紫白膏促进创面修复的作用及机制研究

Effect and Mechanism of Zibai Ointment in Promoting Wound Repair

摘要

目的 探究紫白膏促进大鼠创面修复的作用及可能机制。 方法 ① 动物实验：采用外科创面结合金黄色葡萄球菌感染建立大鼠红肿创面模型。将造模成功的大鼠随机分为空白组、凡士林组和紫白膏组，每组7只。凡士林组外用凡士林，紫白膏组外用紫白膏，涂抹量均为3 g；空白组不做处理。创面清洁包扎防治感染，每天进行换药至创面完全愈合。观察3组大鼠创面色泽、质地，测量创面面积。待创面完全恢复后将大鼠脱颈处死，剥离新生的组织。RT-qPCR检测大鼠创面组织血管内皮细胞生长因子（VEGF）和血管生成素-1（Ang-1）mRNA相对表达水平。② 细胞实验：将HUVEC细胞分为DMSO组、1 mg/mL组、5 mg/mL组和10 mg/mL组，DMSO组用DMSO溶液干预，1、5、10 mg/mL组分别用1、5、10 mg/mL紫白膏混悬液干预，均干预48 h。MTT法检测干预12、24、48 h后细胞活力；划痕愈合实验检测细胞迁移能力；Transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力；RT-qPCR检测HUVEC细胞VEGF和Ang-1 mRNA相对表达水平。 结果 ① 动物实验：与空白组和凡士林组比较，紫白膏组治疗第4天后创面面积均明显缩小（P＜0.05）。与空白组比较，凡士林组和紫白膏组VEGF和Ang-1 mRNA相对表达水平明显升高（P＜0.05）；与凡士林组比较，紫白膏组VEGF和Ang-1 mRNA相对表达水平明显升高（P＜0.05）。② 细胞实验：与DMSO组比较，1 mg/mL组干预12、24、48 h后活力明显提高（P＜0.05），5、10 mg/mL组干预12、24、36、48 h后细胞活力明显提高（P＜0.05）。与DMSO组比较，1、5、10 mg/mL组细胞迁移率明显升高（P＜0.05），侵袭和迁移的细胞计数明显增多（P＜0.05），VEGF和Ang-1 mRNA相对表达水平明显升高（P＜0.05）。 结论 紫白膏通过促进创面血管生成，从而加速创面愈合。

Abstract

Objective To explore the effect and mechanism of Zibai ointment in promoting wound repair in rats. Methods 1) animal experiment: a full-layer incision was made on the back of the rats and staphylococcus aureus was used to establish the wound redness and swelling model. The rats with successful modeling were randomly divided into blank group, vaseline group and Zibai ointment group, with 7 rats in each group. The vaseline group was externally coated with vaseline, and the Zibai ointment group was externally coated with Zibai ointment, with a dosage of 3 g. The wound was cleaned and bandaged to prevent infection, and dressing was changed daily until the wound was completely healed. The color and texture of the wound were observed, and the area of the wound was measured. The mRNA expression level of vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietin-1 (Ang-1) was detected by RT-qPCR. 2) Cells experiment: HUVEC cells were divided into DMSO group, 1 mg/mL group, 5 mg/mL group, and 10 mg/mL group. The DMSO group was intervened with DMSO solution, while the 1, 5, and 10 mg/mL groups were intervened with 1, 5, and 10 mg/mL Zibai ointment paste suspension, respectively, for 48 hours. MTT assay was used to detect the cells viability after 12, 24 and 48 hours of intervention; the cell migration ability was detected by scratch healing test; the transwell migration and invasion assay was used to detect the migration and invasion ability of cells; the mRNA expression level of VEGF and Ang-1 was detected by RT-qPCR. Results 1) animal experiment: Compared with the blank group and vaseline group, the wound area of Zibai ointment treatment group significantly decreased after 4 days of treatment (P<0.05). Compared with the blank group, the mRNA expression level of VEGF and Ang-1 in vaseline and Zibai ointment groups significantly increased (P<0.05). Compared with the vaseline group, the mRNA expression level of VEGF and Ang-1 in Zibai ointment group significantly increased (P<0.05). 2) Cell experiment: Compared with the DMSO group, the cells viability of 1 mg/mL group significantly increased after intervention for 12, 24 and 48 hours (P<0.05), and 5, 10 mg/mL groups significantly increased after intervention for 12, 24, 36, and 48 h (P<0.05). Compared with the DMSO group, the cell migration rate in 1, 5 and 10 mg/mL groups significantly increased (P<0.05); the number of cells attacked and migrated significantly increased (P<0.05); the mRNA expression level of VEGF and Ang-1 mRNA significantly increased (P<0.05). Conclusion Zibai ointment can accelerate wound healing by promoting wound angiogenesis.

Graphical abstract

关键词

创面修复 / 紫白膏 / 血管生成 / 划痕愈合 / 侵袭 / 迁移

Key words

wound repair / Zibai ointment / angiogenesis / scratch healing / invasiveness / migration

创面愈合受多种因素影响，其中肉芽组织形成较为关键，肉芽组织内含有毛细血管和成纤维细胞，促进毛细血管再生和血管网形成是加速创面愈合的关键^［1-2］。大量新生毛细血管可充实肉芽组织，进而改善创面微循环，有利于创面愈合^［3-4］。紫白膏是国医大师陈民藩教授基于“煨脓长肉”理论创立的经验方，为肛肠科常用外用药，具有清热利湿、活血止痛、消肿生肌等功效^［5-7］，临床上主要用于治疗痔、瘘、裂等肛周疾病及肛肠手术后并发症，可有效控制术后创面炎症反应、镇痛和缩短创面愈合时间^［8-10］，但其是否通过影响创面毛细血管新生来促进创面愈合，尚不清楚。因此，本研究通过外科创面结合金黄色葡萄球菌感染建立大鼠红肿创面模型，采用划痕愈合、Transwell小室、MTT等细胞实验从创面微环境与血管新生的角度探究紫白膏促进创面愈合的作用机制，为其进一步开发利用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验细胞和动物

HUVEC细胞购自上海生命科学院细胞所。8周龄雄性大鼠，体质量180～200 g，购自江苏悟空生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）20230008。大鼠饲养在福建中医药大学动物实验中心动物房，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2014-0005。室内灯光保持12 h开/关状态模拟昼夜变化。

1.2 实验试剂

DMEM高糖培养基（南京凯基生物科技有限公司，批号：KGM12800-500）；胎牛血清（南京诺唯赞生物科技有限公司，批号：f101-01）；TriZol试剂（批号：A5A0487）、RT-qPCR试剂盒（批号：A5A1866）购自艾克瑞生物科技有限公司；异氟烷（鲁南贝特制药有限公司，批号：20221004）；金黄色葡萄球菌（实验室保藏）。

1.3 实验仪器

通用型小动物麻醉机R500（深圳市瑞沃德生命科技公司）；超净工作台（江苏金净净化设备科技有限公司）；实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司，型号：480Ⅱ型）；高速冷冻离心机（日本Hitachi公司）。

2 方　法

2.1 动物实验

2.1.1 造模

采用通用型小动物麻醉机麻醉大鼠，应用硫化钠进行大鼠背部脱毛，在大鼠背部做2个直径约2 cm的圆形全层皮肤创面（深达筋膜），创面相隔约3 cm。创面点状注射1.67×10⁹ CFU/mL的金黄色葡萄球菌稀释液0.6 mL，连续注射2 d。观察创面见伤口红肿有黄脓性分泌物，同时取伤口分泌物，涂布至载玻片，显微镜下观察到金黄色葡萄球菌，即为大鼠红肿创面模型造模成功。随后大鼠根据创面面积随机分为空白组、凡士林组及紫白膏组，每组7只。

2.1.2 干预

大鼠造模后，每天均以碘伏消毒，凡士林组外用凡士林，紫白膏组外用紫白膏，涂抹量均为3 g；空白组不做处理。创面清洁包扎防治感染，每天进行换药至创面完全愈合。

2.1.3 创面愈合情况观察

观察并比较3组干预后0、1、4、7、10、13 d大鼠创面色泽、质地，并测量其创面面积。待创面完全恢复后将大鼠脱颈处死，剥离新生的组织用于后续实验。

2.2 细胞实验

2.2.1 细胞分组和干预

应用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基培养HUVEC细胞。将HUVEC细胞分为DMSO组、1 mg/mL组、5 mg/mL组和10 mg/mL组，DMSO组用DMSO溶液干预（100 µL培养基加入5 µL DMSO），1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL组分别用1、5、10 mg/mL紫白膏混悬液干预。

2.2.2 MTT实验

生长对数期HUVEC细胞以2×10³个/孔的细胞密度接种至96孔板，每组设5个复孔，培养24 h。按“2.2.1”下分组和干预方法分别干预12、24、48 h后，加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液，置于培养箱中培养4 h，弃上清液，每孔加入150 µL DMSO溶液，避光在摇床上轻微振摇5 min。使用酶标仪于波长490 nm测定吸光度值（OD），计算细胞活力。

细胞活力＝实验组OD值/对照组OD值×100%

2.2.3 划痕愈合实验

将生长对数期HUVEC细胞以3×10⁵个/孔的细胞密度铺板于24孔板，按“2.2.1”下分组和干预方法培养，待细胞密度达到80%以上的均匀单层细胞，用无菌的10 μL枪头在孔内快速竖直划过，得到2～3处划痕。用DMEM高糖培养基轻轻洗去划痕造成的细胞碎片，再加入含1%胎牛血清的DMEM高糖培养基继续培养。测量划痕后0.5 h的划痕间距（S_{0 h}），观察划痕后0.5、48 h的细胞划痕情况并拍照，测量划痕间距（S）。每组设3个复孔，每孔随机选择3个位置，取平均值，计算细胞迁移率。

细胞迁移率＝（S_{0 h}－S）/S_{0 h}×100%

2.2.4 Transwell小室实验

对数期生长HUVEC细胞按4×10⁴个/孔的细胞密度接种至24孔板，培养12 h后，按“2.2.1”下分组和干预方法孵育24 h，开展侵袭和迁移实验。

2.2.4.1 侵袭实验

在消化细胞前3 h，在冰上将matrigel胶包被Transwell小室，按照1∶6的比例配制用双无DMEM培养基稀释的matrigel胶储液，在Transwell侵袭小室中均匀铺60 μL/孔的matrigel胶稀释液，放置培养箱中等待凝固。向24孔板中加入含800 μL 5%胎牛血清的DMEM培养基，将小室用干净镊子取出并放入孔中，再向小室中加入1×10⁵/个的细胞密度悬液200 μL，继续培养48 h，取出小室，以多聚甲醛固定20 min，接着用1%的结晶紫染液染色20 min。染色完成后用PBS将染料漂洗干净，在显微镜下每个小室随机选取5个视野观察，拍照并进行统计学分析。

2.2.4.2 迁移实验

准备24孔板在其对应孔中加入800 μL含5 %胎牛血清的DMEM培养基，然后用镊子夹取小室轻放入下室，再向上室中缓慢加入200 μL含有1×10⁵/个细胞的单细胞悬液，在37 ℃、5% CO₂环境下培养24 h，取出小室并弃去培养基，以棉签将小室表面的细胞擦去，小室以多聚甲醛固定15 min，待晾干后用0.5%结晶紫染液染色30 min；随后以PBS漂洗干净小室，置显微镜下选取5个视野进行观察并统计细胞数目。

2.2.5 RT-qPCR检测血管生成相关因子mRNA相对表达水平

用TriZol法分别提取大鼠创面组织和HUVEC细胞的总RNA进行逆转录，获得cDNA。反应体系：cDNA模板1 μL，上游、下游引物各0.3 μL，2×ChamQ SYBR qRT-PCR Green Master Mix 5 μL，DEPC水3.4 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，循环数40个。RT-qPCR反应数据以循环阈值（Ct）记录，实验数据利用2^-ΔΔCt法进行计算，用GAPDH作为内参对照。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列见表1。

2.3 统计学方法

采用Graphad Prism 8.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，两两比较采用LSD-t检验；方差不齐采用Dunnett's T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 动物实验结果

3.1.1 3组大鼠创面愈合情况比较

与空白组和凡士林组比较，紫白膏组在治疗第4天后创面面积均明显缩小（P＜0.05）。见表2、图1。

3.1.2 3组大鼠创面组织VEGF、Ang-1 mRNA相对表达水平比较

见图2。

3.2 细胞实验结果

3.2.1 4组HUVEC细胞不同干预时间细胞活力比较

MTT结果显示随着浓度升高，紫白膏促进HUVEC细胞增殖的能力，未对HUVEC细胞展现出明显的毒性，见表3。

3.2.2 4组HUVEC细胞迁移能力比较

划痕48 h后，以0 h为基准，各浓度紫白膏组愈合能力较对照组明显增强（P＜0.05）。见图3、图4。

3.2.3 4组HUVEC细胞侵袭和迁移能力比较

与对照组比较，紫白膏组发生迁移和侵袭的细胞数目明显增多（P＜0.05）。见图5、图6。

3.2.4 4组HUVEC细胞VEGF、Ang-1 mRNA相对表达水平比较

见图7。

4 讨　论

紫白膏为中药复合物，其主要成分为紫草、大黄、煅石膏、白及、冰片等，具有清热利湿、消肿生肌等功效，众多研究表明紫白膏用于痔术患者后，可显著减少并发症，促进创面愈合^［11-12］。创面愈合的关键是形成新的肉芽组织，新生血管可为创面组织提供营养和氧气，从而加速创面的愈合，因此调节新生血管的形成是调控创面愈合速度的重要因素之一^［13］。VEGF是血管新生的主要贡献因子，其可增加创面中毛细血管的数量^［14］。本研究结果显示：紫白膏组创面色泽呈淡红色，结痂速度较快。与对照组比较，紫白膏可明显促进红肿创面的愈合，创面组织VEGF、Ang-1 mRNA相对表达水平均明显提高，表明紫白膏极有可能促进了大鼠创面处血管新生，从而加速创面愈合。通过HUVEC细胞实验发现：紫白膏促进血管内皮细胞增殖，提高其侵袭、迁移能力，并促进血管内皮细胞分泌血管生成关键因子的表达。

综上所述，紫白膏可促进血管内皮细胞增殖，提高其侵袭、迁移能力，促进血管内皮细胞分泌相关细胞因子，从而促进血管生成，修复创面组织。但紫白膏促进血管新生的具体机制还有待进一步揭示，后续研究可通过对创面组织进行高通量测序，聚焦血管生成的主要调控基因，挖掘差异基因；构建过表达或敲降差异基因的HUVEC稳转细胞系进行验证，揭示紫白膏促进血管生成的具体分子机制。

参考文献

[1] CAI E W， ZHAO C， WU Y Y，et al. An experimental study on the regulation of vascular endothelial growth factor and its receptor in rat wound tissue by zibai ointment ［J］. J Biomater Tissue Eng，2020，10（7）：999-1004.

[2] 杨少玲，孙蕾蕾，胡丽叶，等. 创面负压治疗对糖尿病足创面肉芽组织碱性成纤维细胞生长因子的影响［J］. 中华糖尿病杂志，2016，8（2）：103-107.

[3] 蔡而玮，赵诚，吴燕燕，等. 紫白膏对大鼠创伤模型创面修复的影响［J］. 福建中医药，2019，50（5）：23-26.

[4] 周林，曾华. 中药灌肠对直肠癌术后患者创面愈合的影响［J］. 湖北中医药大学学报，2023，25（1）：83-85.

[5] 蔡而玮，吴燕燕，许圳鹏. 紫白膏对混合痔术后出血的临床和实验研究［J］. 中医临床研究，2014，6（30）：104-106.

[6] 蔡而玮，吴燕燕. 紫白膏治疗混合痔术后水肿的临床研究［J］. 中华中医药杂志，2013，28 （9）：2785-2787.

[7] 蔡而玮，徐照秀，陈民藩. 紫白膏促进肛瘘术后创面愈合临床研究［J］. 实用中医药杂志，2005，21（3）：160.

[8] 蔡而玮，赵诚，吴燕燕. 基于NF-кB 因子研究紫白膏促进混合痔术后创面修复的作用机制［J］. 时珍国医国药，2014，25（3）：589-591.

[9] 许圳鹏，赵诚，倪虹. 紫白膏对大鼠创面组织修复及bFGF表达的影响［J］. 中国卫生标准管理，2018，9（9）：107-109.

[10] 蔡而玮，张倩倩. 紫白膏对肛肠病术后疼痛大鼠血浆IL-6、IL-10影响［J］. 光明中医，2016，31（1）：48-50.

[11] 李阳，汪昭楚，王菁，等. 紫白膏对大鼠肛周创面愈合及皮肤组织IL-1β、TNF-α表达的影响［J］. 福建中医药，2023，54（6）：33-36.

[12] 王菁，汪昭楚，李阳，等. 紫白膏对大鼠肛周创面愈合及TGF-β1、Smad3表达的影响［J］. 福建中医药，2023，54（8）：27-30.

[13] TANG Q， ZHAO X S， GUO A，et al. Therapeutic applications of adipose-derived stromal vascular fractions in osteoarthritis ［J］. World J Stem Cells，2022，14（10）：744-755.

[14] YEN J H， CHIO W T， CHUANG C J，et al. Improved wound healing by naringin associated with MMP and the VEGF pathway ［J］. Molecules，2022，27（5）：1695.

基金资助

福建省教育厅中青年教师教育科研项目(JAT220123)

福建省第四批老中医药专家学术经验继承项目(闽卫中医函〔2022〕554号)