乙氧基血根碱改善血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠心肌纤维化的实验研究

Ethoxysanguinarine Alleviates Angiotensin Ⅱ-induced Cardiac Fibrosis in Mice

摘要

目的 探讨乙氧基血根碱对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的小鼠心肌纤维化的影响及作用机制。 方法 构建AngⅡ诱导的高血压小鼠心肌纤维化模型，根据小鼠的基线血压随机分为空白组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性药组。除空白组之外的其余各组小鼠皮下以500 ng/（kg·min）的速率释放AngⅡ，空白组在泵内注入等量体积生理盐水，持续4周；低、中、高剂量组从术后第1天起分别给予0.1、1、10 mg/（kg·d）乙氧基血根碱灌胃，空白组和模型组给予等体积生理盐水，阳性药组给予10 mg/（kg·d）缬沙坦，连续灌胃给药28 d。采用Masson染色及天狼星红染色法检测6组小鼠心肌纤维化及胶原沉积情况；Western blot检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、增殖细胞核抗原（PCNA）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤维连接蛋白（FN）及TGF-β1/smad2/3信号通路相关蛋白TGF-β1、p-smad2/3、smad2/3的蛋白表达量。 结果 与空白组比较，模型组小鼠心肌细胞出现明显纤维化及胶原沉积，心脏组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、PCNA、α-SMA及FN的蛋白表达显著增加（P＜0.05），通路相关蛋白TGF-β1表达、p-smad2/smad2比值及p-smad3/smad3比值显著上调（P＜0.05），而乙氧基血根碱给药后，心肌的纤维化及胶原沉积情况均明显改善，Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、PCNA、α-SMA、FN、TGF-β1等蛋白表达及p-smad2/smad2和p-smad3/smad3比值均显著下调（P＜0.05），且乙氧基血根碱对小鼠心肌纤维化改善的作用呈剂量依赖性（P＜0.05）。 结论 乙氧基血根碱可改善AngⅡ诱导的心肌纤维化，通过抑制TGF-β/smad2/3通路的活化可能是其发挥作用的机制之一。

Abstract

Objective To investigate the effect and mechanism of Ethoxysanguinarine (ETH) on cardiac fibrosis induced by Angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) in mice. Methods Cardiac fibrosis model of hypertensive mice induced by AngⅡwas established. The mice were randomly divided into blank group, model group, ETH-low, ETH-medium and ETH-high groups, positive drug group. ALL the mice except the blank group were injected with Ang Ⅱ at a rate of 500 ng/(kg·min) subcutaneously while the blank group was injected with the same volume of normal saline for four weeks. From the first day after surgery, the ETH-low, ETH-medium and ETH-high groups were given 0.1, 1, and 10 mg/(kg·d) of ETH by gavage. Respectively, the blank group and the model group were given the same volume of normal saline, and the positive drug group was given 10 mg/(kg·d) of Valsartan. All groups were given drugs by continuous gavage for 28 days. Masson staining and Sirius red staining were used to detect cardiac fibrosis and collagen deposition in mice. The expression of collagen I, collagen Ⅲ, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), α-smooth muscle actin (α-SMA), fibronectin (FN) and TGF-β1/smad2/3 signaling pathway-related proteins TGF-β1, p-smad2, smad2, p-smad3 and smad3 were detected by Western blot. Results Compared with the blank group, there was significant cardiac fibrosis and collagen deposition in mice cardiomyocytes in the model group, the protein expression of collagen-I, collagen Ⅲ, PCNA, α-SMA, FN, TGF-β1, p-smad2, smad2, p-smad3 and smad3 ratio in heart tissue were significantly up-regulated (P<0.05), which were significantly reverssed after ETH accompanied with alleviation of cardiac fibrosis and collagen deposition in a dose-dependent manner (P<0.05). Conclusion ETH can alleviate AngⅡ- induced cardiac fibrosis, the inhibition of TGF-β1/smad2/3 pathway may be one of the important mechanisms.

Graphical abstract

关键词

高血压 / 心肌纤维化 / 乙氧基血根碱 / TGF-β1/smad2/3信号通路

Key words

hypertension / cardiac fibrosis / ethoxysanguinarine / TGF-β1/smad2/3 signaling pathway

高血压是心血管疾病的主要危险因素。我国有超过3.3亿人患有高血压，已成为日益严重的公共卫生问题^［1-2］。高血压患者因长期压力过载可导致左室肥厚、心肌纤维化等改变，心脏进行性重构，最终出现心力衰竭，严重危害居民身心健康^［3］。因此，进一步探究更为有效的高血压防治途径，减缓心脏的损害尤为关键。

乙氧基血根碱（Ethoxysanguinarine，ETH）是血根碱氨化乙醇提取过程的结晶产物。2021年课题组首次发现乙氧基血根碱具有降低血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的高血压小鼠血压及改善心脏功能的作用^［4］，但其改善心脏功能的具体作用机制有待深入研究。心肌纤维化是高血压患者心脏损伤的主要病理改变^［5］，预防心肌纤维化在高血压性心脏病的治疗中至关重要。因此，本研究从心肌纤维化角度探讨了乙氧基血根碱改善AngⅡ诱导的高血压心脏功能障碍的作用及其可能机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

36只雄性，SPF级，8周龄，C57BL/6小鼠，体质量（28±2） g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007。饲养在SPF级环境中（温度：22～26 ℃，黑暗/光明各12 h）。本研究方案经福建中医药大学动物伦理委员会批准（审批号：FJTCM IACUC 2022051）。

1.2 实验试剂

Masson染色试剂（货号：G1340）购自北京索莱宝科技有限公司；天狼星红染色试剂（货号：PH1099）购自福州飞净生物科技有限公司；增殖细胞核抗原（PCNA）（货号：ab29）购自英国Abcam公司；TGF-β1（货号：ABP52598）、GAPDH（货号：ABL1021）购自中国Abbkine Scientific公司；Ⅰ型胶原（货号：14695-1-AP）、Ⅲ型胶原（货号：22734-1-AP）、纤维连接蛋白（FN）（货号：15613-1-AP）购自美国Proteintech公司；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）（货号：40482）、p-smad2（货号：913429）、p-smad3（货号：12838）、smad2（货号：41442）、smad3（货号：41445）购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 实验仪器

电泳仪、转膜仪、化学成像系统购自美国Bio-Rad公司；普通显微镜、偏光显微镜购自德国Leica公司；低温高速离心机购自美国Thermo公司。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药

雄性C57BL/6小鼠36只，适应性喂养1周后，根据小鼠的基线血压随机分为空白组，模型组，低、中、高剂量组和阳性药组。渗透泵置于生理盐水中，37 ℃培养箱中孵育过夜激活，采用1.5%~2%异氟烷吸入麻醉小鼠，消毒后皮下植入渗透微泵。除空白组外的其余各组小鼠皮下以500 ng/（kg·min）的速率释放AngⅡ，空白组在泵内注入等量生理盐水，持续28 d；低、中、高剂量组从术后第1天起分别给予0.1、1、10 mg/（kg·d）乙氧基血根碱灌胃，空白组和模型组给予等体积生理盐水，阳性药组给予10 mg/（kg·d）缬沙坦，连续灌胃给药28 d。

2.2 观察指标

2.2.1 小鼠心脏纤维化

采用Masson染色评估各组小鼠心脏纤维化的阳性染色情况。28 d后麻醉处死小鼠。取出心脏，用4%多聚甲醛固定48 h，制作石蜡切片；切片进行脱蜡至蒸馏水中，Weigert铁苏木素液染5~10 min，冲洗液冲洗30 s；1%盐酸酒精分化8 min，流水冲洗，丽春红酸性复染液染色5 min，流水冲洗，1%磷钼酸水溶液染5~10 min，1%的冰醋酸水溶液处理2 min；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜观察小鼠心脏纤维化情况。每张切片随机选取高倍镜下的6个视野，评估纤维化的阳性染色。

2.2.2 小鼠心脏胶原沉积情况

采用天狼星红染色评估各组小鼠心脏胶原沉积情况。心脏组织4 μm切片，常规脱蜡，然后用天狼星红染色1 h，自来水冲洗，苏木精染色8 min，自来水冲洗10 min。采用偏光显微镜400倍镜下观察拍照。使用Image Pro-Plus软件，在6个显微镜视野下评估胶原沉积的区域。

2.2.3 Western blot检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、PCNA、α-SMA、FN、TGF-β1、p-smad2/3及smad2/3蛋白表达量

取适量心脏组织样本，裂解液裂解，4 ℃高速离心机（14 000 r/min）离心20 min。根据BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度。加入SDS在100 ℃的金属水浴锅变性。利用SDS-PAGE胶进行电泳，结束后，将其转移到PVDF膜上。用牛奶在室温下封闭2 h，4 ℃孵育Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、PCNA、α-SMA、FN、TGF-β1、p-smad2/3及smad2/3一抗过夜。用含0.2% Tween的TBST洗涤3次，每次洗涤10 min，然后加入相应的二抗在室温继续孵育2 h，用TBST洗涤3次，最后加入ECL显影剂（A液∶B液＝1∶1），置于凝胶成像系统中进行成像、扫描。

2.3 统计学方法

采用SPSS 23.0软件分析数据，GraphPad Prism 5软件进行数据图绘制。在3组或更多组之间进行差异比较时，当计量资料服从正态分布时用（\overline{x}±s）表示，使用单因素方差分析进行比较，方差齐时使用LSD-t进行事后检验；当方差不齐时使用Games-Howell进行事后检验；当计量资料不服从正态分布时用［M（P₂₅，P₇₅）］表示，采用非参数Kruskal-Wallis检验用于比较数据的组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 6组小鼠心脏组织心肌纤维化程度及胶原沉积情况比较

与空白组比较，模型组小鼠心肌间质和血管周围出现明显纤维化及胶原沉积（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组及阳性药组心肌间质和血管周围纤维化及胶原沉积程度显著减少，且作用呈剂量依赖性（P＜0.05）。图1、表1、图2、表2。

3.2 6组小鼠心脏组织中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达情况

与空白组比较，模型组小鼠心脏组织中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的蛋白表达均显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，低中高剂量及阳性药组心脏组织中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的蛋白表达均显著减少（P＜0.05）。见图3、表3。

3.3 小鼠心脏组织中PCNA蛋白表达情况

与空白组比较，模型组心脏组织中PCNA的表达显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量及阳性药组心脏组织中PCNA的表达均明显减弱（P＜0.05），表明乙氧基血根碱处理显著抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞的增加。见图4、表4。

3.4 6组小鼠心肌成纤维细胞α-SMA、FN蛋白表达情况

与空白组比较，模型组心脏组织中α-SMA及FN蛋白的表达增加（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组及阳性药组心脏组织中α-SMA及FN的蛋白表达均显著减少（P＜0.05）。见图5、表5。

3.5 6组小鼠心脏组织TGF-β1、p-smad2/3及smad2/3蛋白表达情况

与空白组比较，模型组小鼠心脏组织中TGF-β1的蛋白表达、p-smad2/smad2比值及p-smad3/smad3比值显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组及阳性药组心脏组织中TGF-β1的表达、p-smad2/smad2比值及p-smad3/smad3比值均显著下降（P＜0.05）。见图6、表6。

4 讨　论

高血压性心脏病是高血压最常见的并发症之一，最终可引起心力衰竭导致患者死亡。本课题组在前期抗高血压新药及机制研究过程中发现，降压新成分乙氧基血根碱具有显著降低AngⅡ诱导的高血压小鼠血压及改善心脏功能的作用^［4］。研究表明心肌纤维化是高血压患者心脏损伤的主要病理改变^［5］，表现为正常心脏组织中出现胶原的过度沉积、排列紊乱、比例失调，心脏纤维化不仅加重心肌缺血缺氧，而且心室顺应性下降，经过一系列的变化最终导致心室腔逐渐扩大，心室收缩和舒张功能均严重受损，进而出现心力衰竭^［5-8］。故预防心肌纤维化在高血压性心脏病的治疗中至关重要。

RAAS的激活是心肌纤维化的主要原因，AngⅡ在这一过程中起着重要的调控作用^［9-10］。AngⅡ可通过激活血管紧张素Ⅰ型受体，刺激心肌成纤维细胞的增殖和细胞外基质（ECM）蛋白的表达，引起心肌纤维化^［10］。因此，它可加速高血压心力衰竭^［10-12］。为此，本研究观察乙氧基血根碱对AngⅡ诱导的高血压小鼠心肌纤维化的影响。首先观察乙氧基血根碱对心肌纤维化及胶原沉积情况的影响，结果表明乙氧基血根碱治疗可以显著降低高血压小鼠的心肌纤维化及胶原蛋白的堆积，并显著下调心脏组织中Ⅰ型、Ⅲ胶原蛋白表达。

生理情况下，心脏受到外界损伤刺激时，心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，肌成纤维细胞增殖并向损伤部位迁移，合成胶原，修复损伤的心肌组织。病理状态下，如AngⅡ等细胞因子作用于心肌成纤维细胞，心肌成纤维细胞被过度激活，向肌成纤维细胞转化，并大量增殖分泌胶原蛋白，这些胶原蛋白在损伤部位累积，在初始阶段时起到维持心脏结构和功能的作用，但随着心脏纤维化程度的加重，最后出现心力衰竭。为此，本项目还观察了心肌成纤维细胞增殖及心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的标记物PCNA及α-SMA蛋白表达。结果显示，AngⅡ诱导的高血压小鼠心肌，PCNA及α-SMA蛋白表达显著升高，经乙氧基血根碱治疗后PCNA及α-SMA蛋白表达显著下调。可见乙氧基血根碱可能是通过减轻心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化增殖这一过程，发挥改善高血压导致心脏损伤。

研究表明TGF-β1/smad2/3通路在多种心肌纤维化模型中被激活^［13-14］。TGF-β1通过激活smad2和smad3磷酸化，并将其信号传递至细胞核内，影响多种促纤维化过程的关键介质，促进组织纤维化。本研究发现在AngⅡ刺激后，心脏组织中TGF-β1蛋白表达升高，p-smad2/smad2比值及p-smad3/smad3比值增加，乙氧基血根碱治疗可降低AngⅡ诱导的心脏组织中TGF-β1的蛋白表达及p-smad2/smad2和p-smad3/smad3的比值。

综上，本研究证实乙氧基血根碱可显著减轻AngⅡ诱导的高血压心肌纤维化，可能是通过调控TGF-β1/smad2/3通路抑制心肌成纤维细胞的分化。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2021J01940)

国家自然科学基金项目(U22A20372)

中华中医药学会青年人才托举工程项目(2021-QNRC2-B19)

福建中医药大学青年科研拔尖人才项目(XQB202202)