TPGS修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸偶联物载药胶束制剂的冻干保护剂筛选及稳定性研究

摘要

目的 优选载紫杉醇（PTX）聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS）修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸偶联物胶束（PTX/TPGS-CR胶束）制剂的冻干保护剂，并对该制剂的稳定性进行初步评价。 方法 以PTX/TPGS-CR胶束制剂的外观、复溶性、粒径、多分散系数、载药量及包封率作为指标，以不同浓度甘露醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖作为冻干保护剂单用和复合使用，对制剂冻干效果进行评价，筛选最佳冻干保护剂；并对添加了最佳冻干保护剂的PTX/TPGS-CR胶束冻干制剂复溶后3 d稳定性及冻干制剂室温放置6个月稳定性进行考察。 结果 0.4%蔗糖作为冻干保护剂的PTX/TPGS-CR胶束制剂具有良好的外观及复溶性、较小的粒径与多分散系数、较高的载药量和包封率；复溶后3 d内稳定性良好。在室温环境下储存6个月，制剂的外观、粒径及多分散系数、包封率及载药量均无明显变化。 结论 选取0.4%蔗糖作为PTX/TPGS-CR胶束的冻干保护剂，复溶及常温下储存6个月均较稳定。

Graphical abstract

关键词

紫杉醇 / 聚合物胶束 / TPGS / 大黄酸 / 冻干保护剂 / 稳定性

紫杉醇（paclitaxel，PTX）在临床上常用于治疗恶性肿瘤，其作用机制为结合细胞微管蛋白，并促进微管蛋白聚合防止其解聚，使细胞有丝分裂阻滞于G2/M期，促进癌细胞凋亡，具有广泛的抗肿瘤活性^［1-2］。但PTX的水溶性差、生物利用度低，极大限制了其临床应用^［3-4］。因此，需要适当的递送方法来克服PTX应用缺陷。近年来，聚合物胶束（polymeric micelles，PMs）被广泛应用于递送难溶性抗肿瘤药物^［5-6］，其由两亲性聚合物自组装形成，由疏水嵌段的内核和亲水嵌段的外壳构成纳米级核-壳结构，其疏水内核可以包载难溶性药物进行递送^［7-9］。聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS）是维生素E的水溶性衍生物，具有良好的增溶性、乳化性、稳定性和P-糖蛋白抑制作用，被广泛应用到多药耐药（MDR）的药物载体中^［10-12］。羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan，CMCS）是壳聚糖水溶性衍生物，具有良好的生物相容性。大黄酸（Rhein，R）为中药大黄的主要成分之一，具有抗炎、抗癌细胞增殖、抗肿瘤血管生成等药理活性^［13］，并能与PTX起到协同抗肿瘤作用^［14-15］。前期研究已合成了TPGS修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸偶联物（TPGS-CR偶联物），并制备了载PTX的TPGS-CR偶联物胶束（PTX/TPGS-CR胶束）用于体内递送PTX^{［7，16-17］}。

大多情况下，载药聚合物胶束在冻干中呈现结构松散的绒毛状，从冻干机取出后制品因潮解而萎缩，外观差，且冻干过程中胶束随水分飞散，使成品含量偏低。一般冻干物固体含量＜5%时应加入冻干保护剂。本研究对PTX/TPGS-CR胶束制剂的单一和复合冻干保护剂进行考察，以外观、复溶性、粒径、多分散系数、载药量及包封率等为指标，优选冻干保护剂处方，并对该胶束制剂的稳定性进行初步考察，为临床用药和储存提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：JY92-2D）；冷冻干燥机（德国Christ公司，型号：ALPHA1-2 LD plus）；激光粒径测定仪（美国Santa Barbara公司，型号：NICOMPTM 380ZLS）；高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司，型号：LC-20AT）。

1.2 试药

TPGS-CR偶联物参考文献［17］自制；紫杉醇（上海金和药业有限公司，批号：201801004）；甲醇（色谱纯）、葡萄糖（分析纯）、蔗糖（分析纯）、甘露醇（分析纯）均购自国药集团化学试剂有限公司；乳糖（分析纯，天津永大化学试剂公司）。

2 方　法

2.1 PTX/TPGS-CR胶束制备

取TPGS-CR偶联物18 mg，加蒸馏水4 mL，冰水浴探头超声至均匀分散，形成TPGS-CR胶束。取PTX粉末18 mg完全溶解于0.6 mL无水乙醇中，并将其逐滴加至TPGS-CR胶束溶液中，高速搅拌20 min，在冰水浴中探头超声0.5 h，用蒸馏水透析24 h，再探头超声20 min，0.8 µm滤膜滤过，即得PTX/TPGS-CR胶束溶液。冷冻干燥后得PTX/TPGS-CR胶束粉末。

2.2 PTX分析方法的建立

2.2.1 色谱条件

Inertsil ODS-SP色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），流动相为甲醇-水（70∶30，V/V），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长227 nm，进样量20 µL。

2.2.2 标准曲线绘制

精密称取PTX粉末3.04 mg，置10 mL量瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度，得304 μg/mL PTX储备液。分别用甲醇稀释成浓度为60、30、24、15、6、1.5 μg/mL PTX溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定。

2.2.3 精密度与回收率

取高、中、低（45、22.5、3 μg/mL）浓度的PTX对照液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，在当天内连续进样6次，连续3 d进样测定，计算日内、日间精密度。

取高、中、低（45、22.5、3 μg/mL）浓度的PTX对照液，分别加入4.5 mg/mL TPGS-CR胶束溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。根据标准曲线计算加样回收率。

2.3 PTX/TPGS-CR胶束载药量和包封率测定

精密称取PTX/TPGS-CR胶束冻干粉末约3 mg，加蒸馏水2 mL，于冰水浴中探头200 W下超声10 min溶解，0.8 μm滤膜过滤后取200 μL用甲醇稀释至10 mL（使胶束结构破坏，释放出PTX），14 000 r/min离心5 min后，取上清液按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积，代入回归方程计算得PTX的含量，按下列公式计算PTX的载药量和包封率。

\mathrm{载药}\mathrm{量}=\frac{\mathrm{载入}\mathrm{胶束}\mathrm{中}\mathrm{P}\mathrm{T}\mathrm{X}\mathrm{的重}\mathrm{量}}{\mathrm{载药}\mathrm{胶束}\mathrm{的重}\mathrm{量}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

\mathrm{包封}\mathrm{率}=\frac{\mathrm{载入}\mathrm{胶束}\mathrm{中}\mathrm{P}\mathrm{T}\mathrm{X}\mathrm{的重}\mathrm{量}}{\mathrm{P}\mathrm{T}\mathrm{X}\mathrm{投药}\mathrm{量}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

2.4 PTX/TPGS-CR 胶束冻干保护剂的筛选

在制备好的PTX/TPGS-CR胶束溶液中，加入不同冻干保护剂种类和浓度后冻干，以外观、复溶性、粒径、多分散系数、载药量及包封率为指标，考察不同浓度葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖及复合冻干保护剂对PTX胶束的保护作用效果，外观及复溶性等级评价指标见表1。

2.5 最佳冻干保护剂验证

PTX/TPGS-CR胶束溶液加入筛选出的最佳冻干保护剂，制备3批PTX/TPGS-CR胶束冻干制剂进行验证。

2.6 PTX/TPGS-CR胶束冻干制剂稳定性试验

2.6.1 复溶稳定性

以粒径、多分散系数、载药量以及包封率为评价指标，考察复溶3 d后PTX/TPGS-CR胶束冻干制剂在室温条件下的放置稳定性。

2.6.2 长期储存稳定性

将PTX/TPGS-CR胶束冻干粉末置于室温条件下，并分别于0、3、6个月取样，观察样品的外观，并测定粒径、多分散系数、载药量以及包封率，考察PTX/TPGS-CR胶束冻干制剂的长期放置稳定性。

2.7 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行数据分析，计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示。

3 结　果

3.1 PTX分析

3.1.1 PTX标准曲线

以峰面积A对PTX浓度C进行线性回归，得PTX含量测定的回归方程为A＝5.72×10⁴C＋6.71×10³（r＝0.999 9），PTX在1.5～60.8 μg/mL范围内线性关系良好。HPLC图谱见图1。

3.1.2 精密度与回收率实验

高、中、低3个浓度的回收率分别为（98.87±0.65）%、（99.93±0.40）%和（99.47±0.26）%；日内精密度RSD分别为0.35%、0.31%和0.20%；日间精密度RSD分别为4.30%、1.40%和1.12%。回收率、精密度良好，符合含量测定方法学要求。

3.2 PTX/TPGS-CR胶束最佳冻干保护剂筛选

使用单一冻干保护剂时，各制剂复溶后粒径皆较未加冻干保护剂的胶束复溶粒径小，说明冻干保护效果较好。以葡萄糖作为保护剂时，胶束的复溶性随浓度增加变好，具有较高的载药量和包封率；以甘露醇作为保护剂，载药量随甘露醇浓度的增大而减小；以乳糖作为保护剂时，载药量和包封率相对较小。甘露醇和乳糖对改善冻干制剂的外观效果较好。以蔗糖作为保护剂时，胶束的粒径较小，复溶性随浓度增加变好，浓度对载药量的影响小，其中，0.4%的蔗糖为保护剂时，具有较高的载药量和包封率，复溶性及复溶稳定性好，冻干保护效果最优。

为进一步考察复合冻干保护剂是否有更好的保护效果，将以上4种冻干保护剂两两组合使用，组成复合冻干保护剂，评价其冻干保护效果。在各组合的复合冻干保护剂中，仍以含有甘露醇和乳糖成分的冻干制剂外观较好。以0.2%蔗糖＋0.2%乳糖作为冻干保护剂时，具有较高的载药量和包封率；粒径与不加冻干保护剂的制剂相比，粒径减小、多分散系数较小、外观平整、复溶性好。当冻干保护剂总浓度增加到0.6%时，各组制剂均容易塌陷及吸湿。总体看来，加了复合冻干保护剂的各PTX/TPGS-CR胶束冻干制剂复溶后的粒径稍差于单一冻干保护剂。综合以上结果，选用0.4%蔗糖作为PTX/TPGS-CR胶束的冻干保护剂。见表2。

3.3 PTX/TPGS-CR胶束最佳冻干保护剂验证

PTX/TPGS-CR胶束溶液加入0.4%蔗糖冻干保护剂，制备3批PTX/TPGS-CR胶束冻干制剂进行验证。所得冻干制剂为黄色，呈均一多孔蜂窝状，复溶后得黄色澄清液体。动态光散射法测得胶束粒径为（191.1±17.0）nm，多分散系数为（0.117±0.035），粒径分布较为均匀；载药量为（44.25±3.43）%，包封率为（80.11±9.33）%。

3.4 PTX/TPGS-CR胶束冻干制剂复溶后稳定性

PTX/TPGS-CR胶束冻干制剂复溶后在室温条件下放置3 d，粒径基本无变化，粒径分布均匀，载药量无明显变化，包封率略微下降，说明3 d内复溶的PTX/TPGS-CR胶束溶液稳定性良好。见表3。

3.5 PTX/TPGS-CR胶束冻干制剂储存稳定性

3个月内PTX/TPGS-CR胶束载药量、粒径基本无变化，粒径分布均匀，包封率略微下降。随储存时间延长至6个月，载药量与包封率均有略微下降，但粒径稳定，说明室温下PTX/TPGS-CR胶束冻干制剂长时间储存较稳定。见表4。

4 讨　论

本研究以外观、复溶性、粒径、多分散系数、载药量和包封率等为指标，多方面综合评价，考察了不同冻干保护剂对PTX/TPGS-CR胶束制剂的保护作用效果。

在冻干保护剂筛选结果中，不加冻干保护剂的PTX/TPGS-CR胶束冻干制剂呈鲜黄色棉絮状，表面粗糙，有部分飞絮，质地松散，再分散性和复溶稳定性较差。加入冻干保护剂后，PTX/TPGS-CR胶束冻干制剂表面均无飞絮，色泽均一。综合冻干制剂的外观、复溶后的粒径、多分散系数、载药量和包封率等指标，最终选用0.4%蔗糖作为PTX/TPGS-CR胶束的冻干保护剂。稳定性试验结果表明，加入0.4%蔗糖作为冻干保护剂后，PTX/TPGS-CR胶束冻干制剂在常温环境下能保持制剂的稳定性，储存稳定性良好，为临床用药和储存提供参考。

参考文献

[1] WANDERLEY C W， COLÓN D F， LUIZ J P M，et al. Paclitaxel reduces tumor growth by reprogramming tumor-associated macrophages to an M1 profile in a TLR4-dependent manner ［J］. Cancer Res，2018，78（20）：5891-5900.

[2] YANG Y H， MAO J W， TAN X L. Research progress on the source，production，and anti-cancer mechanisms of paclitaxel ［J］. Chin J Nat Med，2020，18（12）：890-897.

[3] ASHRAFIZADEH M， AHMADI Z， MOHAMADI N，et al. Chitosan-based advanced materials for docetaxel and paclitaxel delivery：recent advances and future directions in cancer theranostics ［J］. Int J Biol Macromol，2020，145：282-300.

[4] WANG X Y， QIU L Z， WANG X Y，et al. Evaluation of intestinal permeation enhancement with carboxymethyl chitosan-rhein polymeric micelles for oral delivery of paclitaxel ［J］. Int J Pharm，2020，573：118840.

[5] HWANG D， RAMSEY J D， KABANOV A V. Polymeric micelles for the delivery of poorly soluble drugs：from nanoformulation to clinical approval ［J］. Adv Drug Deliv Rev，2020，156：80-118.

[6] GHOSH B， BISWAS S. Polymeric micelles in cancer therapy：state of the art ［J］. J Control Release，2021，332：127-147.

[7] 邱梁桢，王夏英，曹春秀，等. TPGS修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸聚合物胶束的制备与表征［J］. 沈阳药科大学学报，2019，36（4）：300-307，380.

[8] 张攀，汪子翔，张宜凡，等. 天然产物抗乳腺肿瘤纳米给药系统研究进展［J］. 中国药学杂志，2021，56（6）：429-435.

[9] 王晓颖，王夏英，邱梁桢，等. 载紫杉醇的大黄酸偶联物胶束对MCF-7细胞的毒性与细胞摄取研究［J］. 中国药科大学学报，2020，51（1）：33-37.

[10] REN T M， LI R Z， ZHAO L Q，et al. Biological fate and interaction with cytochromes P450 of the nanocarrier material，d-α- tocopheryl polyethylene glycol 1 000 succinate ［J］. Acta Pharm Sin B，2022，12（7）：3156-3166.

[11] BERNABEU E， GONZALEZ L， CAGEL M，et al. Deoxycholate-TPGS mixed nanomicelles for encapsulation of methotrexate with enhanced in vitro cytotoxicity on breast cancer cell lines ［J］. J Drug Deliv Sci Technol，2019，50：293-304.

[12] 陈田娥，王鸽，陈敏婷，等. TPGS-壳聚糖载紫杉醇胶束的制备及大鼠在体肠吸收研究［J］. 中草药，2018，49（24）：5780-5786.

[13] 朱闽，彭杰，蒋越，等. 大黄防治前列腺癌的质量标志物研究及分子对接验证［J］. 世界中医药，2021，16（20）：2999-3006.

[14] WANG X Y， GUO Y L， QIU L Z，et al. Preparation and evaluation of carboxymethyl chitosan-rhein polymeric micelles with synergistic antitumor effect for oral delivery of paclitaxel ［J］. Carbohydr Polym，2019，206：121-131.

[15] LIU S， WANG J， SHAO T，et al. The natural agent rhein induces β-catenin degradation and tumour growth arrest ［J］. J Cell Mol Med，2018，22（1）：589-599.

[16] WANG X Y， ZHENG Y L， QIU L Z，et al. Evaluation and antitumor mechanism of functionalized chitosan-based polymeric micelles for oral delivery of paclitaxel ［J］. Int J Pharm，2022，625：122138.

[17] 欧阳惠枝，邱梁桢，王夏英，等. 载紫杉醇的大黄酸偶联物纳米胶束的制备及初步评价［J］. 中国药学杂志，2020，55（7）：534-541.

基金资助

国家自然科学基金项目(81603301)

福建省科技厅引导性项目(2020Y0050)