泰山磐石散对自然流产模型大鼠子宫蜕膜组织中T-bet/GATA-3的影响

摘要

目的 观察泰山磐石散对自然流产模型大鼠子宫蜕膜组织中T盒子转录因子（T-bet）/GATA结合蛋白3（GATA-3）表达量的影响。 方法 将15只SPF级雌性妊娠SD大鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组和治疗组，每组5只。空白组于妊娠的第1～11天灌服生理盐水，第6～8天皮下注射生理盐水；模型组于妊娠的第1～11天灌服生理盐水，第6～8天皮下注射0.4 mg/（kg·d）溴隐亭溶液；治疗组于妊娠的第1～11天灌服10 g/（kg·d）泰山磐石散药液，第6～8天皮下注射0.4 mg/（kg·d）溴隐亭溶液。实验期间分别记录3组大鼠妊娠第1天和第11天的体质量，计算3组大鼠体质量增长情况。实验结束次日取材，观察并记录胚胎总数和胚胎吸收数，并计算胚胎吸收率。HE染色观察子宫蜕膜组织形态学的改变；免疫组化法检测3组大鼠子宫蜕膜组织中T-bet和GATA-3蛋白表达水平；Western blot检测3组大鼠子宫蜕膜组织中T-bet和GATA-3的蛋白表达量。 结果 与空白组比较，模型组大鼠体质量增加缓慢，胚胎吸收率明显升高，子宫蜕膜组织中T-bet的蛋白表达水平明显升高，GATA-3的蛋白表达水平明显降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组大鼠体质量明显增加，胚胎吸收率明显降低，子宫蜕膜组织中T-bet的蛋白表达水平明显降低，GATA-3的蛋白表达水平明显升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 结论 泰山磐石散可能是通过下调Th1/Th2特异性转录因子T-bet/GATA-3的表达，从而改善胚胎流产情况。

Graphical abstract

关键词

自然流产 / 蜕膜组织 / 泰山磐石散 / T-bet / GATA-3

自然流产（spontaneous abortion，SA），中医学属“胎漏”“滑胎”“胎动不安”^［1］。据统计SA发病风险占临床妊娠的10%～15%^［2］。其病因十分复杂，包括免疫调节失衡、内分泌异常、子宫解剖结构异常等^［3］。有研究表明，免疫调节失衡是SA的重要病理机制之一^［4］。T盒子转录因子（T-bet）和GATA结合蛋白3（GATA-3）是重要的免疫调节因子，它们对免疫细胞的分化和功能具有重要作用^［5］。泰山磐石散是治疗SA的经典方剂，也是我国古代安胎方剂中的代表之一，出自《古今医统大全》，由人参一钱（3 g）、黄芪一钱（3 g）、白术五分（1.5 g）、炙甘草五分（1.5 g）、当归一钱（3 g）、川芎八分（2 g）、白芍药八分（2 g）、熟地黄八分（2 g）、川续断一钱（3 g）、糯米一撮（3 g）、黄芩一钱（3 g）、砂仁五分（1.5 g）组成^［6］。前期研究表明，泰山磐石散可以明显降低大鼠血清中Th1经典分泌因子干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-2（IL-2）的表达；明显升高Th2型经典分泌因子白细胞介素-10（IL-10）的表达，从而改善胚胎流产情况^［7］。因此，本研究通过观察泰山磐石散对自然流产模型大鼠蜕膜组织中Th1/Th2型细胞特异性转录因子T-bet/GATA-3表达水平的影响，以期为SA的防治提供可靠的实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级屏障系统中的SD大鼠30只，雌雄各半，体质量240±20 g，均来自上海斯莱克实验动物公司，实验动物许可证号为：SCXK（沪）2018-0004，于福建中医药大学实验动物中心中统一喂养，其室内温度为（25±1）℃，空气湿度为（50±10）%，每12 h明暗循环交换，大鼠可自由摄食和饮水。动物使用许可证编号为SYXK（闽）2020-0002，本研究已获福建中医药大学实验动物伦理委员会审批通过（审批号：FJTCM IACUC 2022171）。

1.2 实验药物

溴隐亭（规格：2.5 mg/片，瑞士诺华制药有限公司，生产批号：T2B350A）。泰山磐石散组方：人参3 g，黄芪3 g，白术1.5 g，炙甘草1.5 g，当归3 g，川芎2 g，白芍药2 g，熟地黄2 g，川续断3 g，糯米3 g，黄芩3 g，砂仁1.5 g（后下）。中药材由福建中医药大学附属第三人民医院中药房提供。

1.3 试剂与仪器

GATA-3抗体（批号：sc-268）、T-bet抗体（批号：sc-21749）均购自美国Sant Cruz公司；二抗（批号：SA00001-1）购自武汉三鹰生物技术有限公司；Western专用一抗二抗稀释液（批号：AR1017）购自中国武汉博士德生物工程有限公司；浓缩型SABCCY3（POD）（小鼠IgG）免疫组化试剂盒（批号：SA1041）购自中国武汉博士德生物工程有限公司；电泳仪（美国Bio-Rad公司）；电泳槽（美国Bio-Rad公司）；包埋机（德国MICROM公司）；半自动石蜡切片机（德国MICROM公司）；倒置显微镜（日本Nikon公司）。

2 方　法

2.1 药液制备

泰山磐石散中除砂仁外，先用1 000 mL的蒸馏水提前浸泡30 min后再用大火煮沸，再改用小火煮25 min，最后加入提前捣碎的砂仁煮5 min。所得药液用干净的双层纱布过滤；再用500 mL蒸馏水将未滤过的药渣大火煮沸，改小火煮30 min后经纱布过滤；将2次所得药液水浴蒸发至28.5 mL，使得终浓度为1 g/mL。

2.2 分组、造模及给药

SD大鼠适应性喂养1周后，提前将雌雄SD大鼠按照1∶1比例合笼，次日早上8点观察雌性大鼠有无脱落的阴栓。发现阴栓者则记录为妊娠第1天，同时记录妊娠大鼠体质量。将妊娠雌鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组和治疗组。空白组于妊娠的第1～11天灌服生理盐水，第6～8天皮下注射生理盐水；模型组于妊娠的第1～11天灌服生理盐水，第6～8天皮下注射0.4 mg/（kg·d）溴隐亭溶液建立SA模型；治疗组于妊娠的第1～11天灌服10 g/（kg·d）泰山磐石散药液，第6～8天皮下注射0.4 mg/（kg·d）溴隐亭溶液。

2.3 取材

于实验结束次日使用1 g/kg乌拉坦腹腔麻醉，待大鼠完全麻醉后进行解剖，观察并记录胚胎发育情况，快速分离孕鼠的子宫蜕膜组织，然后将其置于提前预冷的PBS溶液中清洗，将用于后续石蜡包埋实验的子宫蜕膜组织放入4%多聚甲醛中固定24 h，后期用于HE染色和免疫组化实验。

2.4 观察指标

2.4.1 妊娠大鼠生命状态及体质量增长变化

观察3组妊娠大鼠运动状态、毛发色泽及饮食等一般状况。

体质量增长值（g）＝妊娠第11天体质量－妊娠第1天体质量

2.4.2 妊娠大鼠胚胎发育及吸收情况

观察妊娠大鼠胚胎大小、颜色等一般发育状况。

胚胎吸收率/%＝（胚胎吸收数÷胚胎总数）×100%

2.4.3 大鼠子宫蜕膜组织的病理变化

将蜕膜组织用4%多聚甲醛固定后切片（5 μM），进行脱蜡水化后用苏木素染色反蓝，再用伊红染色并脱水，封片后可在显微镜下固定同一视野观察3组大鼠子宫蜕膜组织中细胞分布排列、血管发育等形态学的改变情况。

2.4.4 免疫组化法检测大鼠子宫蜕膜组织中转录因子T-bet和GATA-3蛋白表达水平

严格按照购买的试剂盒说明书进行操作。主要分为3个模块：第一是固定、脱水；第二进行包埋、切片、制片；第三是染色。最后在显微镜下拍照。使用Image-ProPlus 6.0分析图像的平均光密度（IOD/Area）。

2.4.5 Western blot测定大鼠子宫蜕膜组织转录因子T-bet和GATA-3蛋白表达量

先提取并制备子宫蜕膜组织蛋白样本；然后进行电泳；最后转膜与显色。使用Image Lab进行灰度值分析。

2.5 统计学方法

采用SPSS 26.0统计软件对数据进行分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 3组大鼠一般状态及体质量增长情况

空白组大鼠背毛干净有光泽，活泼好动，饮食正常；模型组大鼠运动少，背毛粗糙无光泽，摄入食物较少；治疗组大鼠相对活跃，体毛顺滑有光泽，饮食适量。3组大鼠体质量增长情况见表1。

3.2 3组胚胎吸收及发育情况

空白组大鼠胚胎发育良好大小均一、饱满、颜色粉红明亮，无胚胎吸收；模型组的胚胎呈深紫色严重淤血，且胚胎大小不等，长势不均，胚胎发育异常；治疗组接近对照组胚胎发育情况。与空白组比较，模型组大鼠胚胎吸收率明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组大鼠胚胎吸收率明显降低（P＜0.05）。见图1和表2。

3.3 3组子宫蜕膜组织的病理变化

空白组大鼠子宫蜕膜组织中细胞分布均匀，排列整齐，细胞核呈蓝紫色的圆形或椭圆形，血管丰富；模型组的子宫蜕膜组织中细胞排列紊乱、分布不均，血管扩张严重；治疗组子宫蜕膜组织形态接近对照组。见图2。

3.4 3组子宫蜕膜组织T-bet和GATA-3蛋白表达水平

见图3和表3。

3.5 3组子宫蜕膜组织中T-bet和GATA-3蛋白表达量

见图4、表4。

4 讨　论

自然流产是一种常见的妊娠并发症^［3］。越来越多的研究表明，免疫因素的调控作用在自然流产中发挥着重要的作用，其参与了胚胎着床、细胞凋亡、炎症反应等多个方面的生物学过程，因此免疫平衡在维持胎儿生存和发育中发挥着重要的作用^［8］。研究表明在自然流产的发生和发展中，Th1/Th2免疫失衡可能是导致胚胎死亡和流产的重要因素之一。因此，Th1/Th2免疫平衡可能是预防和治疗流产的新靶点^［9］。

研究表明，通过纠正Th1/Th2免疫因子失衡，自然流产患者的妊娠结局能得到明显改善^［10］。T-bet作为Th1型免疫细胞的特异性转录因子，不仅能够促进Th1型细胞分化；还能诱导Th1型经典细胞因子IFN-γ的分泌^［11］。Th2型免疫细胞的特异性转录因子GATA-3，促进Th2型免疫细胞发育的同时，还可以诱导Th2型经典细胞因子IL-4的分泌，同时还能一定程度地抑制Th1型细胞的免疫反应^［5］。

泰山磐石散是一种具有调节免疫功能的中药复方，已被证明具有调节免疫功能的作用^［12-13］。本研究结果显示，泰山磐石散可下调自然流产模型大鼠蜕膜组织中T-bet的蛋白表达水平，同时上调GATA-3蛋白表达水平。而且经泰山磐石散治疗后大鼠蜕膜组织的免疫病理损伤明显改善。这可能因为Th2型免疫应答占优势，而Th1型免疫应答减弱。前期研究发现，泰山磐石散可下调自然流产模型大鼠血清中IFN-γ的表达水平，而血清中IL-4的表达水平则明显上升^［6］。综上，泰山磐石散可能是通过影响T-bet/GATA-3信号通路，下调妊娠大鼠子宫蜕膜组织中T-bet的蛋白表达水平，同时上调GATA-3蛋白表达水平，从而抑制Th1型免疫反应促进Th2型免疫反应，从而调控Th1/Th2免疫平衡以改善大鼠妊娠结局。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2023J01824)

福建省自然科学基金项目(2023J01827)

福建省自然科学基金项目(2022J01350)

福建省大学生创新创业训练项目(S2023 10393005)