基于SCF/c-kit信号通路探讨理气通便方对气滞型慢传输型便秘大鼠肠道动力的影响

Effect of Liqi Tongbian Formula on Intestinal Motility in Slow Transit Constipation Rats with Qi Stagnation Syndrome Based on SCF/c-kit Signaling Pathway

摘要

目的 基于SCF/c-kit信号通路探讨理气通便方对气滞型慢传输型便秘（STC）大鼠肠道动力的影响。 方法 将36只Wistar雌性大鼠按随机数字表法分为对照组6只和造模组30只。造模组采用“洛哌丁胺混悬液＋夹尾刺激”复制气滞型STC大鼠模型，连续刺激14 d。当大鼠表现出激惹、易怒、烦躁等情况，正常喂养饲料时出现大便干硬、排便数量减少等表现时，说明气滞型便秘模型造模成功。将造模成功的大鼠按照随机数字表法分为模型组、西药组、低剂量组、中剂量组和高剂量组各6只，低、中、高剂量组分别按5.15、10.3、20.6 g/（kg·d）给予理气通便方药液灌胃；西药组按0.18 mg /（kg·d）给予琥珀酸普芦卡必利片混悬液灌胃；对照组和模型组按10 mL/（kg·d）给予无菌水灌胃，每日1次，连续灌胃14 d。比较6组末次给药后6 h的粪便排出量、粪便含水量和小肠推进率；HE染色观察结肠组织病理变化；免疫组化检测结肠组织c-kit蛋白表达水平；Western blot检测结肠组织c-kit、SCF蛋白表达量。 结果 HE染色显示：对照组大鼠结肠黏膜完整，杯状细胞和腺体排列整齐，未见炎症细胞聚集；模型组结肠黏膜出现肠腺排列欠整齐，黏膜下层间质血管扩张；各给药组结肠黏膜肠腺排列整齐，未观察到明显上皮损伤。与对照组比较，模型组粪便排出量、粪便含水量和小肠推进率均明显降低（P＜0.05），结肠组织c-kit蛋白表达水平和c-kit、SCF蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，西药组、中剂量组、高剂量组粪便排出量、粪便含水率和小肠推进率均明显提高（P＜0.05），低剂量组粪便排出量和粪便含水率均明显提高（P＜0.05）；给药组结肠组织c-kit蛋白表达水平均明显提高（P＜0.05）；低、中、高剂量组结肠组织c-kit蛋白表达量均明显提高（P＜0.05），高剂量组SCF蛋白表达量明显提高（P＜0.05）。 结论 理气通便方可提高气滞型STC模型大鼠结肠组织中ICC的表达及调控SCF/c-kit信号通路，恢复对胃肠道节律的正常调控来改善便秘的症状。

Abstract

Objective To investigate the effect of Liqi Tongbian formula on intestinal motility in slow transit constipation (STC) rats with Qi stagnation syndrome based on SCF/c-kit signaling pathway. Methods Thirty-six female Wistar rats were divided into control group (n=6) and modeling group (n=30) using the random number table method. In the modeling group, "loperamide suspension + tail pinch stimulation" was used to replicate the STC rats with Qi stagnation syndrome model for 14 days. Successfully modeled rats were randomly divided into model group, western medicine group, low-dose group, medium-dose group, and high-dose group, with 6 rats in each group. the low-, medium-, and high-dose groups were administered with Liqi Tongbian formula solution by gavage at doses of 5.15, 10.3, and 20.6 g/(kg·d), respectively; the western medicine group was administered with Prucalopride succinate suspension by gavage at doses of 0.18 mg/(kg·d); the control and model groups were given sterile water by gavage at doses of 10 mL/(kg·d), once a day, continuously gavage for 14 days. The quantity of fecal excretion, fecal water content, and small intestine propulsion rate were detected 6 hours after the last administration; the pathological changes of colon tissue was observed by HE staining; the tyrosine kinase growth factor receptor (c-kit) protein expression level of colon tissue was measured by immunohistochemistry; the c-kit and stem cell factor (SCF) protein expression of colon tissue was measured by Western blot. Results HE staining showed that the colonic mucosa of rats in the control group was intact, with well-arranged cup cells and glands, and no aggregation of inflammatory cells was observed; in the model group, the colonic mucosa appeared to have poorly arranged intestinal glands, and the submucosal mesenchymal vasculature was dilated; in each of the administered groups, the intestinal glands of the colonic mucosa were well-arranged, and no obvious epithelial damage was observed. Compared with the control group, the quantity of fecal excretion, fecal water content, and small intestine propulsion rate in the model group significantly decreased (P<0.05), and the expression level of c-kit protein and the expression of c-kit and SCF proteins in colonic tissues significantly decreased (P<0.05). Compared with the model group, the quantity of fecal excretion, fecal water content, and small intestine propulsion rate significantly increased in the western medicine, medium-dose, and high-dose groups (P<0.05); the quantity of fecal excretion, fecal water content significantly increased in the low-dose group (P<0.05); the expression level of c-kit protein in colonic tissues of the administered groups all significantly increased (P<0.05); the expression of c-kit protein in colonic tissues of the low-, medium- and high-dose groups all significantly increased (P<0.05), and the expression of SCF protein in the high-dose group significantly increased (P<0.05). Conclusion Liqi Tongbian formula can increase the expression of ICC and regulate the SCF/c-kit signaling pathway in the colon tissue of STC rat models with Qi stagnation syndrome, thus restoring the normal regulation of gastrointestinal rhythm to improve the symptoms of constipation.

Graphical abstract

关键词

慢传输型便秘 / 气滞 / 理气通便方 / ICC / SCF/c-kit信号通路

Key words

slow transit constipation / Qi stagnation / Liqi Tongbian formula / interstitial cells of Cajal / SCF/c-kit signaling pathway

慢传输型便秘（slow transit constipation，STC）是临床上常见的肠道动力障碍性疾病，主要以结肠传输能力减弱和传输速度减慢为特点，临床主要表现为排便次数减少（＞3 d/次），粪便干结^［1］。已有研究表明：Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICC）异常是STC发病机制之一，ICC是胃肠道的起搏细胞，也是肠神经递质作用的靶细胞，结肠ICC数量减少以及结构、功能异常会导致电慢波活动缺失，影响结肠收缩反应，进而导致传输延迟^［2］。酪氨酸蛋白激酶生长因子受体（tyrosine kinase growth factor receptor，c-kit）作为ICC的特异性表达标志物，能够与干细胞因子（stem cell factor，SCF）相结合，激活SCF/c-kit信号通路，调节Cajal间质细胞的增殖与分化，进而调节胃肠道的运动^［3］。中医药在治疗STC方面具有巨大的潜力，其药理学作用主要是调节胃肠道神经递质，促进肠道蠕动，达到理气通便的效果^［4］。前期研究表明：理气通便方可改善气滞型STC患者的临床症状，提高结肠传输功能，临床疗效显著^［5-6］，但其作用机制尚未清楚。因此本实验通过建立气滞证STC大鼠模型，观察理气通便方对于肠道动力的作用机制，为临床推广提供实验数据。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级6周龄雌性Wistar大鼠36只，体质量（150±20）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0008。饲养于福建中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007。动物房内温度22～25 ℃，相对湿度40％～60％，并保持12 h昼夜交替，自由获得食物和水，适应性饲养１周。本研究已通过福建中医药大学动物伦理委员会批准（FJTCM IACUC 2022067）。

1.2 实验药物

理气通便方由厚朴10 g，枳实10 g，火麻仁15 g，郁李仁10 g，瓜蒌仁15 g，炒莱菔子10 g，北柴胡9 g，白芍12 g，陈皮9 g，芒硝3 g组成，购自福建中医药大学附属第二人民医院中药房。以上10味药取10倍剂量加8倍量水浸泡0.5 h后煎煮3次，分别煎煮1.5、1、0.5 h，混合3次煎液，滤过，滤液在60～70 ℃减压浓缩至1 000 mL，分装灭菌，配置生药含量为2.06 g/mL的理气通便方药液^［7］。取15粒盐酸洛哌丁胺胶囊（西安杨森制药有限公司，产品批号：H10910085）粉末，加无菌水定容至30 mL，即得浓度为1 mg/mL的洛哌丁胺混悬液；取4片琥珀酸普芦卡必利片（江苏豪森药业集团有限公司，产品批号：H20183482）进行研磨，加无菌水定容至10 mL，即得浓度为0.18 mg/mL的琥珀酸普芦卡必利片混悬液。

1.3 实验试剂

c-kit抗体（货号：ABP55025）、GAPDH抗体（货号：ABL1021）均购自美国Abbkine公司；SCF抗体（货号：24894）、anti-Rabbit IgG二抗（货号：L3012）均购自美国SAB公司；免疫显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司，货号：20190020、20190028）；4%多聚甲醛组织固定液（安徽白鲨生物科技有限公司，货号：BL539A）；苏木素染色液（货号：H8070）、伊红染色液（货号：G1100）均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.4 实验仪器

石蜡包埋机（湖北锦源医疗科技有限公司，型号：JY-BMC）；石蜡切片机（型号：RM2235）、半自动化正立式金相显微镜（型号：DM4000）均购自德国Leica公司；高速大容量离心机（赛默飞世尔科技有限公司，型号：75004250）；转移电泳槽（型号：VE-186）；直电泳槽（型号：VE-180C）均购自上海天能生命科学有限公司；超灵敏多功能成像仪（美国Cytiva公司，型号：Amersham Image Quant 800）。

2 实验方法

2.1 分组与造模

将36只Wistar雌性大鼠依据体质量按随机数字表法分为对照组6只和造模组30只。造模组按3 mg/kg予洛哌丁胺混悬液灌胃复制STC模型，每日灌胃1次；同时配合夹尾刺激法复制气滞证模型，每日定时定点刺激1次，每次刺激30 min，连续灌胃和刺激14 d。当大鼠表现出激惹、易怒、烦躁等情况，正常喂养饲料时出现大便干硬、排便数量减少等表现时，说明气滞型便秘模型造模成功^［7］。采用随机数字表法将造模成功的大鼠分为模型组、西药组、低剂量组、中剂量组和高剂量组各6只，相同条件下分笼饲养，自由饮食饮水。

2.2 干预方法

低、中、高剂量组分别按5.15、10.3、20.6 g/（kg·d）给予理气通便方药液灌胃；西药组按0.18 mg /（kg·d）给予琥珀酸普芦卡必利片混悬液灌胃；对照组和模型组按10 mL/（kg·d）给予无菌水灌胃，每日1次，连续灌胃14 d。干预期间，造模组仍继续给予“洛哌丁胺混悬液灌胃＋夹尾刺激”以维持气滞型STC模型稳定，直至取材处死。

2.3 取材

于末次灌胃结束后，予禁食不禁饮24 h，经5%异氟醚吸入麻醉后处死。收集大鼠结肠组织，将一部分结肠组织装入冻存管后立即放入液氮中，随后再转到-80 ℃冰箱中保存用于Western blot实验；一部分结肠组织置于4％的多聚甲醛溶液中固定48 h后进行梯度酒精脱水，用于HE染色和免疫组化实验。

2.4 观察指标

2.4.1 粪便排出量及粪便含水率

收集6组大鼠末次给药后6 h的粪便，记录排便数量，并测其含水率。

粪便含水率＝\frac{\mathrm{湿粪}\mathrm{重量}-\mathrm{干粪}\mathrm{重量}}{\mathrm{湿粪}\mathrm{重量}}×100%

2.4.2 小肠推进率测定

最后一次给药后，均禁食不禁饮12 h，取材前每只大鼠给予灌胃10%活性炭混悬液3 mL，10 min后进行麻醉，剪开腹壁，分离出从胃到盲肠的全部小肠，测量活性炭在肠道内的推进长度及小肠全部长度，计算活性炭推进率，即小肠推进率。

小肠推进率＝炭末向前推进长度/小肠全长×100%

2.4.3 HE染色观察结肠组织病理变化

4%多聚甲醛固定结肠组织，随后进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。石蜡标本连续切片，切片厚度约4 µm，采用HE染色，染色封片后在显微镜下观察组织病理学变化，并采用显微成像系统拍照记录。

2.4.4 免疫组化法检测结肠组织c-kit蛋白表达水平

结肠组织包埋后将组织切成厚度约为4 μm的组织切片，并对组织块进行抗原修复、封闭后，滴加c-kit抗体（1∶100），4 ℃孵育过夜。二抗孵育后，按DAB试剂盒说明书操作，对各切片进行DAB显色处理，经封片后在400倍镜下每份样本随机选取5个视野，获取图像，c-kit阳性表达呈现棕黄褐色者，采用ImageJ定量分析阳性细胞面积。

2.4.5 Western blot检测结肠组织SCF、c-kit蛋白表达量

取结肠肌层组织用组织裂解液提取蛋白并收集蛋白，BCA法测定蛋白质含量。提取的蛋白经变性、电泳、转膜、封闭后，置于SCF（1∶500）、c-kit（1∶500）、GAPDH（1∶10 000）一抗中4 ℃震荡过夜，TBST溶液洗涤后，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000）于37 ℃下孵育1 h，TBST溶液洗涤后，加入ECL发光液，应用凝胶成像系统扫描，采用 ImageJ 软件分析相对灰度值。

2.5 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐则采用Games-Howell检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 6组粪便排出量、粪便含水率、小肠推进率比较

实验过程中，未发现大鼠死亡，表明本实验的造模方法和用药的安全可靠。与对照组比较，模型组粪便排出量、粪便含水率和小肠推进率均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，西药组、中剂量组、高剂量组粪便排出量、粪便含水率和小肠推进率均明显提高（P＜0.05），低剂量组粪便排出量和粪便含水率均明显提高（P＜0.05）。见表1。

3.2 6组结肠组织病理形态学比较

对照组大鼠结肠黏膜完整，杯状细胞和腺体排列整齐，未见炎症细胞聚集；模型组结肠黏膜出现肠腺排列欠整齐，黏膜下层间质血管扩张；各给药组结肠黏膜肠腺排列整齐，未观察到明显上皮损伤。见图1。

3.3 6组结肠组织c-kit蛋白表达水平比较

与对照组比较，模型组的c-kit阳性表达较为稀疏，着色较浅，阳性细胞面积表达降低（P＜0.05）。与模型组比较，给药组c-kit蛋白表达水平明显提高（P＜0.05）。见图2、图3。

3.4 6组结肠组织c-kit、SCF蛋白表达量比较

与对照组比较，模型组结肠组织c-kit、SCF蛋白表达量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组结肠组织c-kit蛋白表达量均明显提高（P＜0.05），高剂量组SCF蛋白表达量明显提高（P＜0.05）。见图4、图5。

4 讨　论

STC可归属于中医学“大便难”“不大便”“便秘”等范畴。STC病位在大肠，或责气机不遂，或缘胃肠积热，或因寒邪内阻，或由气血不足，或咎阳气亏损，或归阴津亏耗，其病涉及八纲^［5］。便秘的病机主要在于大肠传导功能失职，气机升降出入失常，影响肠道传输，导致糟粕内停，最终发展为便秘^［8］。理气通便方是在国医大师杨春波教授“理气通降”学术思想指导下，由柯晓教授创立的经验方^［9］。方中君以厚朴行气除满，枳实消食导滞；臣以火麻仁、郁李仁润肠行舟，柴胡与白芍调肝疏郁；佐以芒硝润燥软坚，瓜蒌仁宣肺润肠；使以炒莱菔子降气除满，陈皮理气消胀。研究结果显示：造模后，模型组6 h粪便排出量和含水率明显减少，小肠推进率明显降低，经理气通便方和琥珀酸普芦卡必利片干预后，气滞型STC大鼠6 h粪便排出量和含水率明显增加，小肠推进率明显增高，提示理气通便方可改善气滞型STC大鼠排便情况和肠道推进率，效果与琥珀酸普芦卡必利片相当。

ICC是一种独特的间质细胞，存在于肠神经系统和平滑肌之间，对于胃肠电活动的传播和胃肠道神经递质信号的转导起着重要的作用^［10］。c-kit是一种位于ICC细胞膜上的跨膜糖蛋白，可作为胃肠道ICC的特异性标志物，能直接反映ICC数量和密度^［11］。c-kit作为SCF的受体，二者相结合后可启动一系列信号传导。SCF/c-kit通路可调控 ICC的生长发育与表型维持，对ICC细胞膜极化和起搏器活性起着关键的作用，并且SCF/c-kit通路上相关蛋白表达的降低与ICC的减少有着密切关系^［12］。也有研究表明：SCF/c-kit通路表达异常会引起结肠慢波节律紊乱，平滑肌收缩活动减缓，使肠道动力下降^［13］。

研究结果显示：应用“洛哌丁胺混悬液+夹尾刺激”复制气滞型STC大鼠模型，降低大鼠ICC的表达并阻碍SCF/c-kit信号通路的传导，进而影响结肠起搏电信号的传导，导致平滑肌运动减慢。理气通便方能提高气滞型STC大鼠结肠组织ICC表达及SCF、c-kit蛋白表达，重新激活SCF/c-kit信号通路，改善结肠动力水平，缓解便秘症状。因此，理气通便方可能是通过调节SCF/c-kit信号通路来恢复ICC对胃肠道节律的正常调控，从而治疗气滞型STC。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82274282)

福建省自然科学基金项目(2021J01878)

中央引导地方科技发展资金项目(2023L3013)