铁还原菌Shewanella oneidensis MR-1在H₂O₂扰动下的响应及机制

Response and Mechanism of Iron-Reducing Bacterium Shewanella oneidensis MR-1 to Perturbance of H₂O₂

摘要

铁还原菌参与的铁循环是地表系统中物质循环的重要驱动力，自然生成和人工注入地下环境的H₂O₂可能通过氧化胁迫影响铁还原菌的活性和功能，但铁还原菌在H₂O₂扰动下的响应及机制仍不清楚.以铁还原模式菌株Shewanella oneidensis MR-1作为研究对象，结合批实验和转录组测序研究了不同浓度水平H₂O₂扰动下MR-1活性和功能的变化及其调控机制.结果表明，MR-1能够有效抵御H₂O₂的胁迫，且H₂O₂扰动使MR-1的铁还原能力增强.转录组测序表明，H₂O₂使MR-1处于抗应激状态，通过积极氧化有机物供能、促进过氧化氢酶的合成抵御H₂O₂的负面影响.

关键词

铁循环 / 铁还原菌 / 氧化胁迫 / 地质微生物 / 环境地质学

Key words

iron cycling / iron-reducing bacteria / oxidative stress / geological microorganism / environmental geology

0 引言

铁（Fe）是地壳中含量第四的元素，主要以Fe（II）和Fe（III）大量存在于地表环境中（Melton et al.， 2014）.铁还原菌介导的Fe（III）还原调控着沉积环境中污染物的迁移转化和生源元素的运移等过程，是地表系统中物质循环的重要驱动力（Borchet al.， 2010； Li et al.， 2012；胡敏和李芳柏， 2014）.铁还原菌（FeRB）通常为兼性厌氧菌，目前分离到的FeRB有200多株，其活性和功能与环境条件（如氧化还原条件、pH、阴阳离子浓度等）密切相关（Kumar and Riyazuddin， 2012；Zhou et al.， 2013）.虽然铁还原菌通常在厌氧环境中发挥功能，但在自然和人为活动（如地表水-地下水交互、环境工程修复等）的扰动下，铁还原菌可与氧化性物种遭遇，研究该过程中铁还原菌生理生化过程及铁还原能力的变化对于阐明厌氧-好氧界面上的铁循环及其耦合的生物地球化学过程具有重要意义.

过氧化氢（H₂O₂）是自然环境中普遍存在和环境工程修复中常用的活性氧化物质.地表水体中硝酸根/亚硝酸根和溶解性有机质的光化学反应、氧化还原波动带中的还原态物种（Fe（II）等）活化氧气、水生和陆生环境中的很多异养微生物是环境中H₂O₂的天然来源（Vermilyea et al.， 2010；张娜， 2021），国内外研究者在地表水、土壤孔隙水和潜水含水层中均检测到了稳定浓度水平的H₂O₂（nmol/L~μmol/L）（Yuan et al.， 2017）.另外，H₂O₂是环境修复中常用的Fenton高级氧化试剂，土壤和地下水原位修复中注入地下环境的H₂O₂浓度高达mmol~mol（潘玉兰， 2014；Bendouz et al.， 2017），例如，杜勇超等（2011）证明0.5 mol/L H₂O₂是类Fenton试剂氧化降解土壤中PAHs的最佳浓度.铁还原菌广泛存在于地下水、湖泊、土壤等厌氧物体中，例如铁还原模式菌株Shewanella oneidensis MR-1分离自淡水湖（Esther et al.，2015），而研究者在湖泊中监测到了H₂O₂（Wong and Wong，2001），湖泊中的H₂O₂主要源于光化学作用与异养微生物（异养菌、真菌、浮游植物）（Zhang et al.，2016），化学与生物途径产生的H₂O₂都会对铁还原菌造成氧化胁迫，从而影响铁还原菌参与的铁循环及其耦合元素的生物地球化学循环过程，例如将溶解的Cr（VI）还原为毒性和溶解性更小的Cr（III）（毛晖等， 2005）.

虽然H₂O₂对细菌的氧化胁迫及细菌的氧化应激反应已被大量研究（Chen et al.， 2018； Zhang et al.， 2020； 屈婧祎等，2021； 赵淑凤等， 2021），但H₂O₂对地质微生物功能的影响鲜有报道.H₂O₂可进入细胞内部与胞内游离态Fe²⁺发生Fenton反应，产生羟自由基（·OH），从而对细菌DNA、磷脂以及蛋白质造成破坏，导致细菌死亡（Brandi et al.， 1989）.但铁还原菌作为一种兼性菌，可以通过分泌过氧化氢酶等酶类在一定程度上抵御H₂O₂的氧化胁迫，目前对于不同浓度水平H₂O₂扰动对铁还原菌活性的影响仍不清楚.另外，铁还原菌通过胞外分泌核黄素、Mtr呼吸通道传递电子、c-型细胞色素电子传递链等途径还原Fe（III），以上功能的实现通过一系列功能基因（如CymA、MtrA、PpcA等）的调控来完成（Pitts et al.， 2003； Schuetz et al.， 2009；Ma et al.， 2011），而目前H₂O₂扰动下，铁还原菌代谢过程及还原能力的变化还不清楚.

针对以上问题，作者以Shewanella oneidensis MR-1作为铁还原菌的代表，结合室内批实验和转录组测序的研究手段，研究了不同浓度H₂O₂影响下MR-1活菌生长和Fe（III）还原能力的变化，探究了MR-1对H₂O₂的抵御能力，并分析了H₂O₂扰动下MR-1关键功能基因的差异表达，旨在从分子层面阐明铁还原菌应对H₂O₂扰动的响应及机制.

1 材料与方法

1.1　微生物菌株及其培养

Shewanella oneidensis MR-1获取自美国标准菌种保存中心（ATCC）.LB液体培养基（2 g胰蛋白胨，1 g酵母提取物，2 g NaCl，pH=7.0，总体积500 mL）用于Shewanella oneidensis MR-1的活化、培养与保存. LB固体培养基（向500 mL LB液体培养基中加入20 g/L琼脂）用于Shewanella oneidensis MR-1的菌种保存和平板计数.

1.2　试剂

H₂O₂和NaCl购于上海国药集团化学试剂有限公司，二乙基对苯二胺（DPD，97%）购于成都艾科达化学试剂有限公司，胰蛋白胨、酵母提取物购于英国Oxoid公司.过氧化氢酶检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司.本实验中所有溶液均使用18.2 MΩ·cm去离子水配制（Heal Force NW ultrapure water system）.

1.3　实验方法

批实验在100 mL厌氧瓶中进行.首先将50 mL LB液体培养基加入厌氧瓶，随后加入MR-1，使其最终浓度约为1×10⁷ CFU/mL，然后加入不同浓度的H₂O₂（0 μmol、50 μmol、200 μmol、1 000 μmol），并于26 ℃、220 r/min下恒温振荡培养24 h.不同反应时间点取样分析体系中MR-1的活菌数量、剩余H₂O₂浓度和过氧化氢酶的活性.

为探究H₂O₂对MR-1还原Fe（III）能力的影响，在不同浓度H₂O₂（0 μmol、50 μmol、200 μmol、1 000 μmol）与MR-1反应24 h后，向厌氧瓶中吹氮1 h除氧，然后向体系中添加5 mmol水铁矿和10 mmol L-乳酸钠，并于30 ℃、220 r/min的摇床中反应，不同反应时间点取样分析溶解态Fe（II）及总Fe浓度.以上所有实验均重复两次，平行样品的相对偏差小于20%.

1.4　化学分析

采用DPD分光光度法分析H₂O₂浓度.在不同反应时间取2 mL样品，用孔径0.22 μm滤膜过滤后，取1 mL滤液并加入0.4 mL磷酸缓冲盐（pH =6）和20 μL 0.1% DPD溶液，定容至4 mL后，于551 nm处测量吸光度.

利用平板计数法分析MR-1的活菌数量.在不同反应时间，取0.1 mL样品，逐级连续稀释至适当浓度后，取0.1 mL稀释后的样品涂布在固体LB培养基上，每个样品按2~3个浓度梯度进行涂布.涂布后，将培养皿放置于30 ℃恒温培养箱中培养24 h后，对菌落数目进行计数.

利用邻菲罗啉分光光度法测定溶解态Fe（II）浓度.在不同反应时间点取2 mL样品，使用0.22 μm滤膜过滤，取1 mL过滤后的样品，分别加入1 mL乙酸铵缓冲盐和1 mL 0.5%邻菲罗啉溶液，使用紫外分光光度计在510 nm波长处测定吸光度.

采用过氧化氢酶检测试剂盒进行过氧化氢酶（CAT）活性检测.在不同反应时间点取20 μL样品，加入20 μL过氧化氢酶检测缓冲液和10 μL、250 mmol过氧化氢溶液.混匀后加入450 μL过氧化氢酶反应终止液以终止反应.取20 μL已终止并混匀的上述反应体系，加入80 μL过氧化氢酶检测缓冲液，再加入2 mL显色工作液，于25 ℃孵育15 min后使用紫外分光光度计在520 nm波长处测定吸光度.

1.5　转录组测序

采用转录组测序的方式检测H₂O₂扰动后，MR-1基因表达的变化.转录组测序工作由广东美格基因科技有限公司完成.MR-1在含有0 μmol H₂O₂（对照组）和5 μmol H₂O₂的LB培养基（处理组）中培养16 h.采用Trizol法进行样品抽提，并用ThermoNanoDrop One和Agilent 4200 Tape Station进行样品质检；检测合格后，使用EpicentreRibo-Zero rRNA Removal Kit去除核糖体RNA；使用Illumina HiSeq2000进行文库构建.获得原始测序序列（Raw Reads）之后，使用fastp软件对数据进行过滤和质量评估，使用Hisat2将过滤后的reads比对到参考基因组，使用Benjamini & Hochberg法调整p值得到的p.adjust，p.adjust<0.05的|log2（FC）|>1的基因为差异表达基因.使用RSEM计算每个样本read count数目，基于reads count对转录本定量后，采用edgeR进行差异表达分析，从而鉴定样本间表达量发生差异的基因.为了揭示差异基因与哪些生物学功能显著相关，使用clusterProfiler对差异基因的功能和通路进行GO富集分析（GO，http://www.geneontology.org）.p.adjust< 0.05的GO通路被认为显著富集.

2 结果与讨论

2.1　H₂O₂扰动下MR-1活性的变化

不同浓度H₂O₂对MR-1活性的影响如图1所示.MR-1在3 h进入对数生长期，在9 h达到最大生物量.50 μmol H₂O₂对MR-1的生长速率及生物量无显著影响.当H₂O₂浓度增加到200 μmol时，MR-1活菌数量在3 h内使下降了0.29个数量级，当H₂O₂浓度增加到1 000 μmol时MR-1活菌数量下降了3.08个数量级，但3 h后MR-1均能恢复生长.以上结果表明MR-1能有效应对H₂O₂的氧化胁迫，低于50 μmol的H₂O₂不影响MR-1活性，高于200 μmol的H₂O₂虽然会造成细菌的死亡，但剩余细菌在营养充足的条件下可恢复生长至初始水平.

为探究MR-1对H₂O₂的分解能力，分别测定了无菌体系及培养体系中水相H₂O₂的浓度变化.如图2所示，无菌组各浓度水平的H₂O₂在24 h内均无显著降低，说明H₂O₂不会与LB培养基中的有机质发生显著反应，而在MR-1培养体系中H₂O₂浓度快速下降.其中50 μmol和200 μmol H₂O₂在3 h内完全分解，1 mmol H₂O₂在前3 h快速分解76%，在9 h内完全分解.以上H₂O₂的分解趋势与MR-1活菌数量在前3 h下降，随后恢复生长的趋势一致（图1）.H₂O₂分解产生的O₂能作为电子受体维持MR-1生存，但由于实验在敞口体系中进行，H₂O₂分解产生的O₂与空气中的O₂相比浓度较低，不会成为额外的电子受体影响MR-1生长.以上结果表明，MR-1能快速分解H₂O₂以抵御其负面影响.因此，作者进一步检测了不同浓度H₂O₂影响下MR-1体系中过氧化氢酶（CAT）活性的变化.如图3所示，无H₂O₂体系中MR-1的CAT活性在24 h内均维持在较低水平（~1.5 U/mL），H₂O₂的添加显著提升了CAT的活性，当H₂O₂浓度为50 μmol，200 μmol和1 000 μmol时，CAT活性分别增加至5.23 U/mL，7.08 U/mL和8.24 U/mL.以上结果证明MR-1能通过分泌CAT快速分解H₂O₂抵御其负面影响，因此低浓度H₂O₂对MR-1活性无显著影响，高浓度H₂O₂虽然在初期会造成部分MR-1死亡，但在H₂O₂被CAT完全分解后MR-1仍可恢复生长.

2.2　H₂O₂扰动下MR-1铁还原功能的变化

为探究H₂O₂对MR-1铁还原能力的影响，对比了经不同浓度H₂O₂处理24 h后MR-1对Fe（III）的还原能力.如图4所示，未经H₂O₂影响的MR-1在24 h内还原了75%的Fe（III），而受H₂O₂影响后的MR-1的Fe（III）还原能力反而得到了增强，50 μmol、200 μmol和1 mmol H₂O₂处理后的MR-1分别能在24 h内还原89%、86.4%、85.8%的Fe（III）.以上结果表明，虽然H₂O₂对MR-1前期的生长起阻滞作用，但当MR-1恢复生长至相近生物量后，其还原Fe（III）的能力反而得到了增强.应对H₂O₂扰动时，MR-1代谢过程可能发生改变，导致MR-1的代谢产物发生变化，丙酮酸等代谢产物可作为Fe（III）还原过程电子供体，代谢产物的组分和含量的差异可能导致MR-1铁还原能力的变化.

2.3　MR-1对H₂O₂扰动响应的分子机制

由于MR-1的抗氧化应激能力，低浓度H₂O₂不会引起MR-1生长的显著变化，但可能引起MR-1的代谢和铁还原功能的改变.为了阐明MR-1对H₂O₂扰动响应的分子机制，作者选择了贴近自然环境、不会引起细菌显著死亡的5 μmol作为H₂O₂代表浓度进行转录组测序，分析H₂O₂扰动后MR-1功能基因的差异性表达.统计结果显示，具有显著表达差异的基因共有211个，其中144个基因显著上调，67个基因显著下调，其中差异表达最显著的30个基因如表1所示.

值得注意的是，H₂O₂扰动后，MR-1的碳饥饿蛋白A（carbon starvation protein A）调控基因显著上调，碳饥饿蛋白会使细菌处于抗应激状态，对营养物质高度敏感，蛋白质合成速度提升，这意味着在面临H₂O₂扰动时MR-1处于氧化应激状态，且能通过积极合成碳饥饿蛋白提升MR-1摄取营养的能力，有利于包括过氧化氢酶在内的多种抗氧化应激酶的合成.以上结果说明，H₂O₂的胁迫使MR-1处于氧化应激状态，为抵抗H₂O₂的负面影响，碳饥饿蛋白A的合成得到促进，使MR-1积极摄取能量，并分泌过氧化氢酶对细胞内出现的多余H₂O₂进行淬灭，从而应对氧化应激以维持细菌生长.

MR-1对H₂O₂扰动的响应包括多种代谢通路的变化.为了探究H₂O₂对MR-1代谢通路的影响，利用GO数据库将差异基因分为分子生物功能（Molecular function）、生物过程（Biological process）和细胞组分（Cellular Components）三类.其中生物过程中有44个GO通路显著富集，分子生物功能中有3个GO通路显著富集，富集最显著的20个GO通路如表2所示.GO通路富集结果表明，H₂O₂扰动后，MR-1有机酸代谢过程（谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸、组氨酸、丝氨酸等）调控基因明显上调（图5a），表明MR-1更积极地利用LB培养基中有机质底物，通过氧化有机物释放大量的能量（图5b），这与碳饥饿蛋白调控基因明显上调的现象一致，此外，MR-1核苷酸代谢过程也表现得更积极（图5c），表明MR-1体内的产能代谢更加活跃，这意味着MR-1产生大量能量用于应对H₂O₂扰动导致的氧化应激并维持细菌的生长.综上所述，在H₂O₂的影响下，MR-1代谢有机物的能力提升以应对的H₂O₂扰动带来的负面影响并维持MR-1生长.

3 结论

（1）MR-1在H₂O₂胁迫下处于抗应激状态，通过促进过氧化氢酶的合成分解H₂O₂抵御氧化胁迫，低浓度H₂O₂（<50 μmol）不影响MR-1活性，高浓度H₂O₂（>200 μmol）虽然会造成细菌的部分死亡，但H₂O₂被CAT分解完全后剩余细菌在营养充足的条件下可恢复生长至初始水平.

（2）H₂O₂扰动促进了MR-1代谢有机物的能力，提供能量用于MR-1应对氧化应激与维持生长.

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基金资助

国家自然科学基金项目(41703113;42025703)