含白芍和硫熏白芍的栝楼桂枝汤指纹图谱研究

摘要

目的 建立栝楼桂枝汤高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，分析对比含白芍和硫熏白芍的栝楼桂枝汤指纹图谱差异。 方法 采用HPLC法建立栝楼桂枝汤指纹图谱，采用Inetsil-ODS-SP C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，流速0.8 mL/min，柱温30 ℃，检测波长254 nm，进样量10 μL。采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法（OPLS-DA）比较在添加白芍和硫熏白芍下栝楼桂枝汤指纹图谱差异，寻找差异性化学成分。 结果 分别建立了含白芍和硫熏白芍的栝楼桂枝汤HPLC指纹图谱，含白芍的栝楼桂枝汤共标定了35个共有峰，含硫熏白芍的栝楼桂枝汤共标定了34个共有峰；PCA和OPLS-DA分析结果显示：添加白芍和硫熏白芍的栝楼桂枝汤能明显分为两类，OPLS-DA分析确定峰6、15、14、10、18、4为差异标志物，经与对照品比对分别鉴定为芍药苷亚硫酸酯、没食子酸乙酯、芍药苷、没食子酸甲酯、五没食子酰葡萄糖、没食子酸。 结论 本研究所建立的HPLC指纹图谱稳定可靠，并可结合化学计量学分析比较添加白芍和硫熏白芍的栝楼桂枝汤指纹图谱差异，可为栝楼桂枝汤质量评价提供新的技术手段。

Graphical abstract

关键词

栝楼桂枝汤 / 白芍 / 硫熏白芍 / HPLC指纹图谱 / 化学计量学

栝楼桂枝汤源于《金匮要略》，由天花粉、桂枝、白芍、甘草、生姜、大枣6味药物组成，具有解肌止痉、养阴生津、柔润筋脉之效^［1］，临床上主要用于脑卒中引起的肢体痉挛及康复治疗^［2-3］。现代药理研究表明栝楼桂枝汤具有良好的神经保护作用^［4-6］。白芍为方中臣药，为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，味苦、酸，性微寒，归肝、脾经，具有养血调经、敛阴止汗之效，临床上常用于治疗四肢挛痛、头痛、眩晕等症^［7］，其化学成分主要为单萜苷类、酚酸类、没食子酰糖类^［8］，并且芍药苷作为栝楼桂枝汤（福建省第二人民医院院内制剂，批件号：闽2013S0001）的指标性成分，其质量的优劣影响复方整体疗效^［9-10］。前期研究发现：栝楼桂枝汤中芍药苷成分波动较大^［11-12］，可能影响栝楼桂枝汤的整体临床疗效^［13］，经查阅文献，这可能与白芍存在违规硫磺熏蒸的现象有关^［14］。目前关于栝楼桂枝汤高效液相色谱（HPLC）指纹图谱尚未建立，硫熏白芍对栝楼桂枝汤整体质量的影响也未见报道，因此本研究建立栝楼桂枝汤HPLC指纹图谱，并采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法（OPLS-DA）比较添加白芍和硫熏白芍的栝楼桂枝汤指纹图谱差异，为栝楼桂枝汤的质量控制提供新的分析技术手段。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（美国Agilent公司，型号：Agilent LC 1260）；十万分之一分析天平（美国Ohaus公司，型号：EX225DZH/AD）；台式超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-500E）；高速台式离心机（德国Eppendorf公司，型号：5810R）；超纯水仪（美国Millipore公司，型号：Milli-Q）。

1.2 试剂

芍药苷亚硫酸酯（批号：MUST-15080912）、芍药苷（批号：MUST-15090711）购自成都曼思特生物科技有限公司；没食子酸乙酯（北京赛百草科技有限公司，批号：46012-90-1）；五没食子酰葡萄糖（上海同田生物技术股份有限公司，批号：13103021）；没食子酸甲酯（阿拉丁试剂上海有限公司，批号：G1202055）；没食子酸（宝鸡市辰光生物科技有限公司，批号：HG230820），以上对照品均为分析纯，经面积归一法测定，纯度均＞98%；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）均购自德国Merck公司；甲酸（色谱纯，阿拉丁试剂上海有限公司）。

1.3 样品

10批白芍和10批硫熏白芍饮片^［15］均为市购，所有批次样品经过《中华人民共和国药典：一部》^［7］白芍项下二氧化硫残留量检测确定，其中10批硫熏白芍饮片的二氧化硫残留量超过药典要求，确系为硫熏白芍样品。栝楼桂枝汤在福建中医药大学附属第二人民医院进行颗粒样品制备，获得10批含白芍的栝楼桂枝汤（S1～S10）和10批含硫熏白芍的栝楼桂枝汤（S11～S20）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Inetsil-ODS-SP C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液（A）为流动相，梯度洗脱（0～5 min，5%B；5～50 min，5%～32%B；50～65 min，32%～48%B；65～75 min，48%～57%B；75～80 min，57%B），流速0.8 mL/min，柱温30 ℃，检测波长254 nm，进样量10 μL。

2.2 混合对照品溶液制备

分别精密称定没食子酸、芍药苷亚硫酸酯、没食子酸甲酯、芍药苷、没食子酸乙酯和五没食子酰葡萄糖对照品适量，加甲醇制成浓度分别为2.251 9、1.173 7、1.392 1、1.263 8、1.937 7、5.031 4 mg/mL的单一对照品储备液。分别精密移取上述对照品储备液适量至10 mL量瓶中，加入50%甲醇定容，制成含以上成分质量浓度分别为225.19、117.37、139.21、126.38、193.77、503.14 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

称取栝楼桂枝汤颗粒约0.5 g，精密称定，置具塞瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定重量，250 W、40 kHz下超声30 min，放冷，用提取溶剂补足减失的重量，16 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

分别精密吸取S1与S11批次的供试品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以14号峰芍药苷色谱峰作为参照峰（S）。计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD，见表1、表2，结果表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验

分别制备S1与S11批次的供试品溶液各6份，按“2.1”项下色谱条件分别进样分析，以14号峰芍药苷色谱峰作为参照峰（S），计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD，见表1、表2，结果表明各成分的重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

分别精密吸取S1与S11批次的栝楼桂枝汤供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”项下色谱条件进样测定，以14号峰芍药苷色谱峰作为参照峰（S），计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD，见表1、表2，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5 指纹图谱的建立及化学计量学分析

2.5.1 共有峰标定

分别精密吸取S1～S20栝楼桂枝汤供试品溶液10 μL，注入采集80 min的HPLC-DAD色谱图。采用国家药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版和2004B版）（以下简称“2004A版”“2004B版”）分析数据，根据色谱图中各色谱峰的相对保留时间，进行多点校正，选择出峰稳定、分离度良好的色谱峰为共有峰，其中含白芍的栝楼桂枝汤共标定35个共有峰，含硫熏白芍的栝楼桂枝汤共标定34个共有峰，分别建立含白芍及硫熏白芍的栝楼桂枝汤指纹图谱。依据方中白芍是否硫熏分为栝楼桂枝汤组（S1～S10）和S-栝楼桂枝汤组（S11～S20）。

2.5.2 HPLC指纹图谱的建立

2.5.2.1 栝楼桂枝汤组指纹图谱相似度评价

采用“2004A版”软件，对栝楼桂枝汤组（S1～S10）进行分析，以S1为参照图谱，导入S2～S10图谱并与S1多点校正，生成栝楼桂枝汤组HPLC对照指纹图谱（R1），见图1A，栝楼桂枝汤组各批次HPLC色谱对比见图1B。计算得到S1～S10供试品与R1的相似度，见表3，栝楼桂枝汤组各批次与R1之间的相似度均＞0.99，表明相似度良好。

2.5.2.2 S-栝楼桂枝汤组指纹图谱相似度评价

对S-栝楼桂枝汤组（S11～S20）进行分析，设定S11为参照图谱，将S12～S20与参照图谱进行多点校正，生成S-栝楼桂枝汤组HPLC对照指纹图谱R2，见图2A，S-栝楼桂枝汤组各批次HPLC色谱对比见图2B。计算得到S11～S20供试品与HPLC指纹图谱R2的相似度，见表4，S-栝楼桂枝汤组各批次与R2之间的相似度均＞0.99，表明相似度良好。

2.5.2.3 对照品比对

采用“2004B版”软件，设定R1为参照图谱，将R2与R1进行多点校正，生成R1与R2的HPLC色谱比对图，见图3，计算得到R2与R1的相似度仅为0.854，提示两者指纹图谱存有差异。混合对照品图谱见图4，经与对照品比对后鉴定了没食子酸（4号峰，8.94 min）、芍药苷亚硫酸酯（6号峰，15.01 min）、没食子酸甲酯（10号峰，20.14 min）、芍药苷（14号峰，26.26 min）、没食子酸乙酯（15号峰，27.11 min）和五没食子酰葡萄糖（18号峰，32.44 min）。

2.5.3 PCA

以共有峰数据为变量，采用SIMCA 14.1软件进行分析，得到PCA得分图，见图5。从结果可以看出，栝楼桂枝汤组被分成一类，S-栝楼桂枝汤组被分成另一类。

2.5.4 OPLS-DA

为了进一步筛选含白芍和硫熏白芍栝楼桂枝汤质量特征差异的标志性成分，进一步对S1～S20栝楼桂枝汤样本进行OPLS-DA分析。从OPLS-DA得分图看，20批栝楼桂枝汤可分为栝楼桂枝汤组与S-栝楼桂枝汤组2类，与主成分分析结果一致，见图6A。通过OPLS-DA分析得到相应模型置换验证图，见图6B，其模型参数R²X＝0.746，R²Y＝0.983，均＞0.5，R²及Q²均＜1，说明模型并未过拟合，提示硫熏白芍导致的栝楼桂枝汤组与S-栝楼桂枝汤组共有峰所致的分类差异。Q²＝0.974，说明模型的预测能力较好，能反映出样品的分离趋势。通过变量重要性投影法，以变异权重参数（VIP）＞1为标准，见图7，可筛选出16个具有统计学意义的差异标志物，通过对照品比对筛选出6个差异标志物，其中峰6、15、14、10、18、4分别为芍药苷亚硫酸酯、没食子酸乙酯、芍药苷、没食子酸甲酯、五没食子酰葡萄糖、没食子酸。

3 讨　论

3.1 色谱条件优化

本实验考察了Agilent ZORBAX SB-C₁₈和Inetsil-ODS-SP C₁₈色谱柱对栝楼桂枝汤中各个色谱峰的分离效果，发现Inetsil-ODS-SP C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）基线平稳并且各个色谱峰出峰时间稳定，最终选择为本实验的色谱柱。为使供试品溶液出峰较多，色谱峰能够较好分离，达到指纹图谱分析要求，进一步考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-水和乙腈-水流动相洗脱系统的洗脱效果，通过比较优选，最终确定了乙腈-0.1%甲酸水流动相系统。

3.2 指纹图谱分析

通过对比在添加白芍和硫熏白芍下栝楼桂枝汤指纹图谱的差异，发现添加硫熏白芍的栝楼桂枝汤中出现了添加白芍的栝楼桂枝汤中未有的芍药苷亚硫酸酯（峰6），推测是单萜苷类成分中的芍药苷在硫磺熏蒸过程中转化生成了芍药苷亚硫酸酯^［16］。除了单萜苷类成分的变化以外，酚酸类成分也有明显的变化，例如没食子酸甲酯（峰10）、没食子酸乙酯（峰15）在添加硫熏白芍的栝楼桂枝汤中几乎不可见，五没食子酰葡萄糖（峰18）明显降低，推测可能是白芍中没食子酰糖类及酚酸类成分可能在硫磺熏蒸酸性环境中降解转化成没食子酸（峰4），因此添加硫熏白芍对栝楼桂枝汤中的化学成分产生影响除了单萜苷类成分以外还有酚酸类成分的明显改变。

3.3 化学模式识别研究

为探究栝楼桂枝汤中白芍是否硫熏对复方化学成分的影响，本实验对栝楼桂枝汤组及S-栝楼桂枝汤组进行化学计量学分析，发现20批栝楼桂枝汤分成2类，其中栝楼桂枝汤组分为一类，即S1～S10，S-栝楼桂枝汤组分为另一类，即S11～S20，说明硫熏白芍对栝楼桂枝汤化学成分产生影响。进一步OPLS-DA结果解释了硫熏白芍后栝楼桂枝汤共有峰的变化导致的分类差异，通过对照品比对筛选出6个差异标志物，分别为单萜苷类成分芍药苷和芍药苷亚硫酸酯，以及酚酸类成分没食子酸乙酯、没食子酸甲酯、没食子酸和没食子酰糖类的五没食子酰葡萄糖。

本研究建立栝楼桂枝汤HPLC指纹图谱，并采用化学计量学方法分析对比添加白芍和硫熏白芍栝楼桂枝汤指纹图谱的差异，为栝楼桂枝汤的质量控制提供新的分析技术手段。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81503204)

国家自然科学基金项目(81674046)