基于等高线生成算法的多花黄精中多糖、皂苷提取工艺优化研究

摘要

目的 基于等高线生成算法优化多花黄精中多糖和皂苷的提取工艺。 方法 运用U{}_{\mathrm{10}}^{\mathrm{*}}（10⁸）均匀试验设计，以多糖和皂苷含量为评价指标，采用等高线生成算法研究乙醇浓度、提取时间、提取次数、提取温度和固液比对多花黄精中多糖、皂苷含量的影响。 结果 乙醇浓度、提取时间、提取次数、提取温度、固液比对多花黄精中多糖和皂苷的含量均有明显影响，筛选出多花黄精中多糖和皂苷含量的最佳提取条件为：乙醇浓度50%～70%、提取时间140～150 min、提取温度50～60 ℃、固液比1∶14～1∶18、提取次数2次。 结论 等高线生成算法优化的多花黄精中多糖、总皂苷的提取工艺合理可行。

Graphical abstract

关键词

多花黄精 / 多糖 / 皂苷 / 等高线 / 均匀试验设计

多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua.为百合科黄精属植物，可药食两用，是《中华人民共和国药典：一部》^［1］收载3种黄精基源之一，也是“福九味”之一，其野生资源主要分布于福建省三明龙栖山、闽江源及君子峰等自然保护区，人工种植面积超万亩^［2-3］，其药用部位根茎中主要活性成分多糖具有抗炎、抗氧化、抗衰老等作用，皂苷具有增强免疫、抑制肿瘤等生物活性^［4-5］，广泛应用于中医药临床、食品、化妆品等领域，需求量大，市场前景广阔^［6］。

目前已有研究对黄精多糖或皂苷提取的主要影响因素如温度、时间、液料比等进行优化^［7-8］，但以多糖和皂苷含量为综合指标的多花黄精提取工艺优化研究较少。均匀设计能将多因素、多水平试验点在高维空间内充分均匀分布，使试验点更具有代表性^［9］，同时结合等高线生成算法可以反映各因素与考察指标之间的关系，从而实现对多因素最佳水平范围的快速筛选^［10］。因此，本研究应用等高线生成算法，对多花黄精中多糖、皂苷的最佳提取工艺进行优化，以期为更好利用多花黄精及其产品的深加工提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司，型号：FA20004N）；超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-500E）；紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司，型号：UV-9100）；循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司，型号：SHB-Ⅲ）；数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司，型号：HH-4）。

1.2 试药

黄精药材经福建中医药大学药学院王河山实验师鉴定为多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua.的干燥根茎；对照品人参皂苷Rb1、对照品葡萄糖、0.2%蒽酮硫酸溶液、5％香草醛-冰乙酸溶液、浓硫酸、甲醇、乙醇试剂均为分析纯，购自上海源叶生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 多糖含量测定

称取葡萄糖标准品0.01 g，用去离子水将其定容至100 mL，使其浓度为0.1 mg/mL，分别从中移取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，定容至10 mL。分别取上述溶液各1.0 mL，置于冷水浴中，加入0.2%蒽酮-硫酸溶液4 mL，混匀后沸水浴20 min，取出用水冲洗2 min，静置10 min，在波长582 nm处测定吸光度值^［5］。以吸光度值为纵坐标Y，葡萄糖含量（mg）为横坐标X，绘制标准曲线，得到回归方程为Y＝1.165X＋0.004（r²＝0.998）。

2.2 皂苷含量测定

取人参皂苷Rb1标准品10 mg，用甲醇将标准品定容至10 mL，分别移取0.16、0.24、0.55、1.10、1.50 mL，将其干燥后放入冷水浴中，分别加入5 mL 60％浓硫酸和0.2 mL 5％香草醛-冰乙酸溶液，混合均匀，60 ℃下水浴20 min。用自来水清洗2 min，在波长547 nm处测量吸光度值。将吸光度值设为纵坐标Y，皂苷含量（mg）为横坐标X，绘制标准曲线，得到回归方程为Y＝0.009X＋0.001（r²＝0.995）。

2.3 均匀试验设计

采用U{}_{\mathrm{10}}^{\mathrm{*}}（10⁸）均匀设计表，选择乙醇浓度（A）、提取时间（B）、提取次数（C）、提取温度（D）、固液比（E）为影响多花黄精中多糖和皂苷提取效率的主要因素，每个因素设置10个不同水平，组方设计，得到10组试验方案。均匀试验因素水平设计见表1，均匀设计试验方案见表2。分别称取黄精药材10组，按试验方案提取多花黄精样品，分别过滤、减压回收、浓缩，制成浓度为1 g/mL的样品溶液，备用。取适量的样品液，分别按照“2.1”“2.2”项下方法测定样品溶液中多糖和皂苷的OD值，以标准曲线法分别计算样品中多糖和皂苷的含量，见表2。

2.4 基于等高线算法筛选最佳提取条件

2.4.1 等高线生成算法

克里金插值法是一种无偏、线性，通过已知点推求未知点的最优等高线生成算法，其核心是变异函数^［11］。

\gamma \left(h\right)=\frac{\mathrm{1}}{\mathrm{2}N(h)}\left[Z\left(U_{\alpha }\right)-Z\left(U_{\alpha }+h\right)\right]（1）

其中，N（h）为距离相隔为h的点对数，Z是特征值，γ（h）表示变异函数值。

变异函数的核心思想是按照点对间的距离大小分组，对每一个组中的每一个点对进行插值计算，求算平均值，即可得到变异函数值。在普通克里金插值中，待测点的特征值是根据周围的已知点的线性组合推求得出^［10］。

\widehat{Z}\left(v_{\mathrm{0}}\right)={\sum }_{i=\mathrm{1}}^n{\lambda }_{i}Z\left(v_i\right)（2）

\widehat{Z}\left(v_{\mathrm{0}}\right)表示待测点v_{\mathrm{0}}的估计值；Z\left(v_i\right)表示v_{\mathrm{0}}周围观测点v_i的特征值；n为参与计算的观测点的个数；{\lambda }_i表示权重系数。为了得到待测点的估计值，需要求出各个权重系数。

在二阶平稳条件下满足无偏性和最优性^［8］。

{\sum }_{i=\mathrm{1}}^n{\lambda }_i=\mathrm{1}（3）

{\delta }^{\mathrm{2}}=E{\left[\widehat{Z}\left(v_{\mathrm{0}}\right)-Z\left(v_{\mathrm{0}}\right)\right]}^{\mathrm{2}}（4）

经过推导，建立方程组。

\left\{\begin{array}{c}{\sum }_{i=\mathrm{1}}^n{\lambda }_i=\mathrm{1}\\ {\sum }_{i=\mathrm{1}}^n{\lambda }_i\gamma \left[Z\left(v_i\right),Z(v_j)\right]-\mu =\gamma \left[Z\left(v_i\right),Z(v_{\mathrm{0}})\right]\end{array}\right.（5）

i，j＝1，2，……，n

\gamma \left[Z\left(v_i\right),Z(v_j)\right]表示2个观测点v_i和v_j的变异函数，μ为拉格朗日系数。

根据观测点计算得到的变异函数是一系列离散点，对这些离散点进行模型拟合，使之能够得到任意距离关系的变异函数，通过变异函数拟合得到的曲线，求解方程组，求出权重系数和拉格朗日系数，从而推求出相应位置上待测点的估计值^［12］。在Windows环境下，以Visual C++为开发平台，采用克里金插值生成算法，将实验获得的数据与考察变量绘成多幅二维图，考察不同的影响因素与考察指标之间的关系，同时从数幅图中找出最佳工艺的优化区域，实现简单、快速、可视化的最佳条件筛选研究。

2.4.2 乙醇浓度最佳范围筛选

用40%以下乙醇浓度提取时，对多花黄精中皂苷和多糖的提取效果影响度浅，提取效率低；50%～70%乙醇对多花黄精中皂苷和多糖的提取效果影响度最深，表明提取效率高。综合提取时间、次数、固液比3个参考因素，确定多花黄精中总皂苷、多糖提取的最适宜乙醇浓度为50%～70%。见图1、图2。

2.4.3 提取时间最佳范围筛选

提取时间为90～110 min和140～150 min时对多花黄精中的皂苷、多糖提取效果影响度最深，提取效率高。综合以提取温度、次数和固液比为参考因素，样品中多糖、皂苷提取的最佳时间范围为140～150 min。见图3、图4。

2.4.4 提取次数最佳范围筛选

提取次数对样品中多糖、皂苷的提取效果影响程度无明显差别，提取次数为2次时达到最佳。见图5、图6。

2.4.5 提取温度最佳范围筛选

提取所用温度在50～60 ℃和75～85 ℃时，对样品中多糖、皂苷提取效果影响度最深，其提取率高。综合提取时间、次数和固液比为参考因素，样品中多糖、皂苷的提取最佳温度范围为50～60 ℃。见图7、图8。

2.4.6 固液比最佳范围筛选

提取时固液比低于1∶10时，对皂苷、多糖提取效果影响度浅，提取率低；固液比为1∶14～1∶18时，对皂苷、多糖提取效果影响度最深，提取率高。综合以乙醇浓度、提取时间、温度为参考因素，样品中皂苷、多糖提取率固液比的最佳范围为1∶14～1∶18。见图9、图10。

2.5 验证试验

对等高线生成算法确定的样品中多糖和皂苷最佳提取条件：乙醇浓度50%～70%、提取时间140～150 min、提取温度50～60 ℃、固液比1∶14～1∶18、提取次数2次，分别进行3个批次的验证试验。结果表明3个批次样品中多糖、皂苷的平均含量分别为（0.26±0.04）mg和（1.61±0.34）mg，均高于均匀设计中的组合试验测定结果，表明上述优化的工艺合理可行。

3 讨　论

多花黄精作为闽产特色中药材，已在福建省闽北地区规模化种植，目前已开发黄精茶、黄精丸等初加工产品，而深加工产品有待进一步开发^［6］。本试验采用均匀设计法对多花黄精中多糖、皂苷的最佳提取工艺进行优化，为多花黄精的多糖、皂苷等产品提取技术提供参考。

均匀设计适用于因素和水平较多的试验，相对正交设计和响应面法，其在较少的试验次数就能得到更多各因素间的交互信息，针对因素水平范围较大的工艺优化研究具有简便、高效的特点^{［9，13-14］}。特别是本次试验结果缺乏整齐可比性，用传统的方差分析法难以对数据进行有效分析，因此本研究尝试通过非线性、线性、逐步回归等方法对变量进行筛选，以构建多元/一元函数模型对试验结果进行定量分析。其中，采用非线性、线性和逐步回归的方法分析本次试验结果，很难建立有效的函数模型，故进一步引入等高线生成算法将试验数据与考察变量绘成多幅二维图，通过分析2种不同影响因素与考察指标之间的关系，可以快速从二维图中找出最佳提取工艺的优化区域，从而筛选出多花黄精中多糖、皂苷提取的最适宜条件，即乙醇浓度50%～70%、提取时间140～150 min、提取温度50～60 ℃、固液比1∶14～1∶18、提取次数2次。

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基金资助

福建中医药大学校管课题（X2020001-重点）