基于斑马鱼模型研究活心丸对阿霉素心脏毒性的预防和作用机制

Prevention and Mechanism of Huoxin Pill on Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity Based on Zebrafish

摘要

目的 基于斑马鱼模型探究复方中药活心丸（HXP）对阿霉素（DOX）所致心脏毒性的预防及其作用机制。 方法 选取7月龄野生型AB品系雌性斑马鱼80尾，随机分为对照组、模型组、低剂量组、高剂量组各20尾。第1～7天，低、高剂量组分别按生药量9、12 μg/（g·d）予HXP药液腹腔注射，对照组和模型组按5.7 μL/（g·d）予生理盐水腹腔注射；第8天，模型组及低、高剂量组按生药量20 μg/（g·d）予DOX药液腹腔注射，对照组按5.7 μL/（g·d）予生理盐水腹腔注射，随后在养殖系统中静养4周。给药注射后每隔7 d观察各组斑马鱼存活情况，并计算存活率。静养4周后进行麻醉、称重，取斑马鱼心脏组织，测量心室面积，计算心室面积/体质量。Masson染色观察心肌组织纤维化程度；α-actinin免疫荧光染色观察心肌排列情况；TUNEL染色观察心肌组织凋亡情况；qPCR检测心脏组织前列腺素内过氧化物合成酶（ptgs2）、花生四烯酸5脂氧合酶（alox5a）、NADPH氧化酶1（nox1）、抗氧化应激因子谷胱甘肽过氧化酶1（gpx1）、心房利钠因子（anf）、促炎因子肿瘤坏死子α（tnfα）、白细胞介素6（il6）和抑炎因子转化生长因子β1（tgfβ1b）mRNA相对表达水平。 结果 与对照组比较，模型组心室面积和心室面积/体质量均明显升高（P＜0.05），ptgs2、alox5a、nox1、anf、tnfα、il6 mRNA相对表达水平均明显提高（P＜0.05），gpx1 mRNA相对表达水平均明显降低（P＜0.05）；病理可见心肌肥大、粘连、纤维化，心肌组织排列紊乱，凋亡细胞增多。与模型组比较，高剂量组心室面积和心室面积/体质量均明显降低（P＜0.05），ptgs2、alox5a、nox1、anf、tnfα、il6 mRNA相对表达水平均明显降低（P＜0.05），tgfβ1b、gpx1 mRNA相对表达水平均明显升高（P＜0.05）；病理可见心肌肥大、粘连、纤维化、心肌组织排列紊乱和细胞凋亡情况改善。 结论 活心丸可有效预防阿霉素所致的斑马鱼心脏病理改变，其机制可能与下调铁死亡和炎症水平有关。

Abstract

Objective To discuss the protective effect and mechanism of Huoxin pill (HXP) on doxorubicin (DOX) induced cardiotoxicity in zebrafish model. Methods Eighty wild-type AB strain female zebrafish were randomly divided into control group, model group, low-dose group and high-dose group, with 20 zebrafish in each group. On the 1st to 7th day, the low- and high-dose groups were intraperitoneally injected with HXP solution at the dose of 9 and 12 μg/(g·d), respectively, and the control and model groups were intraperitoneally injected with normal saline at the dose of 5.7 μL/(g·d). On the 8th day, the model, low-dose and high-dose groups were intraperitoneally injected with DOX solution at the dose of 20 μg/(g·d), and the control group was intraperitoneally injected with normal saline at the dose of 5.7 μL/(g·d). The survival of zebrafish in each group was observed every 7 days after DOX injection. After 4 weeks of DOX injection, ventricular area and ventricular area/body weight were measured. Masson staining was used to observe the degree of myocardial tissue fibrosis; α-actinin immunofluorescence staining was used to observe the arrangement of myocardium; Tunel staining was used to observe the apoptosis of myocardial tissue; qPCR was used to detect the mRNA expression level of prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (ptgs2), arachidonate 5-lipoxygenase (alox5a), NADPH oxidase 1 (nox1), glutathione peroxidases 1 (gpx1), atrial natriuretic factor (anf), tumor necrosis factor α (tnfα), interleukin 6 (il6), and transforming growth factor β1b (tgfβ1b) in cardiac tissue. Results Compared with the control group, the ventricular area and ventricular area/body weight in the model group significantly increased (P<0.05); the mRNA expression level of ptgs2, alox5a, nox1, anf, tnfα, and il6 significantly increased (P<0.05), while the mRNA expression level of gpx1 significantly decreased (P<0.05); pathology showed myocardial hypertrophy, adhesion, fibrosis, disordered arrangement of myocardial tissue, and increased apoptotic cells. Compared with the model group, the ventricular area and ventricular area/body weight in the high-dose group significantly decreased (P<0.05); the mRNA expression level of ptgs2, alox5a, nox1, anf, tnfα, and il6 significantly decreased (P<0.05), while mRNA expression level of tgfβ1b and gpx1 significantly increased (P<0.05); pathology showed improvement in myocardial hypertrophy, adhesion, fibrosis, disordered arrangement of myocardial tissue, and cell apoptosis. Conclusion HXP can effectively prevent pathological changes in zebrafish heart caused by doxorubicin, and its mechanism may be related to down-regulating ferroptosis and inflammation level.

Graphical abstract

关键词

心脏毒性 / 阿霉素 / 活心丸 / 斑马鱼 / 铁死亡 / 炎症

Key words

cardiotoxicity doxorubicin / Huoxin pill / zebrafish / ferroptosis / inflammation

阿霉素（doxorubicin，DOX）是一种蒽环类广谱抗肿瘤药物，可有效抑制恶性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌等多种癌症的发展，但其引发的心脏毒性使DOX在癌症化疗中的应用受到限制^［1］。炎症反应、细胞凋亡是DOX心脏毒性的重要因素之一^［2］。铁死亡是铁依赖性的磷脂过氧化作用驱动的一种独特的细胞死亡方式^［3］，研究表明铁死亡是DOX引起心肌损伤的分子机制之一，抑制铁死亡可有效缓解DOX诱导的心脏毒性^［4-5］。因此，积极寻找可抑制铁死亡的药物是减轻DOX所致心脏毒性的潜在治疗策略。中成药制剂活心丸（HXP）广泛用于冠心病、心绞痛、心肌梗死等心血管疾病，具有抗氧化应激、抗炎、抗心肌细胞凋亡等作用^［6-9］。斑马鱼作为生物模型之一，广泛用于遗传发育类疾病、心血管疾病和神经系统疾病等诸多领域^［10-11］。本研究采用斑马鱼模型探究HXP对DOX所致心脏毒性的干预作用及其分子机制，以期为DOX心脏毒性的防治提供新策略，为拓宽HXP的临床应用提供理论支持。

1 实验材料

1.1 实验动物

7月龄野生型AB品系雌性斑马鱼80尾，为福建医科大学基础医学院所赠，养殖条件：水温（28.0±0.5）℃，pH值7.0～7.2，黑暗/光照周期为10 h/14 h，每日喂食丰年虾幼虫2次。本实验均符合福建中医药大学出版的《实验动物护理与使用指南》，严格遵循3R原则进行操作。

1.2 实验药物

HXP（广州悦康生物制药有限公司，产品批号：21050101）研磨成细粉，溶解于5 mL生理盐水，超声助溶1 h，配置成4 mg/mL HXP药液，应用0.22 μm微孔滤膜过滤，分装保存在-20 ℃冰箱备用。DOX（北京华泰联博科技有限公司，批号：HF190916）粉末溶解于5 mL生理盐水，超声助溶1 h，配置成3.5 mg/mL DOX药液，0.22 μm微孔滤膜过滤，分装保存在-20 ℃冰箱备用。

1.3 实验试剂

三卡因麻醉剂（武汉贝尔卡医药有限公司，批号：886-86-2）；α-肌动蛋白（α-actinin）一抗（博士德生物科技有限公司，批号：11313-2-AP）；兔二抗（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：AC230209002）；TUNEL染色试剂盒（羿圣生物科技股份有限公司，批号：T3129130）；TriZol试剂（批号：R401-01）、逆转录试剂盒（批号：017E2991IC）均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；SYBR qPCR Super Plus试剂盒（近岸蛋白质科技股份有限公司，批号：05238502）。

1.4 实验仪器

体式显微镜（日本Nikon公司，型号：SMZ800N）；脱水机（型号：ZT-12P3）、包埋机（型号：YB-6LF）、摊片机（型号：YT-7FB）均购自孝感市亚光医用电子技术有限公司；正置光学显微镜（广州明美科技有限公司，型号：ML31）；冰冻切片机［赛默飞世尔科技（中国）有限公司，型号：HM525NX］；激光共聚焦显微镜（德国Carl Zeiss Jena公司，型号：LSM710）。

2 实验方法

2.1 分组与给药

80尾斑马鱼随机分为对照组、模型组、低剂量组和高剂量组，每组20尾。应用0.16 mg/mL三卡因麻醉斑马鱼，吸水纸吸干鱼身表面水分，称重，采用微量进样针向麻醉的成年斑马鱼腹腔进行注射，针与身体成45°插入腹鳍之间的中线，深度约为1～2 mm。第1～7天，低、高剂量组分别按生药量9、12 μg/（g·d）予HXP药液腹腔注射，对照组和模型组按5.7 μL/（g·d）予生理盐水腹腔注射；第8天，模型组及低、高剂量组按生药量20 μg/（g·d）予DOX药液腹腔注射，对照组按5.7 μL/（g·d）予生理盐水腹腔注射，随后在养殖系统中静养4周。实验流程见图1。

2.2 标本采集

静养4周后，将各组斑马鱼进行麻醉、称重，显微镜下在冰浴PBS溶液中取出心脏组织，取出的各组斑马鱼心脏根据后续实验需求，在4%多聚甲醛、OCT包埋试剂和TriZol试剂中分别保存完整的心脏组织。

2.3 观察指标

2.3.1 存活情况和心脏形态观察

给药注射后每隔7 d观察各组斑马鱼存活情况，计算存活率。取材后，使用体式显微镜观察斑马鱼的心脏形态并拍照，根据最后存活情况测量4组心室面积，并计算心室面积/体质量。

2.3.2 Masson染色观察心肌组织纤维化程度

收集心脏组织样本，用4%多聚甲醛固定过夜，脱水后用石蜡包埋，制成厚度约为5 μm的切片，切片脱蜡至水，2.5%重铬酸钾中浸泡过夜，铁苏木素浸染 1 min，1%盐酸乙醇分化，丽春红酸性品红染液浸染6 min，1%磷钼酸溶液浸染1 min，不水洗，2.5%苯胺蓝溶液染2～30 s，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜镜检。

2.3.3 α-actinin免疫荧光染色观察心肌排列情况

收集心脏组织样本，用OCT试剂进行包埋，使用冰冻切片机制成厚度约10 μm的切片，切片经4%多聚甲醛固定15 min，1% Triton X-100通透40 min，封闭液封闭1 h，α-actinin一抗4 ℃孵育过夜，二抗避光孵育4 h，抗猝灭封片剂封片，共聚焦显微镜观察。

2.3.4 TUNEL染色观察心肌组织凋亡情况

收集心脏组织样本，用OCT试剂进行包埋，使用冰冻切片机制成厚度约10 μm的切片，切片经4%多聚甲醛固定15 min，根据TUNEL染色试剂盒说明书进行染色，DAPI复染30 min，抗猝灭封片剂封片，共聚焦显微镜观察。

2.3.5 qPCR检测心脏组织铁死亡和炎症相关因子mRNA相对表达水平

采用TriZol法提取心脏组织总RNA，DEPC水溶解RNA并检测RNA浓度和纯度，将RNA逆转录成cDNA，以各组cDNA为模板，进行qPCR反应。引物序列由Primer Premier 5.0软件设计并由擎科生物技术有限公司合成，见表1。PCR扩增方案：50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s。ef1α为内参基因，采用2^-ΔΔCt法分析目的基因相对表达水平。根据斑马鱼基因命名规则，本文中斑马鱼基因均用斜体小写字母表示^［12］。

2.4 统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0进行统计学分析。计量资料符合正态分布用（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐采用Dunnett's t检验。相关性分析采用Pearson分析，|r|≥0.8为高度相关。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 4组DOX注射后存活率比较

4组不同时间点存活率情况见表2。DOX注射后天数与斑马鱼存活率呈负相关（r＝-0.984 8，P＝0.002 2）。

3.2 4组斑马鱼心脏形态比较

与对照组比较，模型组心室面积、心室面积/体质量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组心室面积、心室面积/体质量无明显变化（P＞0.05），高剂量组心室面积、心室面积/体质量明显降低（P＜0.05），提示低剂量组对阿霉素诱导的心室扩张无明显预防作用，而高剂量组具有预防作用，因此后续的观察指标仅检测高剂量组。见图2、表3。

3.3 3组心肌组织病理学形态比较

对照组未见心肌组织肥大、粘连、纤维化，心肌组织排列整齐；模型组出现心肌肥大、粘连和纤维化的情况，心肌组织排列紊乱；高剂量组心肌肥大、粘连和心肌组织排列紊乱改善，未见心肌纤维化。见图3、图4。

3.4 3组心肌凋亡情况比较

与对照组比较，模型组凋亡细胞增多，表现为细胞核凋亡破碎，高剂量组有所改善。见图5。

3.5 3组心脏组织铁死亡和炎症相关因子mRNA相对表达水平比较

见表4。

4 讨　论

DOX是一种从链霉菌中分离的蒽环类药物，临床实践中常用于治疗恶性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌等，然而该药物具有严重的心脏毒副作用，其心脏毒性可分为急性和慢性心脏毒性，急性心脏毒性表现为低血压、短暂性心律紊乱，慢性心脏毒性在患者暴露于DOX数年后出现，通常表现为不可逆、累积和剂量依赖性的心肌病，最终导致充血性心力衰竭^［13］。目前对于DOX心脏毒性的治疗，尚无有效的药物可以逆转这一心脏毒性。根据其症状，DOX心脏毒性归属于中医学“心悸”“胸痹”范畴，病机属于气阴两虚、心阳不振^［14-15］。活心丸具有益气活血、温经通脉的功效，主治胸痹、心痛。

斑马鱼遗传背景与人类有着高度相似性，具有繁殖能力强、饲养成本低、实验重复性好、实验操作便捷等优势，这些优势能够弥补和完善哺乳动物实验模型的不足，减少体外实验和哺乳动物实验之间产生的巨大生物学差异，使实验操作便捷，可信度更高^［16］。anf因子是心脏重构的分子标志物之一，其表达的升高提示心力衰竭、心室肥厚^［13］，本研究借鉴了文献［17］的造模方法，成功建立斑马鱼DOX心脏毒性模型，出现死亡、心室面积扩张、心室面积/体质量增加、心肌排列紊乱、心肌纤维化及anf表达水平升高。

铁死亡是DOX诱导心脏毒性的机制之一，其特征是铁依赖和脂质过氧化的积累导致线粒体膜损伤^［18］。PTGS2、ACSL4作为参与脂质代谢的基因，已被用作铁死亡的生物标志物^［19］，可以帮助判断铁死亡的发生程度。alox5a是斑马鱼中主要的脂氧合酶之一，能够促进线粒体脂质过氧化^［20］，促进铁死亡。此外，NOX家族是人心肌细胞中ROS的主要来源，NOX-1作为NOX家族的关键成员，会增加ROS的释放并促进铁死亡^［21］。有研究表明GPX-1的过表达可改善DOX所致心脏毒性^［22-23］，而铁死亡的一个重要特征是谷胱甘肽（GSH）耗竭^［24］，GPX-1能够促进GSH合成，从而抑制铁死亡。本研究发现：HXP能够明显抑制DOX诱导的斑马鱼心脏组织ptgs2、alox5a、nox1 mRNA相对表达水平，促进gpx1 mRNA相对表达水平，提示HXP能够抑制铁死亡的发生。

DOX心脏毒性的重要因素之一是炎症反应的过度持续和加重^［2］。铁死亡是炎症的重要调节因子，TSURUSAKI等^［25］发现铁死亡抑制剂可抑制炎症因子TNF-α和IL-6的释放，发挥抗炎作用。本研究结果显示：HXP能够明显抑制DOX诱导的斑马鱼心脏组织促炎因子tnfα和il6的上调和抗炎因子tgfβ1b的下调，提示HXP可能通过抑制铁死亡，从而抑制炎症相关因子的表达，发挥抗炎作用。

本研究结果表明：HXP能够明显改善DOX诱导的斑马鱼心脏毒性，调节铁死亡相关因子ptgs2a、alox5a、nox1、gpx1和炎症因子tnfα、il6、tgfβ1b的表达，提示HXP通过抑制铁死亡和炎症反应有效改善DOX所致心肌组织病理变化。后续我们可基于斑马鱼模型深入探究HXP如何靶向调控铁死亡及炎症因子，以及铁死亡与炎症因子如何相互作用，深入探索HXP的作用机制，同时促进我们对DOX所致心肌病的理解。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2021J05063)

福建中医药大学校管课题（X2020010-重点）

福建中医药大学高层次人才科研启动资金项目（X2020013-人才）