盐和铵离子浓度关系密切.且滴水生境中的指示类群为假单胞菌目，该目中被报道的许多属均与固氮作用、反硝化作用等氮代谢过程息息相关（Kraft et al.，2014； Kuypers et al.，2018）.这些结果佐证了本研究中功能预测的可行性，但有关功能依然需要实验来进一步加以验证.与洞穴碳固定最为相关的3个生境是风化结皮、岩壁与沉积物生境.放线菌门是风化结皮和岩壁生境中的优势类群，前人研究发现，某些放线菌可以通过代谢活动诱导碳酸钙的形成以固定二氧化碳（Debora and Tugba，2016），且本研究中所有风化结皮与岩壁均呈弱碱性，有利于放线菌的生长（Kontro et al.，2005）.沉积物作为另一个与碳固定高度相关的生境，酸杆菌门在沉积物中的相对丰度显著高于其他生境，有研究表明，土壤中的酸杆菌门可能通过分泌胞外酶的方式参与碳固定及碳循环，使得土壤微生物从生长缓慢的寡营养类群向快速生长的共生营养类群的转变（Yang et al.，2021）.因此，本研究的功能预测结果与微生物群落的生境特异性得以相互印证.

4 结论

广西桂林盘龙洞穴微生物群落总体上以变形菌门和放线菌门占主导，但不同小生境的指示类群并不相同，表明了洞穴微生物群落的生境特异性，而温度是影响细菌群落组成的主要因素.功能预测的结果表明参与碳、氮循环的酶在不同的生境中的丰度具有较大的差异，滴水、干燥石笋表面生物膜、湿润石笋表面生物膜3个生境与洞穴氮循环密切相关，风化结皮、沉积物、岩壁3个生境与洞穴微生物固定二氧化碳关系密切.洞穴中微生物群落间通过紧密的代谢交换，互利互惠，联系紧密，共同适应极端寡营养的洞穴环境.本研究结果为刻画洞穴这一深部生物圈中微生物群落的生态功能及相互作用提供了新的认识.但洞穴微生物群落的有关功能还需后续的实验工作加以验证.

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基金资助

国家自然科学基金重点项目(91951208)

广西自然科学基金项目(2020GXNSFAA297025)

中国地质调查局地质调查项目(DD20190343)