固氮鱼腥藻介导As(Ⅲ)氧化及其对铵氮输入的响应

Nitrogen-Fixing Anabaena sp. Mediated As(III) Oxidation and Its Response to Ammonium Input

摘要

铵氮在砷的生物地球化学循环过程中发挥着重要作用，但铵氮输入对藻类介导的As（Ⅲ）生物氧化机理尚不清楚.以固氮蓝藻鱼腥藻（Anabaena sp.）为研究对象，通过室内模拟实验，研究在不同浓度As（Ⅲ）条件下，鱼腥藻对As（Ⅲ）的毒性响应和氧化作用，并研究了外源铵氮输入对鱼腥藻的生长以及氧化As（Ⅲ）的影响.结果表明，鱼腥藻的半抑制浓度（IC₅₀）值为15.59 mg/L，当As（Ⅲ）的浓度为0.1 mg/L、1 mg/L和10 mg/L时，分别在1 d、2 d和7 d内被完全氧化为As（V），并且随着As（Ⅲ）浓度增加，鱼腥藻的固氮作用增强.NH₄ ⁺浓度在234 mg/L以内时，对鱼腥藻（Anabaena sp.）的生长有促进作用，随着NH₄ ⁺浓度从0 mg/L增加至1 mg/L、45 mg/L和234 mg/L，1 mg/L As（Ⅲ） 分别在48 h、36 h、24 h和12 h被完全氧化.随着NH₄ ⁺浓度增加，鱼腥藻对砷的吸附量增加，As（Ⅲ）的氧化加速.研究结果有助于阐释天然水体中铵氮在砷生物转化过程中的作用.

关键词

鱼腥藻 / 亚砷酸盐 / 铵氮 / 毒性 / 氧化 / 吸附 / 地球化学

Key words

anabaena sp / arsenite / ammonium / toxicity / oxidation / adsorption / geochemistry

砷（As）是一种剧毒的类重金属元素，广泛分布于天然水体、土壤和岩石矿物中（Che et al.， 2018）. 全球50多个国家和地区约有2.2亿人接触砷含量超过10 μg/L的天然水（Ruan et al.， 2022）.虽然世界卫生组织（WHO）划定了安全饮用水中As浓度不高于10 μg/L，但是一些发展中国家（如孟加拉国）制定的饮用水标准中仍然采用50 μg/L作为阈值（Bahar et al.， 2013）.在天然水体中As含量一般低于10 μg/L，但是也有一些地区高达5 000 μg/L（Levy et al.， 2005；Bahar et al.， 2013）.砷在天然环境中存在4种价态（As（-Ⅲ）、 As（0）、 As（Ⅲ）和As（Ⅴ））（Wang et al.， 2015； Miyashita et al.， 2016），最常见的形式有三价砷［As（Ⅲ）］、五价砷［As（Ⅴ）］、一甲基胂酸［MMA（V）］和二甲基胂酸［DMA（V）］（Patel et al.， 2018），其对人体的毒性强度依次为：As（Ⅲ）> As（Ⅴ）> MMA（V）> DMA（V）.

微藻在地表水体中广泛存在.由于微藻具有较高的比表面积（Zhang et al.， 2014），且藻细胞表面具有多种官能团（如-OH、-COOH、-NH、-C=O）（Tabaraki and Heidarizadi， 2018），因此被认为是去除水环境中As的理想材料.另外，微藻可以将As（Ⅲ）氧化为毒性更小、稳定性更强的As（V）（Wang et al.， 2013a；Jana et al.， 2015），或者将无机砷转化为毒性更小的甲基砷（Wang et al.， 2013b； Xue et al.， 2017）.蓝藻作为生态系统中的产氧光合生物，可以适应多种极端环境（Patel et al.， 2018）.部分蓝藻在缺氮的环境中生长，会产生异形胞，固氮酶在异形胞中将大气中的氮气固定，转化成铵氮（Böhme， 1998； Berman-Frank et al.， 2003）.相比于其他氮源，蓝藻更易于吸收利用铵态氮（Kumar and Bera， 2020）.此外，化石燃料的燃烧、农业施肥（赵欣鑫等，2020）和高浓度铵盐废水流入天然水体等人为活动同样会导致环境中铵氮含量的增加，过高的铵氮浓度会导致水体富营养化，破坏水生态环境（屈国颖等，2022）.但是，当前对于氮‒砷‒藻间相互作用的研究聚焦于硝酸盐的作用，Wang et al.（2013a）研究了莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii） 在不同浓度硝酸盐条件下对As（Ⅲ）的积累和氧化，其研究结果表明硝酸盐减少了藻细胞As（Ⅲ）转运蛋白合成，对砷的吸收量减少.与莱茵衣藻不同的是，栅藻（Scenedesmus acutus）对As（Ⅲ）的吸收与硝酸盐存在没有明显相关性，但在加入硝酸盐后，其对As（Ⅲ）的积累随着As（Ⅲ）浓度的增加而降低（Awoyemi et al.， 2020）.然而，造成水体富营养化的氮源除了硝酸盐外，还有铵盐，当前已有研究指出，铵盐输入可以缓解Cr（Ⅳ）对小球藻（Chlorella vulgaris）的毒性（Liu et al.， 2015）.但是，铵盐作为微藻可以直接利用的氮源，其输入如何影响水体中微藻与As（Ⅲ）之间的关系亟待查明.

本文以淡水环境中广泛存在的水华固氮蓝藻（鱼腥藻FACHB-418）为研究对象，研究鱼腥藻对As（Ⅲ）的毒性响应和氧化作用，以及铵氮介导下鱼腥藻对As（Ⅲ）的氧化机理，揭示天然水体中铵氮输入（生物固氮、工业氮肥等）对砷生物地球化学循环的重要作用.

1 材料与方法

1.1　实验材料

实验所用鱼腥藻FACHB-418（Anabaena sp. FACHB-418）购自中国科学院水生生物研究所藻种库，将藻种置于BG₁₁培养基中培养，培养条件为光强2 000 Lux，光暗比为12 h∶12 h，培养温度为27 ℃，pH调至7.2，每天定时摇动3次锥形瓶，当鱼腥藻生长至对数生长中期时，5 000 r/min离心15 min收集藻细胞，将藻细胞转接到BG11₀新鲜培养基中培养2 d，对藻细胞进行脱氮处理，以确保藻细胞内氮含量基本一致.脱氮处理后的藻细胞再用超纯水清洗两次后收集，用于后续实验.

实验所用As（Ⅲ）为NaAsO₂配制的 1 000 mg/L母液.实验所用的培养基、储备容器和锥形瓶均用高压灭菌锅在121 ℃处理 20 min，后续实验过程中的pH通过加入 5 mmol/L的HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）缓冲液控制在7.2，藻细胞的初始OD_{750 nm}（光密度）为0.15.

1.2　As(Ⅲ)毒性实验

将As（Ⅲ）加入到BG11₀培养基中，使As（Ⅲ）浓度分别为1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L.每个处理组加入2 mL相同浓度经脱氮处理后的藻液于250 mL培养液中，每个处理组设置3个平行，不加As（Ⅲ）的处理组为对照组.实验进行10 d，实验过程中2 d取一次样.IC₅₀值的计算根据第 10 d鱼腥藻的OD值与各处理组初始砷浓度，通过线性插值法得出（Levy et al.， 2005）.

取2.5 mL藻液，用紫外‒可见分光光度计测定藻液在750 nm处的OD值（UV-1800PC，上海美普达仪器）.根据Lichtenthaler（1987）的方法提取藻细胞中叶绿素a和类胡萝卜素的含量，取5 mL藻液，5 000 r/min离心15 min，倒掉上清液，收集藻细胞，加入5 mL 95 %的乙醇，在4 ℃的黑暗条件下，提取24 h后，过0.45 µm水系滤膜，用紫外‒可见分光光度计测定 774.2 nm、648.6 nm和470 nm处的OD值.

根据如下公式计算得到叶绿素a和类胡萝卜素的含量：

叶绿素a的计算方程：C_a=13.36OD_664.2- 5.19OD_648.6 ， (1)

类胡萝卜素的计算方程：C_x+c=(1 000OD₄₇₀-2.13C_a)/209. (2)

1.3　As(Ⅲ)生物氧化及对鱼腥藻固氮能力的影响

由于天然水体中砷浓度通常小于10 mg/L（Hussain et al.， 2021），因此设定As（Ⅲ）浓度分别为0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L，每个处理组加入2 mL相同浓度经脱氮处理后的藻液于250 mL培养液中，并设置3个平行和2个空白对照（有藻无砷和有砷无藻）.本文分别在接种藻的第0、0.25、1、2、3、5、7、9 d取样，取2 mL培养液用0.45 μm水系过滤器过滤后测定溶液中总砷［As（T）］、As（V）、As（Ⅲ），取5 mL培养液用0.45 μm水系过滤器过滤后测定溶液中NH₄ ⁺、NO₃ ^-、NO₂ ^-含量.

根据中华人民共和国环境保护部（2010）颁布的水质氨氮测定标准（HJ535-2009），测定NH₄ ⁺浓度.根据Fang et al. （2021）的方法测定NO₃ ^-和NO₂ ^-浓度.

1.4　NH₄ ⁺输入对As(Ⅲ)生物氧化的影响

向BG11₀培养基中加入NH₄Cl溶液，根据NH₄ ⁺浓度对藻生长的影响（1 mg/L为鱼腥藻在9 d实验过程产生的NH₄ ⁺浓度，45 mg/L为最适合鱼腥藻生长的NH₄ ⁺浓度，234 mg/L为鱼腥藻所能耐受的最大NH₄ ⁺浓度），设置溶液中NH₄ ⁺的浓度分别为0 mg/L、1 mg/L、 45 mg/L和234 mg/L.每个处理组加入2 mL相同浓度经脱氮处理后的藻液于250 mL培养液中，并设置3个平行和2个空白对照（有藻无砷和有砷无藻）.测定藻的OD_{750 nm}、叶绿素a和类胡萝卜素的含量，溶液中As（T）、As（V）、As（Ⅲ）以及藻细胞表面吸附砷的含量.

对NH₄ ⁺浓度为0 mg/L和234 mg/L的处理组中藻细胞对砷的吸附量进行准一级动力学模型（Tabaraki and Heidarizadi， 2018）和准二级动力学模型拟合（Pokhrel and Viraraghavan， 2008），准一级动力学模型为：

\mathrm{l} \mathrm{n} \left(q_{e-}{q}_t\right) = \mathrm{l} \mathrm{n} q - k_{\mathrm{1}} t,

其中，k ₁（h ^-1）表示准一级方程的速率常数，q_t 表示在生物吸附时间t（h）时的吸附量，q_e （μg/g）表示生物吸附平衡时的吸附量.

准二级动力学模型如下：

\frac{t}{q_t} = \frac{\mathrm{1}}{k_{\mathrm{2}}{q}_e^{\mathrm{2}}} + ( \frac{\mathrm{1}}{q_e} ) t ,

其中，k ₂（g/μg⋅h）表示准二级方程的速率常数，q_t 表示在生物吸附时间t（h）时的吸附量，q_e （μg/g）表示生物吸附平衡时的吸附量.

1.5　砷含量和砷形态分析

根据王晶等（2021）的方法，培养液中As（V）、As（Ⅲ）和As（T）浓度通过氢化物发生‒原子荧光分光光谱法进行测定（HG-AFS； AFS-9700，北京吉天仪器）.藻细胞表面吸附砷的测定：收集每次取样后的藻细胞，用20 mmol/L Na₂-EDTA 冲洗（吉米拉木·加马力等，2019），5 000 r/min离心 15 min后，收集上清液并用0.45 μm水系过滤器过滤，测定方法与培养基中砷的测定相同.

1.6　藻细胞表面的光谱分析

FTIR（傅里叶红外）光谱的测定，通过将1 mg经冷冻干燥的藻和99 mg干燥的KBr混合研磨后，在分辨率4 cm^-1的条件下利用傅里叶红外光谱仪（Nicolet iS50，赛默飞，美国）在4 000~400 cm^-1的光谱范围对藻细胞表面官能团进行表征.

1.7　数据处理

数据采用平均值±标准差表示（n=3），使用Excel和Origin 2018软件分析和处理相关数据.数据的统计分析均使用SPSS 25.0软件进行差异显著性分析（p<0.05）.

2 结果与讨论

2.1　As(Ⅲ)对鱼腥藻生长的影响

利用藻细胞悬液的吸光度反映鱼腥藻生物量.As（Ⅲ）对鱼腥藻生长的影响如图1所示，随着As（Ⅲ）浓度升高，鱼腥藻生长速度下降，在第10 d时，浓度为1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L和20 mg/L As（Ⅲ）处理组中，藻生物量相比于对照组分别减少了9 %、15.3 %、33 %、63.4 %，表明As（Ⅲ）显著抑制（p<0.05）鱼腥藻生长.As（Ⅲ）对鱼腥藻毒性作用表现在阻断-SH蛋白以及细胞内其他重要蛋白质（如丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶）合成，破坏藻细胞正常代谢（Wang et al.， 2015）. As（Ⅲ）对鱼腥藻的IC₅₀值为15.59 mg/L，高于前人研究结果（11.25 mg/L）（Patel et al.， 2021）.这可能与实验过程的培养条件有关，培养过程中的振荡、光照、温度等因素均有可能影响藻生长.

鱼腥藻色素含量与As（Ⅲ）浓度关系如图2所示，As（Ⅲ）对藻细胞内色素的影响与对生长的影响具有相似性（p<0.05）.在第10 d，随着As（Ⅲ）浓度增加，叶绿素a含量分别减少了7.17 %、11.06 %、37.09 %、65.81 %，类胡萝卜素含量分别减少了6.67 %、10.6 %、35.9 %、60.9 %.这些结果表明，随着As（Ⅲ）浓度和处理时间增加，As（Ⅲ）对鱼腥藻色素损伤逐渐增强，叶绿素a比类胡萝卜素更易受到As（Ⅲ）伤害.其他部分蓝藻也存在类似现象，当铜绿微囊藻暴露于10 mg/L As（Ⅲ）时，叶绿素a的合成相比于类胡萝卜素下降了30.48 %，这可能是由于叶绿素a的合成比类胡萝卜素的合成对As（Ⅲ）更敏感（Wang et al.，2012；Patel et al.，2018）.

2.2　As(Ⅲ)的生物氧化及对藻固氮能力的影响

经过9 d培养，在不加藻的对照组中，只有8%的As（Ⅲ）被氧化成As（V）（图3d），说明As（Ⅲ）在培养液中相对稳定，难以被空气中的O₂氧化.鱼腥藻具有很强的As（Ⅲ）氧化能力，在0.1 mg/L As（Ⅲ）条件下，培养液中As（Ⅲ）在1 d内被鱼腥藻完全氧化（图3a）.随着培养液中As（Ⅲ）浓度增加，鱼腥藻完全氧化培养液中As（Ⅲ）分别需要2 d（1 mg/L As（Ⅲ））和7 d（10 mg/L As（Ⅲ））.这可能是由于高浓度As（Ⅲ）破坏藻细胞结构，抑制藻生长，从而抑制As（Ⅲ）生物氧化.当培养液中As（Ⅲ）浓度较低时（图3a，3b），培养液中As（Ⅲ）在2 d内迅速被氧化.藻类对As（Ⅲ）的氧化主要是细胞表面氧化过程（Wang et al.， 2014； Zhang et al.， 2014），其光合作用产生的O₂分布在细胞壁上，在藻细胞壁的催化作用下，与As（Ⅲ）接触发生生物氧化（Jana et al.， 2015）.这说明藻对As（Ⅲ）氧化是在藻细胞表面进行，藻对 As（Ⅲ）的生物氧化是一个快速的接触氧化过程.

图4表明了培养液中各种无机氮含量变化.在9 d实验过程中，培养液中NH₄ ⁺含量明显上升，第1 d增加速度最快，说明鱼腥藻在缺氮环境中激发了固氮作用，将单质态氮固定并转化为NH₄ ⁺，为其生长提供氮源（Böhme， 1998； Kumar and Bera， 2020）.随着培养时间增加，各处理组中NH₄ ⁺含量缓慢增加，表明当环境中不再缺氮时，鱼腥藻的固氮能力又逐渐减弱，这时鱼腥藻产生的NH₄ ⁺对其固氮能力产生一定抑制作用（Ospina-Betancourth et al.， 2021）.这是由于藻的固氮作用主要是为了满足自身生长所需，当藻不处于缺氮环境时，其固氮作用会减弱.此外，培养液中 As（Ⅲ）浓度越高，NH₄ ⁺含量也越高，说明 As（Ⅲ）在实验设置浓度范围内，会促进鱼腥藻的固氮作用.这可能是由于砷会促进鱼腥藻固氮酶蛋白的编码基因表达 （Chakraborty et al.， 2019）.培养液中也检测出少量NO₃ ^-，但没有检测到NO₂ ^-.

2.3　NH₄ ⁺输入对鱼腥藻氧化As(Ⅲ)的影响

NH₄ ⁺输入对鱼腥藻生长的影响如图5所示.与其他3个处理组（0 mg/L、1 mg/L和45 mg/L）相比，高浓度NH₄ ⁺（234 mg/L）处理组中， 鱼腥藻在接种后的第1 d生长被抑制.在9 d的培养期间，当培养液中NH₄ ⁺浓度从0 mg/L增加至45 mg/L时，藻细胞生长增加了47.11%.添加有234 mg/L NH₄ ⁺处理组中，随着培养时间增加，鱼腥藻逐渐适应了高浓度NH₄ ⁺环境，高浓度NH₄ ⁺对藻生长的抑制效果减弱，在第9 d，藻生长相比于对照组，增加了21.54%.但与NH₄ ⁺浓度为45 mg/L处理组相比较，其生物量减少了17.38 %，说明鱼腥藻生长与NH₄ ⁺浓度相关较弱.NH₄ ⁺的毒性与藻的种类和培养条件有关，在含有不同浓度NH₄ ⁺的人工厌氧消化废水中，蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）处于NH₄ ⁺浓度为350 mg/L条件下时，藻生长急剧下降，当NH₄ ⁺浓度增加到462 mg/L时，藻完全死亡（Zhao et al.， 2019）.螺旋藻（Spirulina platensis）在自养条件下，NH₄ ⁺浓度在100 mg/L时很难生长，200 mg/L时藻细胞完全死亡（Li et al.， 2019）.NH₄ ⁺对藻的毒性主要是由于在高NH₄ ⁺浓度环境下，藻细胞破裂，藻色素和光合作用受损，藻细胞生理生化功能紊乱（Collos and Harrison， 2014）.然而，由图5和图6可知，当NH₄ ⁺浓度由0 mg/L增加至234 mg/L时，NH₄ ⁺仍然促进鱼腥藻生长和色素合成，这表明鱼腥藻存在抵消NH₄ ⁺不利影响的补偿机制.

虽然过量NH₄ ⁺会有一定毒性，但适量的NH₄ ⁺对于缓解重金属毒性也有一定作用.本研究结果表明，NH₄ ⁺从0 mg/L增加至234 mg/L可减轻 As（Ⅲ）对鱼腥藻的生长和色素合成的影响.小球藻（Chlorella vulgaris）暴露于50 μmol/L和100 μmol/L Cr（Ⅳ）时，0.5 mmol/L、3 mmol/L和10 mmol/LNH₄ ⁺都能缓解Cr（Ⅳ）对小球藻生长的抑制作用（Liu et al.， 2015）.但是，NH₄ ⁺缓解砷对微藻的毒性作用鲜有报道.图5和图6显示，当加入45 mg/L NH₄ ⁺时，鱼腥藻的生长、叶绿素a和类胡萝卜素含量分别增加了40.1%、29.1%和41.5%.一方面，由于氮作为藻细胞合成色素所必需的元素，其中铵氮是微藻的最适氮源，促进藻生长和色素合成，减轻砷的毒性.另一方面，As（Ⅲ）的毒性、迁移性均高于As（V），鱼腥藻将As（Ⅲ）氧化为As（V）也被视为藻细胞的一种自我解毒机制（Wang et al.， 2021）.因此，当培养液中加入NH₄ ⁺时，除了促进藻生长外，还会加速As（Ⅲ）生物氧化，减轻As（Ⅲ）对鱼腥藻的毒害作用.当NH₄ ⁺浓度为234 mg/L时，培养液中 1 mg/L As（Ⅲ）在12 h内被完全氧化，而NH₄ ⁺浓度为0 mg/L、1 mg/L和45 mg/L时，培养液中As（Ⅲ）被完全氧化分别需要48 h、36 h和24 h （图7）.随着NH₄ ⁺浓度增加，培养液内总砷浓度随之下降，在不加NH₄ ⁺的处理组，总砷浓度仅下降了5.6%，但NH₄ ⁺浓度为234 mg/L时，总砷下降了32%.

鱼腥藻藻细胞表面吸附砷量如图8所示，细胞表面吸附的砷与环境中NH₄ ⁺浓度呈正相关，表明环境中NH₄ ⁺增加，增加了As（Ⅲ）与藻细胞表面接触，从而加速As（Ⅲ）生物氧化.

准一级和准二级动力学方程拟合得到的吸附速率常数（k ₁，k ₂）和R ²值如表1所示.在不同浓度NH₄ ⁺下鱼腥藻对As（Ⅲ）的吸附过程与准一级和准二级动力学方程均有良好的拟合，说明鱼腥藻在 As（Ⅲ）的吸附过程中，同时存在物理吸附和化学吸附（Dawodu and Akpomie， 2016）.由k ₁和k ₂可知，补充NH₄ ⁺后，鱼腥藻对As（Ⅲ）的吸附速率明显提高.如前文所述，藻对As（Ⅲ）的氧化是藻细胞表面氧化过程，因此，当鱼腥藻对As（Ⅲ）的吸附速率增加时，加速了藻对As（Ⅲ）的吸附，As（Ⅲ）与藻细胞表面的接触增加，最终促进鱼腥藻氧化As（Ⅲ）.

对吸附砷后的藻细胞进行FT-IR光谱（400~ 4 000 cm^-1）表征，确定NH₄ ⁺对鱼腥藻细胞表面官能团的影响（图9）.未添加NH₄ ⁺的藻细胞表面在 3 400~3 500 cm^-1出现宽而强的峰，表明藻细胞表面有羟基（-OH）和胺基（-NH）参与砷的吸附，在1 647 cm^-1、1 555 cm^-1和1 417 cm^-1出现峰值，是由藻细胞表面的酰胺I带中的羰基（C=O）官能团对称和不对称伸缩振动以及胺基（-NH）和-CH₂的伸缩振动引起的（Tabaraki and Heidarizadi， 2018）.在1 047 cm^-1出现的峰是由于醇类和羧酸的C-O官能团伸缩产生.另外，在指纹区的峰则归因于藻的磷酸官能团.

通过比较有无NH₄ ⁺条件下藻细胞表面FT-IR光谱，发现当加入234 mg/L NH₄ ⁺以后，藻细胞表面官能团发生了明显变化，藻细胞在3 450 cm^-1处的不对称伸缩振动转移至3 427 cm^-1，在1 647 cm^-1、 1 555 cm^-1、1 417 cm^-1和1 047 cm^-1出现的峰也移动到1 651 cm^-1、1 554 cm^-1、1 412 cm^-1和1 048 cm^-1，并且在1 189 cm^-1出现了新的峰.这说明NH₄ ⁺加入后藻细胞表面的官能团发生了明显变化，促进了胺基（-NH）、羟基（-OH）、C-O和磷酸官能团在砷吸附过程中的作用，这可能是导致鱼腥藻对砷吸附量增加的原因.

3 结论

（1）鱼腥藻可以耐受一定浓度的亚砷酸盐，其IC₅₀值为15.59 mg/L；鱼腥藻可以在1~2 d内完全氧化As（Ⅲ），即使As（Ⅲ）浓度增加至10 mg/L，在7 d内也能完全被氧化.鱼腥藻通过对As（Ⅲ）氧化作用增加对砷的耐受性，具有修复砷污染天然水体的潜力.

（2）铵氮可以抵消As（Ⅲ）对鱼腥藻生长的抑制作用，同时加速藻对As（Ⅲ）的氧化，增加鱼腥藻对As（Ⅲ）的耐受性.

（3）铵氮输入会导致鱼腥藻表面官能团改变，并提高藻细胞表面的砷吸附能力，从而加速鱼腥藻氧化As（Ⅲ）.

本文研究结果证实，在天然水环境中，铵氮对微藻介导下的砷地球化学过程具有重要影响.为研究砷的生物地球化学循环提供了一定的指示意义.

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(41572230;41172219)

国家自然科学基金创新研究群体项目(41521001)