易黄汤对脾虚湿热型宫颈癌小鼠皮下移植瘤cGAS/STING/IRF-3信号通路及相关免疫因子的影响

Effect of Yihuang Decoction on cGAS/STING/IRF-3 Signaling Pathway and Related Immune Factors in Subcutaneous Transplanted Tumor of Cervical Cancer Mice with Spleen Deficiency and Damp-Heat Syndrome

摘要

目的 探讨易黄汤对脾虚湿热型宫颈癌小鼠皮下移植瘤环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶（cGAS）/干扰素刺激基因（STING）/干扰素调节因子-3（IRF-3）信号通路及相关免疫因子的影响。 方法 选取6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠50只，随机分为造模组40只和空白组10只。空白组正常喂养，造模组通过湿热环境及高脂高糖饮食建立脾虚湿热型小鼠模型，当小鼠出现嗜卧懒动、易激惹、形体消瘦、进食及饮水量减少、毛发疏松粗糙、粪便时干时溏、肛温稍有增加则认为造模成功。将2×10⁶个/mL对数生长期HPV16阳性人宫颈癌CaSki细胞悬液0.2 mL接种于上述50只小鼠右腋下，5～7 d后可触及直径≥5 mm结节时即认为皮下移植瘤造模成功。将造模组按随机数字表法分为模型组和易黄汤低剂量、中剂量、高剂量组，每组10只。低、中、高剂量组均按体质量40.0 mL/kg分别予含生药浓度0.25、0.50、1.00 g/mL易黄汤药液灌胃，模型组和空白组予同等剂量生理盐水灌胃，均隔日1次，干预4周。干预后计算5组小鼠胸腺、脾脏指数和瘤质量、抑瘤率；ELISA法检测5组小鼠血清白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平；支链DNA信号扩增法检测5组小鼠皮下移植瘤组织HPV E6 mRNA转录水平；Western blot测定5组小鼠移植瘤组织中cGAS、STING、IRF-3蛋白表达量。 结果 与空白组比较，模型组胸腺和脾脏指数、IL-6、TNF-α水平显著下降（P＜0.05），HPV E6 mRNA转录水平显著增加（P＜0.05）；易黄汤不同剂量组中以高剂量组的抑瘤率最高为（35.42±4.86）%（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组胸腺和脾脏指数、IL-6、TNF-α水平及cGAS、STING和IRF-3蛋白表达量显著增加（P＜0.05），皮下移植瘤质量及HPV E6 mRNA转录水平显著降低（P＜0.05），且降低程度与易黄汤剂量成正比。 结论 脾虚湿热能促进CaSki细胞生长、HPV表达增加，易黄汤可能通过激活cGAS/STING/IRF-3信号通路增强免疫功能，从而抑制HPV表达及宫颈癌小鼠移植瘤生长。

Abstract

Objective To investigate the effect of Yihuang Decoction on cGAS/STING/IRF-3 signal pathway and related immune factors in cervical cancer mice with spleen deficiency and damp-heat syndrome. Methods A total of 50 SPF female BALB/c mice aged 6-8 weeks were selected and randomly divided into spleen deficiency and damp-heat syndrome model group (SDDH group, n=40) and blank group (n=10). The mouse model of spleen deficiency and damp-heat syndrome was established by hot and humid environment and high-fat and high-sugar diet in the SDDH group. The mice showed lethargy, irritability, weight loss, reduced amount of food and drinking, loose and rough hair, and feces were sometimes dry and sometimes loose with a slight increase in anal temperature, which meant the modeling was considered successful, while the blank group was fed normally. 0.2 mL of 2×10⁶/mL logarithmic growth phase HPV16-positive human cervical cancer CaSki cell suspension was inoculated into the right axilla of 50 mice. The subcutaneous transplanted tumor model was successful when nodules with a diameter of 5 mm or greater could be palpated after 5-7 days. According to the random number table method, the SDDH group was randomly divided into a model group and low, medium, and high-dose groups of Yihuang Decoction, with 10 mice in each group. The Yihuang decoction was given to three different dose groups through intragastric administration with concentrations of crude drug of 0.25, 0.50, and 1.00 g/mL based on body mass, at a rate of 40.0 mL/kg. The model and blank groups were given the same dose of saline solution. The time of intervention was once every other day for 4 weeks. After the intervention, the researchers calculated the indexes of the thymus and spleen, tumor mass and tumor inhibition rate. They also detected the level of serum interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) using the ELISA method. The HPV E6 mRNA transcription level of subcutaneously transplanted tumor tissue in the five groups was detected by branched chain DNA signal amplification. Additionally, the expression of cGAS, STING, and IRF-3 protein in transplanted tumor tissue of the five groups was determined by Western blot. Results The model group showed a significant decrease in thymus and spleen index, as well as level of IL-6 and TNF-α compared to the blank group. The transcription level of HPV E6 mRNA was found to be significantly increased in the model group, while the highest tumor inhibition rate was observed in the high dose group at (35.42±4.86%) (P<0.05);Compared with the model group, the low, middle, and high dose groups showed a significant increase in thymus and spleen index, level of IL-6, TNF-α, and the protein expression of cGAS, STING, and IRF-3. Additionally, the tumor mass and HPV E6 mRNA transcription level significantly decreased in the low, middle, and high dose groups, which was found to be proportional to the dose of Yihuang Decoction. (P<0.05). Conclusion Spleen deficiency and dampness-heat can promote the growth of CaSki cells and increase the expression of HPV. Yihuang Decoction may enhance immune function by activating cGAS/STING/IRF-3 signaling pathway，thus inhibiting the expression of HPV and the growth of cervical cancer in mice.

Graphical abstract

关键词

宫颈癌 / 易黄汤 / 移植瘤 / cGAS/STING/IRF-3信号通路 / 免疫因子

Key words

cervical cancer / Yihuang Decoction / transplanted tumor / cGAS/STING/IRF-3 signaling pathway / immune factor

宫颈癌是全球女性第四大常见的癌症，据统计每年新发病例超过50万，而我国是宫颈癌第一大国，年新增病例约14万，死亡病例达3万^［1-2］。大量研究证实高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）与宫颈癌的发生密切相关^［3］，HR-HPV的持续感染是诱发宫颈上皮内瘤变（CIN）及浸润性宫颈癌的重要因素^［4］。因此对于HR-HPV持续感染者，如果能及早干预和治疗，可以降低宫颈癌发病率，但目前国内外对于HR-HPV持续感染的治疗尚处于探索阶段。本团队前期临床研究证实，易黄汤能显著改善宫颈病变脾虚湿热证患者症状，有效降低HR-HPV DNA载量^［5］，推测其可能是通过改变阴道局部免疫因子表达发挥作用^［6］，但具体机制尚不明确。环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶（cGAS）是公认的模式识别受体和直接细胞质dsDNA传感器，当外源性病毒、细菌及自身损伤的细胞DNA与之结合时，cGAS/干扰素基因刺激因子（STING）/干扰素调节因子-3（IRF-3）信号传导通路被激活，诱导相应细胞因子表达，触发免疫反应，因此cGAS/STING/IRF-3信号通路被认为是慢性炎症甚至癌症的潜在治疗靶点^［7］。本研究旨在探索易黄汤对宫颈癌小鼠皮下移植瘤生长、cGAS/STING/IRF-3信号通路及相关免疫因子的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物及细胞株

6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠50只，体质量18～20 g，由中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007。本动物研究均遵循当地动物保护法的指南和建议。HPV16阳性人宫颈癌CaSki细胞株（批号：YS2416C）购自中国科学院细胞库。

1.2 试剂

cGAS一抗（批号：HY-P71597）、STING一抗（批号：HY-B0621S1）、IRF-3一抗（批号：HY-P1778A）均购自美国MCE公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：#31460）；细胞培养液（常州贝源鑫生物科技有限公司，批号：11875119）；胎牛血清（上海联硕宝为生物科技有限公司，批号：30044333）；0.25%胰蛋白酶（美国HyClone公司，批号：25300054）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的ELISA试剂盒（批号：CB10851-Mu）、白细胞介素-6（IL-6）ELISA试剂盒（批号：CB10187-Mu）均购自科艾博生物（上海）有限公司；人乳头瘤病毒（HPV）E6/E7 mRNA检测试剂盒（郑州科蒂亚生物技术有限公司，批号：221212）。

1.3 仪器

酶标分析仪（南京德铁实验设备有限公司，型号：HBS-1096C）；电子天平（德国赛多利斯集团，型号：Secura^®）；CO₂恒温培养箱（北京兰博康斯科技有限公司，型号：D180）。

1.4 易黄汤制备

易黄汤组成为山药30 g、芡实30 g、黄柏9 g、车前子12 g、白果9 g，由福建中医药大学附属第二人民医院中药房提供，共计90 g。以上中药常规水煎3次，30 min/次，混合3次煎液，以2 000 r/min离心，去除沉淀，重复离心2次。离心得到1 g/mL易黄汤药液，使用生理盐水进一步稀释为含生药浓度0.25、0.50、1.00 g/mL的易黄汤药液，再经过微孔滤膜除杂、除菌，置于4 ℃冰箱保存备用。

2 实验方法

2.1 宫颈癌小鼠皮下移植瘤的造模及分组

选取6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠50只，随机分为造模组40只和空白组10只，造模组按照文献［8-9］进行造模：将小鼠每天置于相对湿度（95±5）%、室温（32±2）℃的湿热环境中8 h，每日予200 g/L蜂蜜水自由饮用，并隔日交替灌服油脂（按体质量10 g/kg）和白酒（10 mL/kg），当小鼠出现嗜卧懒动、易激惹、形体消瘦、进食及饮水量减少、毛发疏松粗糙、粪便时干时溏、肛温稍有增加则认为脾虚湿热证模型构建成功。空白组正常喂养：将小鼠置于相对湿度50%～70%，室温为（24±2）℃环境中，采用12 h昼夜间断照明，水料自由饮用。

CaSki细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液于37 ℃、5%CO₂下培养，培养至对数生长期时用0.25%胰蛋白酶消化，细胞进行重悬、计数，并调整密度为2×10⁶个/mL，将0.2 mL细胞悬液接种于2组小鼠的右腋下，5～7 d后可触及直径≥5 mm结节时即为皮下移植瘤造模成功。

将造模组按随机数字表法分为模型组和易黄汤低剂量、中剂量、高剂量组，每组10只。低、中、高剂量组均按体质量40.0 mL/kg分别予含生药浓度0.25、0.50、1.00 g/mL易黄汤药液灌胃，模型组和空白组予同等剂量生理盐水灌胃，均隔日1次，干预4周。

2.2 计算小鼠胸腺、脾脏指数及抑瘤率

除空白组外的其余4组小鼠末次给药24 h后称体质量；随后通过摘除眼球采血，不加抗凝剂的全血于4 ℃冰箱贮存3 h，2 000 r/min离心15 min，取血清用于ELISA检测；脱颈处死小鼠，摘取脾脏、胸腺，称重，按公式计算脾脏、胸腺指数，取移植瘤组织称质量，分别计算抑瘤率。

胸腺（脾脏）指数＝胸腺（脾脏）质量/体质量

抑瘤率＝（模型组平均瘤质量－易黄汤组平均瘤质量）/模型组平均瘤质量×100%

2.3 ELISA法检测5组小鼠血清IL-6、TNF-α水平

取“2.2”项下提取的血清样本，按照试剂盒操作步骤检测血清中IL-6、TNF-α水平。

2.4 支链DNA信号扩增法检测小鼠皮下移植瘤组织人乳头瘤病毒E6（HPV E6）mRNA转录水平

取5组小鼠皮下移植瘤组织，置入裂解液中，按HPVE 6/E7 mRNA检测试剂盒说明书进行操作，加样，洗板，加入探针标记物、加入底物工作液，产生的化学光由冷光仪进行读数，并计算结果。

2.5 Western blot检测5组小鼠皮下移植瘤组织cGAS、STING和IRF-3蛋白表达量

取5组小鼠皮下移植瘤组织，用细胞裂解法提取总蛋白，并使用BCA法测定蛋白浓度；使用10%SDS-PAGE进行蛋白质电泳并转移到PVDF膜上，置入含有5%脱脂奶粉的TBST封闭液中，加入cGAS、STING和IRF-3一抗，4 ℃下孵育过夜，洗膜，加入二抗，37 ℃孵育1 h；滴加ECL化学发光液，使用凝胶成像分析系统成像，并采用ImageJ图像处理软件分析，以GAPDH作为内参对照，计算目的蛋白相对表达水平。

2.6 统计学方法

实验数据采用SPSS 27.0软件分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 5组小鼠瘤质量、抑瘤率比较

与模型组比较，易黄汤组小鼠皮下移植瘤质量均显著降低（P＜0.05），且随着易黄汤浓度增加移植瘤的质量逐渐下降（P＜0.05）；易黄汤不同剂量组中以高剂量组的抑瘤率最高（P＜0.05）。见表1。

3.2 5组小鼠胸腺、脾脏指数比较

与空白组比较，模型组小鼠胸腺、脾脏指数均显著下降（P＜0.05）；与模型组比较，易黄汤低、中、高剂量组小鼠胸腺、脾脏指数均显著增加（P＜0.05），且随着易黄汤浓度增加，小鼠胸腺、脾脏指数逐渐上升（P＜0.05）。见表2。

3.3 5组小鼠血清IL-6、TNF-α水平比较

与空白组比较，模型组小鼠血清中IL-6、TNF-α水平均显著下降（P＜0.05）；与模型组比较，易黄汤组小鼠血清中IL-6、TNF-α水平均显著增加（P＜0.05），且随着易黄汤浓度增加，小鼠血清中IL-6、TNF-α水平逐渐增加（P＜0.05）。见表3。

3.4 5组小鼠皮下移植瘤组织HPV E6 mRNA转录水平比较

与空白组比较，模型组小鼠移植瘤HPV E6 mRNA转录水平显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，易黄汤组小鼠移植瘤组织HPV E6 mRNA转录水平显著下降（P＜0.05），且随着易黄汤浓度增加，瘤组织HPV E6 mRNA转录水平逐渐下降（P＜0.05）。见表4。

3.5 5组小鼠皮下移植瘤组织cGAS、STING和IRF-3蛋白表达量比较

与空白组比较，模型组小鼠移植瘤组织cGAS、STING、IRF-3蛋白表达量均显著下降（P＜0.05）；与模型组比较，易黄汤组小鼠移植瘤组织cGAS、STING、IRF-3蛋白表达量均显著增加（P＜0.05），且随着易黄汤浓度增加，上述指标蛋白表达量也逐渐上升（P＜0.05）。见图1、表5。

4 讨　论

宫颈癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一，HR-HPV持续感染与宫颈癌密切相关，故控制HR-HPV感染可降低宫颈癌的发生^［10］，但目前国内外尚未研制出针对HR-HPV感染的有效治疗手段。有研究表明女性生殖道HPV持续感染与宿主自身免疫关系密切^［11］，大量临床研究发现随着HR-HPV持续感染、宫颈病变逐渐加重，全身或宫颈局部免疫因子表达会发生改变^［12-13］，因此目前针对HR-HPV持续感染治疗主要是增强免疫功能。近年来有学者认为中药对肿瘤的抑制作用主要是通过调节机体免疫功能来实现的^［14-15］，故本研究从该方向出发探讨易黄汤对脾虚湿热证宫颈癌小鼠皮下移植瘤的进一步作用机制。

白带异常、阴道分泌物增多及外阴瘙痒是宫颈HPV感染的主要症状^［16-17］，这与中医学“带下病”症状类似，发病多由不洁性交、外感湿毒及脏腑气血功能失常，湿热内袭阴器、胞宫，使任脉失固、带脉失约所致。湿性黏滞，其性重浊，湿邪为病多缠绵难愈、病程较长或反复发作。根据其发病特点，本研究团队从“伏邪理论”的角度认为HR-HPV持续感染主要病因为湿邪浊气潜伏于子门，脾肾亏虚致正气不足以驱邪外出，进而导致湿热积伏于胞宫^［18］。研究表明脾虚湿热证患者中免疫因子的改变是引起HR-HPV持续感染的原因^［19］。目前临床上检测HPV的方法很多，越来越多学者认为HPV E6 mRNA转录水平能更准确反映HPV感染程度。E6是HPV病毒癌基因，HPV E6 mRNA转录水平表达越高代表病毒基因在细胞内的活跃程度越高。本研究显示模型组较空白组HPV E6 mRNA转录水平升高，且胸腺指数、脾脏指数、IL-6和TNF-α水平显著下降，说明脾虚湿热会降低机体免疫功能，促进HPV病毒复制。

易黄汤出自《傅青主女科》，是治疗带下病的经典方剂，由山药、芡实、黄柏、车前子、白果组成，具有健脾清热利湿、固肾止带的功效。方中重用山药、芡实，健脾化湿、固涩止带为君；黄柏清热利湿，泻肾中之火为臣；车前子清热利湿为佐；白果收涩止带，引诸药入任脉，全方共奏扶正祛邪之效。现代药理研究发现，山药具有抗肿瘤、免疫调节和增强白细胞吞噬作用^［20］；芡实有抗癌、抗氧化功效，可以调节人体免疫功能，提升自身抵抗力^［21］；车前子能抗炎抑菌、抗氧化^［22］；白果抑制多种致病菌和真菌、抗病毒^［23］；黄柏具有抗病毒、抗癌、抗炎及免疫抑制作用，可降低血清IL-1、IL-2、TNF-α的产生和分泌，减轻炎症损伤。我们前期采用易黄汤治疗HR-HPV阳性脾虚湿热带下病患者，发现易黄汤能明显缩短宫颈HR-HPV感染患者的临床自愈时限，有效降低HR-HPV病毒载量，并在改善患者临床症状方面优于干扰素^［5］，同时易黄汤可降低患者阴道局部IL-6、IL-17水平，提高IL-2水平^［6］，但具体作用机制不明。根据易黄汤扶正祛邪作用，结合我们的前期研究，初步推测易黄汤作用机制与免疫调控有关。

cGAS属于cGAS/DncV核苷酸转移酶超家族成员^［24］，是一种先天免疫传感器，当外源性病毒、细菌及损伤的DNA进入细胞质时，cGAS通过自身锌指结构特异性识别并结合这些DNA，cGAS被活化并催化合成第二信使cGAMP，改变STING的结构，与下游IRF-3结合，最终激活的IRF-3进入细胞核，并作为转录因子诱导生成I型干扰素和炎症细胞因子，如IL-6、TNF-α，参与宫颈病变患者HPV感染的发生^［25］。刘洁等^［26］发现HR-HPV感染宫颈病变患者外周静脉血cGAS、STING mRNA水平明显高于无HPV感染的宫颈病变患者，提示HR-HPV感染可能与cGAS-STING信号通路存在关联；杜华珊^［27］研究显示STING可抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭，提示STING通路可能是治疗宫颈癌的新靶点。本研究发现易黄汤可浓度依赖性地提高宫颈癌小鼠皮下移植瘤组织中cGAS、STING、IRF-3蛋白表达量，增加小鼠胸腺和脾脏指数，促进小鼠外周血清中IL-6、TNF-α水平，抑制皮下移植瘤中HPV E6 mRNA转录水平的表达，提示易黄汤可能是通过激活cGAS/STING/IRF-3信号通路，促进其下游炎症因子IL-6、TNF-α水平，从而抑制HPV E6 mRNA转录水平的表达及CaSki细胞生长。

综上所述，HR-HPV持续感染的发生与脾虚湿热关系密切，易黄汤可能是通过激活cGAS/STING/IRF-3信号通路，促进下游炎症因子表达，增强小鼠免疫功能，从而抑制脾虚湿热证宫颈癌小鼠皮下移植瘤HPV表达及肿瘤生长，但易黄汤是否还通过其他信号通路或细胞因子发挥作用，还需做进一步研究。

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基金资助

福建省自然科学基金面上项目(2022J01344)

国家中医药管理局第五批全国中医临床优秀人才研修项目(国中医药人教函〔2022〕1号)