基于lncRNA MGC-Mirg与PERK通路探讨荣筋拈痛方延缓膝骨关节炎小鼠软骨退变

Exploration of Rongjin Niantong Formula Delaying Cartilage Degeneration in Mice with Knee Osteoarthritis Based on lncRNA MGC-Mirg and PERK Pathway

摘要

目的 基于长链非编码RNA（lncRNA） MGC-Mirg与PRKR样内质网激酶（PERK）通路探讨荣筋拈痛方延缓膝骨关节炎模型小鼠软骨退变的机制。 方法 48只8周龄小鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为空白组12只和造模组36只，造模组采用改良Hulth法诱导建立KOA模型，将造模成功的小鼠分为模型组、荣筋拈痛方组和阳性对照组各12只。荣筋拈痛方组按9 g/（kg·d）给予荣筋拈痛方药液灌胃；阳性对照组按500 mg/（kg·d）给予特异性内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸溶液灌胃；空白组和模型组按10 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃，均连续灌胃8周。采用HE染色与番红O-固绿染色观察小鼠关节软骨组织病理改变；Western blot检测膝关节软骨组织PERK、激活转录因子4（ATF4）、结合免疫球蛋白（BIP）、ER降解增强α-甘露糖苷酶样蛋白1（EDEM1）、生长停滞与DNA损伤诱导蛋白（GADD153）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）蛋白表达量；qPCR检测膝关节软骨组织lncRNA MGC-Mirg RNA相对表达水平。 结果 与空白组比较，模型组关节间隙变窄，软骨膜表层发生破坏，软骨层纤维方向出现偏移、变薄，软骨细胞数量降低，且胫骨平台处的软骨下骨出现塌陷，各层结构不完整；膝关节软骨组织PERK、ATF4、BIP、EDEM1、GADD153、Caspase-3蛋白表达量和lncRNA MGC-Mirg RNA相对表达水平均明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，荣筋拈痛方组与阳性对照组软骨层结构基本完整；膝关节软骨组织PERK、ATF4、BIP、EDEM1、GADD153、Caspase-3蛋白含量表达和lncRNA MGC-Mirg RNA相对表达水平均明显降低（P＜0.05）。 结论 荣筋拈痛方可以有效延缓KOA小鼠软骨退变，其机制可能与下调lncRNA MGC-Mirg基因、PERK通路相关蛋白表达，抑制细胞内质网应激有关。

Abstract

Objective To Explore the mechanism of Rongjin Niantong formula in delaying cartilage degeneration in knee osteoarthritis model mice based on the long non-coding RNA (lncRNA) MGC-Mirg and PRKR like endoplasmic reticulum kinase (PERK) pathway. Methods Forty-eight 8-week-old mice were randomly divided into blank group (n=12) and modeling group (n=36) using a random number table method. The KOA model was established using the improved Hulth method in the modeling group. Successfully modeled rats were randomly divided into model group, Rongjin Niantong formula group and positive control group, with 12 rats in each group. The Rongjin Niantong formula group was given Rongjin Niantong formula solution by gavage at doses of 9.0 g/(kg·d); the positive control group was given taurine deoxycholic acid solution by gavage at doses of 500 mg/(kg·d); the blank and model groups were given saline by gavage at doses of 10 mL/(kg·d). All these intervention lasted 8 weeks. HE staining and safranin O-fast green staining were used to observe pathological changes in articular cartilage tissue; the protein expression of PERK, activating transcription factor 4 (ATF4), binding immunoglobulin protein (BIP), ER degradation enhancing alpha-mannosidase like protein 1(EDEM1), growth arrest and DNA damage-inducible protein 153 (GADD153), and Caspase-3 in cartilage tissue was detected by Western blot; the RNA expression level of lncRNA MGC-Mirg was detected by qPCR. Results The pathology of the model group showed narrowing of the joint space, damage to the surface of cartilage membrane, deviation and thinning of the fiber direction in the cartilage layer, decreased number of chondrocytes, and collapse of the subchondral bone at the tibial plateau, with incomplete structures in each layer. Compared with the blank group, the protein expression level of PERK, ATF4, BIP, EDEM1, GADD153, Caspase-3, and the mRNA expression level of lncRNA MGC-Mirg in the knee joint cartilage tissue of the model group significantly increased (P<0.05). Compared with the model group, the structure of cartilage layer was basically intact in the Rongjin Niantong formula and positive control groups; the protein expression level of PERK, ATF4, BIP, EDEM1, GADD153, Caspase-3, and the mRNA expression level of lncRNA MGC-Mirg in the knee joint cartilage tissue significantly decreased (P<0.05). Conclusion Rongjin Niantong formula can effectively delay cartilage degeneration in KOA mice, and its mechanism may be related to the down-regulation the expression of lncRNA MGC-Mirg and PERK pathway-related protein, and inhibition of endoplasmic reticulum stress.

Graphical abstract

关键词

膝骨关节炎 / 荣筋拈痛方 / lncRNA / 内质网应激 / PERK通路

Key words

knee osteoarthritis / Rongjin Niantong formula / lncRNA / endoplasmic reticulum stress / PERK pathway

关节软骨失稳和关节面损伤被认为是引起膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）的重要因素之一，因此改善关节软骨退变被认为是缓解KOA的有效途径^［1-2］。骨关节炎软骨细胞在炎症因子、机械压力等刺激下发生内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），促使细胞凋亡，因此抑制ERS以减少细胞凋亡是防治KOA的有效途径^［3-5］。研究表明，长链非编码RNA（lncRNA）参与调控细胞ERS反应，并成为药物改善细胞ERS状态的潜在靶点。其中，lncRNA MGC-Mirg参与多种疾病的发生、发展，与骨关节炎病理发展关系密切，然而其调控机制尚未明确^［6-7］。荣筋拈痛方具有补肝肾、壮筋骨、祛风湿、止痹痛之效，临床应用荣筋拈痛方可有效改善OA患者疼痛症状与活动功能^［8］。基于此，本研究观察荣筋拈痛方对KOA小鼠模型软骨组织中lncRNA MGC-Mirg及PRKR样内质网激酶（PERK）通路相关蛋白表达的影响，以期探讨荣筋拈痛方的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

健康SPF级雄性C57BL/6小鼠48只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005，饲养于福建中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007。实验动物饲养条件为湿度65%，温度20～25 ℃，分笼饲养，自由饮水，标准饲料喂养。实验过程及方法均符合福建中医药大学实验动物伦理委员会要求（FJTCM IACUC-2020048）。

1.2 实验药物

荣筋拈痛方颗粒（江阴天江药业有限公司，生产批号：2006001）溶于生理盐水中，配制成浓度为0.095 g/mL的荣筋拈痛方药液。牛磺熊去氧胆酸（意大利贝斯迪大药厂，生产批号：1918）为特异性内质网应激抑制剂，将其溶于生理盐水中，配制成浓度为0.05 g/mL的牛磺熊去氧胆酸溶液。

1.3 实验试剂

苏木素-伊红染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；激活转录因子4（ATF4，批号：9N29）、结合免疫球蛋白（BIP，批号：9N29）、生长停滞与DNA损伤诱导蛋白（GADD153，批号：4612）、GAPDH（批号：9306）均购自美国SAB公司；PERK（批号：00088211）、ER降解增强α-甘露糖苷酶样蛋白1（EDEM1，批号：00041108）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3，批号：00092560）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；2×Taq Plus Master Mix（批号：7E410L0）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（批号：7E410L0）均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.4 实验仪器

微量紫外分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：NanoDrope 2000）；荧光定量PCR仪（型号：CFX96）、凝胶成像系统（型号：GelDoc 2000）均购自美国Bio-Rad公司；全自动酶标仪（美国Bio-Tek公司，型号：ELX800）。

2 实验方法

2.1 动物分组、造模与干预

48只小鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为空白组12只和造模组36只。造模组经5%异氟醚吸入麻醉后，采用改良Hulth法建立KOA小鼠模型^［9］。术后1周可见小鼠膝关节肿胀、活动频率下降，驱赶运动时出现跛行，表明KOA模型复制成功。将造模成功的小鼠随机分为模型组、荣筋拈痛方组和阳性对照组各12只。荣筋拈痛方组按生药量9 g/（kg·d）给予荣筋拈痛方药液灌胃^［10］；阳性对照组按生药量500 mg/（kg·d）给予牛磺熊去氧胆酸溶液灌胃；空白组和模型组按10 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃，灌胃剂量依据小鼠体质量按周计算调整，均连续灌胃8周。

2.2 取材

于末次灌胃结束后，经5%异氟醚吸入麻醉后处死。每组随机选择3只切取右侧膝关节置于4%多聚甲醛中固定用于HE染色和番红O-固绿染色；收集其余小鼠右膝关节软骨组织，置于液氮中转移至-80 ℃冰箱冷冻保存，用于后续Western blot和qPCR实验。

2.3 HE染色和番红O-固绿染色观察膝关节软骨组织病理形态

组织经石蜡包埋、切片、常规脱蜡后染色。HE染色为苏木精浸染10 min，流水轻柔漂洗1 min，1%盐酸乙醇溶液浸染2 s快速返蓝，再经0.5 %伊红染液浸染5 s。番红O-固绿染色为铁苏木素染色3 min，酸性分化液分化15 s，固绿染色5 min，弱酸溶液洗涤10 s，晾干入番红染色液浸染5 min。染色完毕的标本经中性树脂封固后进行镜下观察。

2.4 Western blot检测膝关节软骨组织PERK通路相关蛋白表达量

提取各组软骨组织总蛋白，BCA法进行蛋白定量，经电泳、转膜、封闭后洗膜，置于PERK（1∶1 000）、ATF4（1∶1 000）、BIP（1∶1 000）、EDEM1（1∶1 000）、GADD153（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）一抗中4 ℃下摇床过夜，待二抗（1∶5 000）孵育后，使用ECL发光液进行显影，于凝胶成像仪下进行曝光成像，Image Lab分析，导出图像储存。

2.5 qPCR检测膝关节软骨组织lncRNA MGC-Mirg RNA相对水平表达

采用TriZol法提取软骨中总RNA，根据逆转录试剂盒说明书，取1 μg总RNA逆转录成cDNA，逆转录条件：55 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃。引物序列由福州尚亚生物技术有限公司设计，lncRNA MGC-Mrig：F 5'-CCTTCCTGGATCTCTCGC TT-3'；R 5'-GTGGGAGTTGAAACATGGGT-3'；GAPDH：F 5'-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3'，R 5'- GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3'。扩增反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。反应结束后确认Real-time PCR扩增曲线与溶解曲线，获取荧光Ct值，根据公式2^－ΔΔCt进行结果分析。

2.6 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐则采用Games-Howell检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 4组膝关节软骨组织病理形态比较

空白组小鼠股骨髁及胫骨平台处关节软骨层连续且完整，关节间隙正常，软骨下骨等结构完整且清晰；模型组关节间隙变窄，软骨膜表层发生破坏，软骨层纤维方向出现偏移、变薄，软骨细胞数量降低，且胫骨平台处的软骨下骨出现塌陷，各层结构不完整；荣筋拈痛方组与阳性对照组软骨损伤及软骨下骨塌陷程度较模型组减轻。见图1。

3.2 4组膝关节软骨组织PERK通路相关蛋白表达量比较

与空白组比较，模型组膝关节软骨组织PERK、ATF4、BIP、EDEM1、GADD153、Caspase-3蛋白表达量均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，荣筋拈痛方组与阳性对照组PERK、ATF4、BIP、EDEM1、GADD153、Caspase-3蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）。见图2、表1。

3.3 4组膝关节软骨组织lncRNA MGC-Mirg RNA相对表达水平比较

与空白组比较，模型组膝关节软骨组织lncRNA MGC-Mirg RNA相对表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，荣筋拈痛方组与阳性对照组lncRNA MGC-Mirg RNA相对表达水平明显降低（P＜0.05）。见图3。

4 讨　论

膝骨关节炎临床表现以肢节疼痛、关节屈伸不利为主，可归属于中医学“历节风”“白虎风”“鹤膝风”“老寒腿”等范畴。中老年人为KOA高发人群，女子六七、男子六八虚衰之象渐显，正气不足则腠理开，复感外邪，发为疾病。KOA病在筋骨，肝主筋、肾主骨，因此患者关节不适“无有不因肝肾虚者”，故KOA以肝肾亏虚为根，以风寒湿邪入侵、瘀血阻滞经络为标，乃本虚标实之证。基于中医“肝主筋、肾主骨”理论和《清宫配方集成》，通过对OA治疗方药进行数据挖掘组成新方，即荣筋拈痛方，具有补肝肾、强筋骨、祛风湿和止痹痛之功效，研究表明可促进软骨细胞增殖与Ⅱ型胶原表达，抑制KOA关节软骨退变，有效缓解KOA病理进展^［11-16］。本研究结果显示：模型组小鼠关节软骨发生明显损伤，HE染色可见模型组关节间隙变窄，软骨膜表层发生破坏，软骨层纤维方向出现偏移、变薄，软骨细胞数量降低，且胫骨平台处的软骨下骨出现塌陷，各层结构不完整，与文献报道中骨关节炎小鼠软骨组织损伤表现一致^［17-18］。经荣筋拈痛方及牛磺熊去氧胆酸治疗后关节软骨退变程度明显减轻，表明荣筋拈痛方可以有效缓解关节软骨退变。

在人和小鼠的KOA关节软骨细胞中可以观察到显著的内质网扩张改变^［19-20］，这种扩张改变是细胞ERS的标志之一，表明ERS参与了KOA软骨的病理发展。EDEM1从蛋白折叠循环中提取末端错误折叠的蛋白质并标记，从而促进蛋白降解，是ERS的质量调控指标之一。PERK通路是ERS中的一条重要通路，涉及PERK、BIP、ATF4和GADD153，Caspase-3是其下游调控凋亡相关的指标之一。PERK被广泛认为是ERS中最先激活的蛋白，激活后的PERK与BIP解离，调控停止全局转录，ATF4表达量升高从而上调GADD153基因水平，促使细胞大量表达Caspase-3，导致软骨细胞凋亡、软骨基质降解^［21］。研究表明，PERK抑制剂可以有效降低ERS和凋亡标志物的表达，并减少软骨细胞凋亡^［22］。KATO等^［23］发现当细胞发生ERS时，lncRNA MGC-Mirg表达增高，通过在细胞中敲减该基因可以抑制细胞ERS进展，表明lncRNA MGC-Mirg参与细胞ERS，且可能是调控ERS的潜在靶点。本研究结果显示：模型组软骨组织lncRNA MGC-Mirg RNA表达水平和PERK、BIP、ATF4、GADD153、EDEM1、Caspase-3蛋白表达量较对照组明显升高，表明lncRNA MGC-Mirg与PERK通路参与OA模型病理进展。经荣筋拈痛方与牛磺熊去氧胆酸干预后，软骨组织lncRNA MGC-Mirg RNA表达水平与PERK通路蛋白表达明显被抑制，表明荣筋拈痛方治疗通过降低软骨组织lncRNA MGC-Mirg基因水平和抑制PERK通路蛋白表达来缓解ERS，减轻软骨病理改变。

综上所述，荣筋拈痛方可以有效延缓KOA小鼠软骨退变，其机制可能与下调lncRNA MGC-Mirg基因、PERK通路相关蛋白表达，抑制细胞ERS有关。同时，本研究仍有一定局限性，即尚未明确lncRNA MGC-Mirg与PERK通路蛋白间的靶向关系，该内容仍需进一步深入探究。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82104888)

福建中医药大学高层次人才科研启动资金项目（X2019011-人才）

陈可冀中西医结合发展基金项目(CKJ2021018)