黄连解毒汤调控lncRNA MALAT1减轻小鼠脓肿创面炎性焦亡的实验研究

摘要

目的 从lncRNA MALAT1调控炎性焦亡角度探讨黄连解毒汤促进小鼠脓肿创面愈合的作用机制。 方法 将48只C57BL/6雄性小鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为空白组12只、造模小鼠36只。造模小鼠予以皮肤开窗＋污染物覆盖的改良小鼠脓肿创面模型法制备模型，模型成功后再采用随机数字表法再分为模型组、中药组和对照组各12只。空白组小鼠进行常规饲养，模型组小鼠给予等体积生理盐水灌胃，中药组先采用0.1%雷夫诺尔冲洗创面，1次/d换药，再给予5 g/kg黄连解毒汤水煎液灌胃给药；对照组小鼠采用0.1%雷夫诺尔冲洗创面，1次/d换药，再给予等体积生理盐水灌胃；灌胃剂量依据小鼠体质量调整，干预共2周。干预结束后，经5%异氟醚吸入麻醉下处死各组小鼠，分离与收集小鼠脓肿创面皮肤组织。HE染色观察脓肿创面组织形态变化；qPCR检测各组小鼠脓肿创面组织中肺腺癌转移相关转录本1（MALAT1）水平变化；Western blot检测各组小鼠脓肿创面组织中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、半胱天冬酶-1（Caspase-1）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-18（IL-18）蛋白含量表达量。 结果 与空白组比较，模型组肉芽组织新生毛细血管减少，周围有大量炎性细胞浸润；与模型组比较，中药组、对照组新生毛细血管增多，与对照组比较，中药组炎性细胞浸润程度减轻，成纤维细胞数量增多。与空白组比较，模型组lncRNA MALAT1水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，中药组、对照组lncRNA MALAT1水平显著增高（P＜0.05）；与对照组比较，中药组lncRNA MALAT1水平显著增高（P＜0.05）。与空白组比较，模型组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白含量表达显著增高（P＜0.05）；与模型组比较，中药组、对照组的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的蛋白含量表达显著降低（P＜0.05）；与对照组比较，中药组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白含量表达显著降低（P＜0.05）。 结论 黄连解毒汤可减轻小鼠脓肿创面组织的炎性焦亡，促进皮肤愈合，与调控lncRNA MALAT1和NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达量有关。

Graphical abstract

关键词

脓肿创面 / 黄连解毒汤 / 炎性焦亡 / 皮肤愈合

创面愈合是影响肛周脓肿疾病转归的一个亟需解决的重要问题。鉴于临床肛周脓肿术后，其创面常暴露于开放环境，且易受排泄物污染，故而常引起术后创面延迟愈合。创面愈合缓慢或不愈合不仅进一步加剧患者感染风险，而且导致患者持续疼痛不适，严重影响其日常生活^［1-2］。研究表明，在内毒素（lipopolysaccharides，LPS）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等炎症因子影响下，尤其在炎症风暴持续作用下可引起细胞发生炎性焦亡，进而导致创口延迟愈合或不愈合发生^［3-5］。因此，改善脓肿创面炎性焦亡状态是促进肛周脓肿创面愈合的重要途径^［6］。

肛周脓肿所致创面愈合缓慢归属中医学“肛痈”范畴，其核心病机多为机体湿热蕴结、气血凝滞堵塞肛门所致，故对其治则宜行清热利湿、解毒养阴之法^［7］。黄连解毒汤具有清热利湿、解毒养阴之效，该方治疗肛周脓肿及促进术后创面愈合具有良效^［8］。lncRNA肺腺癌转移相关转录本（MALAT1）在创面愈合中发挥了关键调控作用^［9］。研究证实，MALAT1可通过调节miR-378a/FGF2轴促进皮肤创面愈合^［10］。另有研究表明，lncRNA MALAT1与炎性焦亡存在密切联系^［11-12］。但黄连解毒汤是否通过调控lncRNA MALAT1，改善小鼠脓肿创面炎性焦亡的作用机制尚需进一步探讨。

1 材　料

1.1 实验动物与药物

48只C57BL/6雄性小鼠（SPF级），由斯莱克（上海）实验动物有限责任公司提供［实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005］；实验动物常规饲养于福建中医药大学实验动物中心［使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007］，提供实验过程及方法均符合福建中医药大学实验动物伦理委员会要求（审批号：FJTCM IACUC 202305T）；雷夫诺尔（广东恒健制药有限公司，批号：221205）；黄连解毒汤购于福建中医药大学附属福州中医院中药房，方中黄连、黄芩、黄柏、栀子参照2020版《中华人民共和国药典》药物配比（9∶6∶6∶9）制成水煎液，浓缩至质量浓度为1 g/mL，低温下保存备用。

1.2 实验试剂

NLRP3（武汉Proteintech公司，货号：00090163）、Caspase-1（武汉Proteintech公司，货号：00092065）、IL-1β（武汉Proteintech公司，货号：00121535）、IL-18（武汉Proteintech公司，货号：00086146）、GAPDH（武汉Proteintech公司，货号：10029187）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：71642J2）；lncRNA MALAT1（5'：GGCACTGAAGGCT TAATGTAGG，3'：AAGGTGTTACGGTAGGGTAGTC）、GAPDH（5'：ACGGCAAGTTCAACGGCACAG，3'：GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC）（福州尚亚生物技术有限公司）。

1.3 实验仪器

电泳仪（美国Bio-RAD公司）；凝胶成像系统（GELDOC 2000型，美国Bio-RAD公司）；DNA扩增仪（9600型，美国PE公司）；低温高速离心机（64R型，美国Beckman公司）等。

2 方　法

2.1 动物分组、造模及干预

将48只C57BL/6雄性小鼠经适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为空白组12只、造模小鼠36只。造模小鼠予以皮肤开窗＋污染物覆盖的改良小鼠脓肿创面模型法制备模型^［13］，造模成功后再采用随机数字表法分为模型组、中药组和对照组各12只。空白组小鼠进行常规饲养，模型组小鼠给予等体积生理盐水灌胃，中药组先采用0.1%雷夫诺尔冲洗创面，1次/d换药，再给予5 g/kg黄连解毒汤水煎液灌胃给药^［14］；对照组小鼠采用0.1%雷夫诺尔冲洗创面，1次/d换药，再给予等体积生理盐水灌胃；灌胃剂量依据小鼠体质量调整，干预共2周。干预结束后，经5%异氟醚吸入麻醉下处死各组小鼠，分离与收集小鼠脓肿创面皮肤组织。

2.2 组织取材

末次灌胃后，各组小鼠经5 %异氟醚麻醉处死。分离与收集其小鼠脓肿创面组织，置于超低温环境下冻存。

2.3 观察指标

2.3.1 HE染色观察脓肿创面组织形态变化

取C57BL/6小鼠脓肿创面组织，置卡诺液中固定45 min，石蜡包埋、切片，行常规HE染色，观察各组脓肿创面组织形态变化。

2.3.2 小鼠脓肿创面组织中lncRNA MALAT1水平情况

采用TriZol法提取各组小鼠皮肤创面组织中总RNA，进行反转录及PCR，待反应完毕，确认Real-time PCR扩增曲线和溶解曲线，分析结果。观察黄连解毒汤对小鼠脓肿创面组织中lncRNA MALAT1水平影响。

2.3.3 小鼠皮肤创面组织中与炎性焦亡相关蛋白含量表达情况

提取小鼠脓肿创面组织总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，制胶（12%分离胶与5%浓缩胶）后，进行上样、电泳，依次进行转膜，封闭，置于NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18一抗中充分反应，孵育二抗后进行显影成像，分析结果。

2.4 统计学方法

采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。计量资料若符合正态分布采用（\overline{x}±s）表示，采用方差分析进行组间比较，如果方差齐，两两比较选用LSD-t法；如果方差不齐，两两比较则选用Games-Howell法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 实验动物情况

本次实验过程各组小鼠均未出现意外死亡。

3.2 HE染色结果

与空白组比较，模型组肉芽组织新生毛细血管减少，周围有大量炎性细胞浸润；与模型组比较，中药组、对照组新生毛细血管增多；与对照组比较，中药组炎性细胞浸润程度减轻，成纤维细胞数量增多。见图1。

3.3 4组皮肤创面组织中lncRNA MALAT1水平情况结果

qPCR结果显示：与空白组比较，模型组lncRNA MALAT1水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，中药组和对照组lncRNA MALAT1水平显著增高（P＜0.05）；与对照组比较，中药组lncRNA MALAT1水平显著增高（P＜0.05）。见表1。

3.4 4组脓肿创面组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白含量表达比较

与空白组比较，模型组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白含量表达显著增高（P＜0.05）；与模型组比较，中药组和对照组的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的蛋白含量表达显著降低（P＜0.05）；与对照组比较，中药组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白含量表达显著降低（P＜0.05）。见表2、图2。

4 讨　论

一般而言，肛周脓肿创伤愈合需要经历凝血及炎症、肉芽组织形成、再上皮化、创面收缩等过程^［15］。创面组织、细胞的炎症状态与分化功能的强弱，对创面愈合具有重要影响^［16-17］。焦亡作为一种炎性程序性细胞死亡方式，通常由炎性小体NLRP3引发。细胞发生炎性焦亡的过程主要由Caspase-1介导的传统信号通路介导，焦亡发生后会促使IL-1β和IL-18的前体加工裂解，转变成为成熟的活性形式，进一步加剧创面的炎症反应，导致创面延迟愈合^［18-19］。

lncRNA MALAT1在促进伤口愈合过程中发挥了重要作用^［20］。研究证实，敲低MALAT1显著抑制人成纤维细胞（HFF-1）的增殖、迁移和基质蛋白的表达，进而抑制伤口愈合^［21］。过表达MALAT1可提高DFU成纤维细胞的活力，抑制其凋亡和焦亡^［22］。本研究结果显示，在小鼠脓肿创面组织中，MALAT1水平较空白组显著降低，与相关研究报道一致^［23］。

黄连解毒汤源自唐代《外台秘要》，由黄芩、黄连、黄柏、栀子4味中药组方，方中黄连为君药，发挥清泻心和中焦火之效，黄芩性寒味苦，可清上焦之火为臣药；佐以黄柏可泻下焦之火；栀子为使药，可通泻三焦^［24］。课题组前期临床研究亦发现，黄连解毒汤可显著降低肛周脓肿手术患者炎性因子水平，改善创口肿胀状态，促进创口愈合^［25］。本实验形态学染色结果证实，经黄连解毒汤干预后，脓肿创面组织处的新生毛细血管、成纤维细胞数量明显增多，炎性细胞浸润程度显著降低。此外，与模型组比较，中药组和对照组的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的蛋白含量表达显著降低，lncRNA MALAT1水平显著增高，而中药组疗效显著优于对照组（P＜0.05）。进一步验证了黄连解毒汤可通过抑制炎性焦亡，促进脓肿创面愈合的作用。

综上表明，黄连解毒汤可有效减轻脓肿创面组织处的炎性焦亡，其作用机制与调控lncRNA MALAT1与NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的表达密切相关。同时，本研究仍具有一定的局限性，如黄连解毒汤是否调控lncRNA MALAT1与关联miRNA构建的ceRNA发挥作用的确切机制仍需深入研究。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2023J011560)

2021年度福州市卫生健康科技创新平台项目-福州市中医药传承创新平台(2021-S-wp3)

福建省2022年省级临床重点专科建设项目(闽卫医政函（2022）884号)