新橙皮苷治疗溃疡性结肠炎的网络药理学研究及实验验证

摘要

目的 基于网络药理学及动物实验探讨新橙皮苷治疗溃疡性结肠炎（UC）的作用及其机制。 方法 选择TCMSP、TCMIP、Swiss Target Prediction、SymMap、BATMAN-TCM数据库检索新橙皮苷潜在蛋白靶点，在DisGenet及Genecards数据库中检索UC的基因靶点，获取新橙皮苷治疗UC的潜在交集靶点。采用KEGG信号通路和GO功能富集分析筛选新橙皮苷治疗UC的关键信号通路；使用STRING生物信息学数据库构建蛋白相互作用（PPI）网络，筛选获取新橙皮苷治疗UC的核心靶标。采用随机数字表法将30只雄性SPF级C57BL/6小鼠分为对照组、模型组和低、中、高剂量组，每组6只。采用2%的葡聚糖硫酸钠（DSS）构建UC小鼠模型。低、中、高剂量组分别给以0.5、5、50 mL/（kg·d）新橙皮苷溶液灌胃造模的小鼠，对照组和模型组予等量蒸馏水灌胃，持续7 d。采用小鼠疾病活动指数（DAI）及小鼠体质量变化评估小鼠疾病情况；IHC检测网络药理学预测获得的相关核心靶标蛋白表达情况。 结果 网络药理学分析获得2 374个UC疾病靶点、101个新橙皮苷作用靶点和51个新橙皮苷与UC共同靶点。GO富集功能分析显示这些共同靶点涉及50个生物过程、20个细胞组分和42个分子功能。KEGG通路分析筛选获得MAPK信号通路、癌症的发病途径、癌症中的蛋白多糖、内分泌耐药、雌激素信号通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE通路、IL-17信号通路等66条通路。PPI网络拓扑分析获得MAPK14、ALB、ESR1、FN1、CASP3、PTGS2、CAT、IFNG、HRAS、FGF2及AR等核心靶点。动物实验证实新橙皮苷可降低UC小鼠DAI评分，减少UC小鼠体质量的下降，显著下调UC小鼠结肠组织中p38（MAPK14）蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）。 结论 新橙皮苷治疗溃疡性结肠炎的作用机制可能与降低MAPK通路中p38磷酸化水平有关。

Graphical abstract

关键词

溃疡性结肠炎 / 新橙皮苷 / 网络药理学 / MAPK信号通路

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性炎症性肠病，以黏膜和胃肠道生理改变为特征，临床表现为腹痛、便血、腹泻、体质量减轻，但目前其发病机制尚不清楚^［1］。UC的主要病机以湿热瘀血为标，脾肾亏虚为本；清热化湿散瘀、止泻止痢为其治法治则^［2］。中医药治疗UC的历史悠久，临床疗效确切，抗炎效果显著^［3］。清化肠饮是临床治疗UC的常用方，方中厚朴苦燥降泻，辛散温通，入大肠经，是中医学治疗胃肠疾病要药^［4］。新橙皮苷作为厚朴中的活性成分，在最新的研究中被证实具有较强的抗炎、抗氧化、免疫调节等作用，可减轻DSS诱导的UC小鼠结肠黏膜组织病理损伤，但其治疗UC中的作用机制尚未明确^［5-7］。因此，本研究拟采用网络药理学分析和体内实验，初步探讨新橙皮苷治疗溃疡性结肠炎的相关机制，以期阐明新橙皮苷治疗UC的新机制和新靶点，为临床研发治疗UC药物提供新的实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

30只雄性SPF C57BL/6J小鼠，8～10周龄，体质量（21±3）g，购自上海SLAC实验动物科技有限公司，所有动物均饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级实验室，动物使用许可证编号：SYXK（闽）2020-0002。本实验已通过福建中医药大学伦理委员会批准（FJTCM IACUC 2022185）。

1.2 实验药物的配制

新橙皮苷给药剂量按照人与动物体型系数换算，每只小鼠按照0.1 mL/10 g的灌胃剂量配制药物，以蒸馏水配置0.5、5、50 mg/（kg·d）的新橙皮苷混悬液，超声4～5 h至液体充分溶解澄清透明，每日现配现用。

1.3 实验试剂

DSS购自美国MP Biochemicals公司（货号：0216011080-100 g）；新橙皮苷购自北京MedChemExpress有限公司，纯度＞98.48%（货号：HY-N0101）；便隐血（OB）试剂（匹拉米洞法）购自珠海市贝索生物技术有限公司（货号：BA2020B）；4%多聚甲醛固定液、苏木素溶液购自北京索莱宝公司（货号：LA0427、G1140）；免疫组化超敏UltraSensitive^TM SP试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司（货号：KIT-9710）；p-p38一抗购自南京SAB公司（货号：12322）；p38一抗购自美国CST公司（货号：8690）。

1.4 实验仪器

生物组织脱水机和生物组织石蜡包埋机购自湖北孝感亚光有限公司；全自动石蜡切片机和倒置显微镜购自德国Leica公司；荧光正置显微镜购自日本Nikon公司。

2 实验方法

2.1 溃疡性结肠炎疾病靶点的收集

以“ulcerative colitis”为检索词，在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）和DisGenet（http：//www.disgenet.org/）2个数据库中检索UC的相关人类基因靶点，并将2个数据库中的靶点取并集并删除重复项。

2.2 新橙皮苷作用靶点预测

在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）、中医药整合药理学研究平台（TCMIP，http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php）、Swisstargets数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、SymMap（http：//www.symmap.org/）、BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）中检索新橙皮苷潜在蛋白靶点，利用Unitprot数据库（http：//www.Unitprot.org/）将获取的蛋白靶点校准其基因名并删除重复项，与UC的疾病相关靶点取交集获得的新橙皮苷治疗UC的潜在靶点。

2.3 GO和KEGG富集分析

将“2.2”项中预测的新橙皮苷治疗UC的潜在靶点基因名输入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）中，设置物种为“homo sapiens”，进行GO和KEGG富集分析，筛选P＜0.005的结果，从中选取KEGG通路富集排名前20和GO分类富集排名前10的结果，使用R-Studio软件对结果进行可视化，并分别绘制相应气泡图。

2.4 构建靶点相互作用（PPI）网络

将“2.2”中新橙皮苷治疗UC的潜在靶点基因名导入STRING生物信息学数据库（https：//string-db.org/），设置物种为“homo sapiens”，置信度设定＞0.9，获取作用靶点的互作信息。通过Cytoscape 3.7.2软件绘制PPI网络图，并对网络图进行拓扑结构分析，确定新橙皮苷治疗UC的核心靶点。

2.5 小鼠溃疡性结肠炎模型的构建

采用口服2%葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液的方法建立溃疡性结肠炎模型^［8］，让小鼠自由饮用7 d 2% DSS溶液，DSS溶液每天更换1次，第8～10 d恢复正常饮水，第11 d取材，期间正常饮食。

2.6 分组与干预

小鼠适应性喂养7 d后，在开始构建模型前，通过随机数字表法将其分为对照组、模型组和低、中、高剂量组，每组6只。构建模型后，对照组和模型组小鼠使用蒸馏水灌胃，低、中、高组（具体剂量参见“1.2”）使用配置好的不同浓度新橙皮苷溶液灌胃。

2.7 疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分及体质量变化计算

造模期间每日通过盲法评估每只小鼠临床特征：包括粪便性状、体质量改变和便血程度情况，并参考JACKSON等^［9］的评估标准计算DAI评分。同时，每日记录小鼠体质量与给药第1天变化百分比，绘制小鼠体质量变化百分率折线图^［10-11］。

2.8 结肠组织免疫组化检测

给药干预11 d后取材，小鼠结肠组织固定于4%多聚甲醛中；24 h后，进行组织梯度乙醇脱水及二甲苯石蜡透明，将结肠组织包埋于石蜡，切成4 µm切片，用显微镜载玻片承载后60 ℃烘烤5 h，将其脱蜡至水化，以0.25% TritonX-100的PBS溶液破膜10 min。随后，阻断内源性过氧化物酶活性10 min，并用封闭液阻断抗体非特异性结合1 h。将切片与p-p38或p38抗体在4 ℃下孵育过夜，然后与酶标二抗孵育1 h。最后使用二氨基联苯胺（DAB）试剂盒和苏木素对样本进行染色，然后在镜下观察并拍照。

2.9 统计学方法

采用SPSS 26.0统计软件对数据进行分析。计量资料服从正态分布以（\overline{x}±s）表示，多组间体质量变化和免疫组化阳性率比较采用单因素方差分析；不符合正态分布的数据用［M（P₂₅，P₇₅）］表示，多组间DAI评分比较采用秩和检验进行分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 新橙皮苷治疗UC的潜在作用靶点

由GeneCards数据库和DisGenet数据库检索获得2 374个UC疾病作用靶点，TCMSP、Swiss Target Prediction、TCMIP、SymMap、BATMAN-TCM数据库检索合计获取101个新橙皮苷作用靶点。将新橙皮苷潜在蛋白靶点与UC相关疾病靶点相映射，二者交集获得51个新橙皮苷治疗UC的潜在靶点，见图1。

3.2 GO功能富集分析

采用DAVID数据库对新橙皮苷治疗UC的潜在靶点进行GO功能富集分析，获得50个涉及生物过程（biological process，BP），包括对外源性刺激的反应、胶原分解代谢过程、细胞外基质分解、蛋白水解、基因表达的负调控、环氧合酶途径等，见图2；20个细胞组分（cellular component，CC），包括细胞外基质、细胞外间隙、大分子复合物、外泌体、细胞质膜等，见图3；42个分子功能（molecular function，MF），包括内肽酶活性、金属内肽酶活性、丝氨酸内肽酶活性、酶结合、相同蛋白质结合、转录共激活因子结合等。见图4。

3.3 KEGG通路分析

使用DAVID数据库对潜在靶点进行KEGG通路分析，得到66条通路，根据富集的基因数的多少进行排序，整理出排名前20名，绘制气泡图。这些交潜在靶点主要富集的通路包括MAPK信号通路、癌症的发病途径、化学致癌-活性氧、内分泌耐药、雌激素信号通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE通路、IL-17信号通路等。见图5。

3.4 潜在靶点PPI网络的构建与分析

STRING数据库分析新橙皮苷治疗UC的潜在靶点，构建获取50个节点，172条节点连接线的蛋白互作PPI网络。Cytoscape 3.7.2软件绘制PPI网络图，节点平均度值为10.244 897 96，接近中心性平均值为0.515 360 558，介数中心度平均值为0.021 421 335。其中，有19个节点度值＞平均数，包括：丝裂原激活蛋白激酶14（MAPK14；p38）、白蛋白（ALB）、环状素受体1（ESR1）、纤维连接蛋白1（FN1）、胱天蛋白酶3（CASP3）、环氧合酶2（PTGS2）、成纤维细胞生长因子2（FGF2）、干扰素（IFNG）、前列腺素-内过氧化物合酶2（PTGS2）、胱天蛋白酶1（CASP1）等，以上节点为新橙皮苷治疗UC的核心靶点。见图6。

3.5 不同剂量新橙皮苷对UC小鼠体质量的影响

为进一步验证网络药理学的分析结果，本实验采用不同剂量新橙皮苷干预UC模型小鼠，初步分析新橙皮苷的药效和作用机制。结果表明，与对照组相比，模型组在服用DSS后体质量出现显著下降（P＜0.05）；然而与模型组相比，低、中、高剂量干预后，体质量都出现显著升高（P＜0.05）。见图7。

3.6 不同剂量新橙皮苷对UC小鼠DAI评分的影响

5组小鼠的DAI评分显示，在第11天时，对照组的小鼠DAI评分为0；与对照组相比，模型组在服用DSS后DAI评分显著上升（P＜0.05）；与模型组相比，低、中、高剂量新橙皮苷干预都能显著降低DAI评分（P＜0.05）。见图8。

3.7 不同剂量新橙皮苷对UC小鼠结肠组织中p-p38、p38蛋白的影响

KEGG富集到的关键通路MAPK通路中重要组成部分p38（MAPK14）同样在的PPI蛋白互作网络中富集到，结合图5和图6的分析结果，对排分靠前的MAPK通路关键蛋白p-p38和p38进行验证分析。结果显示：与对照组比较，模型组小鼠的结肠组织蛋白中p-p38蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05），p38蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，低、中、高剂量组小鼠结肠组织蛋白p-p38蛋白的表达水平均显著降低（P＜0.05），p38蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图9—12。

4 讨　论

先前的研究发现，新橙皮苷可通过降低结肠组织中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平来发挥其对UC的保护作用^［5］。本研究通过TCMSP、Swiss Target Prediction、TCMIP、SymMap、BATMAN-TCM数据库进行新橙皮苷靶点的挖掘，并通过DisGenet和GeneCards数据库进行UC靶点的挖掘，筛选并确定新橙皮苷可能作用于UC的潜在靶点51个。通过KEGG通路分析，富集到MAPK信号通路、IL-17信号通路、化学致癌-活性氧通路等信号通路。MAPK信号通路的激活主要涉及JNK、ERK和p38的磷酸化，进一步激活细胞核中的转录信号从而在细胞增殖与分化、凋亡、调节炎症等生理和病理过程中发挥重要作用^［12］。林雄^［13］发现MAPK通路的激活可以促进NF-κB p65的磷酸化，上调炎症细胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平，通过苍术醇提物抑制MAPK通路的激活可改善UC症状。IL-17是一种促炎因子，在多种细胞中都有表达，通过促进TNF-α、IL-6等炎性因子的释放，发挥扩大炎症等功能^［14］。马杰等^［15］研究结果表明，黄芩多糖可通过抑制IL-17的表达发挥对UC的治疗作用。活性氧（reactive oxygen species，ROS）的过量累积导致细胞膜通透性增加，促进炎症反应^［16］。研究发现在UC肠道黏膜中会过量生成ROS，促进组织损伤^［17］。这些研究进一步佐证了新橙皮苷可能通过调控MAPK信号通路、IL-17信号通路、活性氧相关通路来发挥其对溃疡性结肠炎的保护作用。

本研究通过构建新橙皮苷治疗UC的潜在作用靶点PPI网络图，发现MAPK14（p38）、CASP1、PTGS2等靶点可能参与新橙皮苷治疗UC的作用机制。陈赛等^［18］研究证实白芍七物颗粒干预UC小鼠，能降低p38的磷酸化水平，通过阻断NOXs-ROS-p38信号通路的传导，缓解UC小鼠结肠组织的炎症反应；EPSTEIN等^［19］研究证实，姜黄素可通过阻断p38 MAPK信号通路，减轻结肠黏膜组织的白细胞浸润，有效治疗DSS诱导的UC小鼠的结肠炎性病变。Caspase-1是介导细胞焦亡所依赖的核心蛋白，它的激活是细胞焦亡经典途径的核心，属于免疫系统的重要组成部分^［20］。研究表明，人炎性肠组织中Caspase-1活化水平比正常肠组织中活化水平更高^［21］。PTGS2在调控免疫应答发挥重要作用，主要表达在单核细胞和肠上皮细胞中，在UC发展过程中对结肠黏膜愈合有促进作用^［22］。这些研究提示新橙皮苷可能通过MAPK14（p38）、CASP1、PTGS2等关键靶点的表达水平，调控相关免疫应答，治疗DSS诱导的UC小鼠的结肠炎性病变。

UC的主要临床表现是腹痛、腹泻、黏液脓血便等，DSS为经典的UC造模方法，利用DAI评分能反映该模型中UC体质量下降、腹泻、黏液脓血便情况。本研究体内实验中DSS造模后的UC小鼠出现了明显的DAI评分升高和体质量下降，而新橙皮苷可显著降低DSS诱导的UC小鼠体质量下降和DAI评分升高，结果表明新橙皮苷可缓解DSS诱导的UC小鼠的UC体质量下降、腹泻、黏液脓血便症状。再以该模型验证网络药理学分析富集出的MAPK14（p38）关键靶点，通过体内实验的验证，可得出以下结果：在DSS诱导的UC小鼠模型中，新橙皮苷干预能够显著逆转模型组小鼠结肠组织中p38蛋白磷酸化水平的升高，提示新橙皮苷对UC的治疗作用可能是通过发挥对p38 MPAK通路的抑制而实现。

综上，本研究通过网络药理学对新橙皮苷治疗UC的相关分子机制进行探讨。采用体内实验对新橙皮苷调控p38 MPAK信号通路，进而起到抑制UC的发生、发展进行验证，为临床中研发防治UC的药物提供了有效的依据。不足之处在于，研究中仅对p38 MPAK信号通路进行了探索验证，并未对该通路上下游相关通路蛋白进一步分析，计划在下一步的实验中进行探究。

参考文献

[1] 邱小京，郭修田. 溃疡性结肠炎的中西医认识及诊治［J］. 上海中医药大学学报，2023，37（2）：68-75.

[2] 王琳，卿香丽，张涛，等. 魏玮教授基于“湿热致病”论治溃疡性结肠炎［J］. 世界中西医结合杂志，2023，18（9）：1737-1740，1775.

[3] 郭廷洪，刘凤斌，张桂林，等. 当代名中医治疗溃疡性结肠炎多维度诊治思路与临证经验荟萃［J］. 西部中医药，2023，36（11）：113-116.

[4] 韩金荣. 溃疡性结肠炎经验总结［J］. 智慧健康，2021，7（26）：168-170.

[5] 刘紫瑄，李玲玲，黄叶飞. 新橙皮苷对葡聚糖硫酸钠致小鼠溃疡性结肠炎的保护作用及其机制［J］. 现代预防医学，2022，49（24）：4505-4512.

[6] WANG X H， DAI C， WANG J，et al. Therapeutic effect of neohesperidin on TNF-α-stimulated human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes ［J］. Chin J Nat Med，2021，19（10）：741-749.

[7] OSMAN A T， SHARKAWI S M Z， HASSAN M I A，et al. Empagliflozin and neohesperidin protect against methotrexate-induced renal toxicity via suppression of oxidative stress and inflammation in male rats ［J］. Food Chem Toxicol，2021，155：112406.

[8] WIRTZ S， POPP V， KINDERMANN M，et al. Chemically induced mouse models of acute and chronic intestinal inflammation ［J］. Nat Protoc，2017，12（7）：1295-1309.

[9] JACKSON L N， ZHOU Y N， QIU S M，et al. Alternative medicine products as a novel treatment strategy for inflammatory bowel disease ［J］. Am J Chin Med，2008，36（5）：953-965.

[10] NUNES N S， CHANDRAN P， SUNDBY M，et al. Therapeutic ultrasound attenuates DSS-induced colitis through the cholinergic anti-inflammatory pathway ［J］. E Bio Medicine，2019，45：495-510.

[11] JOZAWA H， INOUE-YAMAUCHI A， ARIMURA S，et al. Loss of C/EBPδ enhances apoptosis of intestinal epithelial cells and exacerbates experimental colitis in mice ［J］. Genes Cells，2019，24（9）：619-626.

[12] 李姿慧，王键，蔡荣林，等. 参苓白术散对脾虚湿困型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织ERK、p38 MAPK蛋白表达的影响［J］. 云南中医学院学报，2013，36（6）：7-10.

[13] 林雄. 基于MAPK/NF-κB信号通路研究苍术对小鼠溃疡性结肠炎的药效及机制［D］. 武汉：湖北中医药大学，2021：23-27.

[14] NOVIELLO D， MAGER R， RODA G，et al. The IL23-IL17 immune axis in the treatment of ulcerative colitis：successes，defeats，and ongoing challenges ［J］. Front Immunol，2021，12：611256.

[15] 马杰，陈韵之，田蕾. 黄芩多糖通过调节JAK2/STAT3通路和IL-23/IL-17炎性轴改善DSS诱导的UC模型小鼠的炎症［J］. 中山大学学报（医学科学版），2023，44（3）：423-429.

[16] ZHU H， LI Y R. Oxidative stress and redox signaling mechanisms of inflammatory bowel disease：updated experimental and clinical evidence ［J］. Exp Biol Med （Maywood），2012，237（5）：474-480.

[17] 李玉欣，赵鲁卿，张声生，等. 清热化湿祛瘀方对溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜氧化应激和细胞凋亡的影响［J］. 中华中医药杂志，2021，36（3）：1727-1730.

[18] 陈赛，何永恒，吴强，等. 从NOXs-ROS-P38MAPK信号通路探讨白芍七物颗粒治疗UC大鼠的作用机制［J］. 时珍国医国药，2017，28（12）：2826-2828.

[19] EPSTEIN J， DOCENA G， MACDONALD T T，et al. Curcumin suppresses p38 mitogen-activated protein kinase activation，reduces IL-1beta and matrix metalloproteinase-3 and enhances IL-10 in the mucosa of children and adults with inflammatory bowel disease ［J］. Br J Nutr，2010，103（6）：824-832.

[20] KAYAGAKI N， WARMING S， LAMKANFI M，et al. Non-canonical inflammasome activation targets caspase-11 ［J］. Nature，2011，479（7371）：117-121.

[21] 唐立，陆岩，欧阳满照. 细胞焦亡与溃疡性结肠炎研究的最新进展［J］. 广东医学，2021，42（11）：1393-1399.

[22] WU Y， LIU X Q， LI G W. Integrated bioinformatics and network pharmacology to identify the therapeutic target and molecular mechanisms of Huangqin Decoction on ulcerative colitis ［J］. Sci Rep，2022，12（1）：159.

基金资助

国家自然科学基金项目(82274188)

国家自然科学基金项目(81603413)

国家自然科学基金项目(81803882)

福建省自然科学基金项目(2020J06026)

福建省自然科学基金项目(2022J011002)

福建中医药大学校管青年科研人才拔尖项目(XQB202202)