加减补阳还五汤治疗阻塞性睡眠呼吸暂停综合征脑损伤的网络药理学研究

摘要

目的 采用网络药理学预测加减补阳还五汤治疗阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）脑损伤可能的作用机制。 方法 在TCMSP、STITCH和Target数据库查找并筛选加减补阳还五汤活性成分和药物作用靶点；利用Cytoscape 3.8.1软件绘制加减补阳还五汤的“中药-活性成分-靶点”网络图；通过GeneCards和OMIM数据库获取OSAS脑损伤的疾病靶点；利用Venny 2.1.0在线工具获得加减补阳还五汤与OSAS脑损伤的交集靶点，将交集靶点导入String数据库进行分析，并利用Cytoscape软件绘制交集靶点的蛋白互作网络（PPI）图，根据中介中心性（BC）、接近中心性（CC）和节点中心性（DC）筛选出加减补阳还五汤治疗OSAS脑损伤核心靶点；应用DAVID数据库对交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，并进行可视化作图。 结果 共获得加减补阳还五汤活性成分133个及其对应的药物作用靶点331个，并绘制出加减补阳还五汤的“中药-活性成分-靶点”网络图；通过GeneCards和OMIM数据库检索到OSAS脑损伤疾病靶点3 784个，获取加减补阳还五汤与OSAS脑损伤交集靶点160个，筛选出核心靶点为Akt1、ALB、MAPK3、VEGFA、CASP3、FOS、CTNNB1、TP53、CREB1、EGFR、ESR1；GO生物功能和KEGG通路富集分析结果显示：加减补阳还五汤主要通过调控癌症通路、配体-受体相互作用、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、钙离子信使通路等信号通路，参与尼古丁的反应、雌二醇的反应、兴奋性突触后电位、突触后膜、前膜的整体成分、脂筏、神经元投射、谷氨酸受体活动、类固醇结合、细胞外配体门控性钙通道活动等生物过程起到治疗OSAS脑损伤的作用。 结论 加减补阳还五汤治疗OSAS脑损伤具有多成分、多靶点的特点，推测核心靶点可能通过参与调控雌二醇的反应、调控神经传递、类固醇结合、细胞缺氧反应等生物过程，影响细胞增殖、分化、凋亡及炎症反应，促进神经干细胞的增殖修复，起保护神经组织作用，减轻脑损伤以延缓疾病的发生、发展，进而达到治疗OSAS脑损伤的目的，其作用机制可能与癌症、脂质与动脉粥样硬化、钙离子信使、cAMP、性激素等信号通路有关。

Graphical abstract

关键词

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征 / 加减补阳还五汤 / 网络药理学 / 信号通路

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAS）以睡眠过程中上气道气流显著减少或完全停止的情况反复出现为主要特征，随着病程进展，逐渐出现长期慢性低氧血症、睡眠结构紊乱、高碳酸血症等病理、生理过程。OSAS病程中反复、长期出现的呼吸暂停增加心脑血管疾病的发病率和病死率^［1-2］。由于长期影响睡眠，可引发患者乏力、困倦、认知损害等，严重危害了患者的生活质量。中华医学会呼吸病学分会推荐OSAS治疗以气道内正压通气治疗^［3］、口腔矫正器及外科治疗为主，可部分改善患者认知功能障碍，但由于耐受性差、手术治疗风险、费用昂贵、高复发率等问题，严重影响了OSAS患者对以上治疗的依从性及临床疗效，因此寻找新的治疗方法成为临床医务工作者的当务之急。加减补阳还五汤为福建中医药大学附属人民医院治疗OSAS的临床经验方，在经方补阳还五汤的基础上加胆南星、党参、法半夏、茯苓、石菖蒲、甘草化裁而成，本课题组前期临床研究表明该方不仅可以缓解患者的临床症状，还可以改善睡眠呼吸紊乱，提高患者的认知水平^［4］，但其药物作用机制尚不明确，故本研究采用网络药理学方法探讨加减补阳还五汤治疗OSAS脑损伤的分子作用机制。

1 资料与方法

1.1 加减补阳还五汤活性成分及药物作用靶点收集与筛选

以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及类药性（drug likeness，DL）≥0.18作为筛选条件^［5］，在中药系统药理学数据库与分析平台 （https：//tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）筛选加减补阳还五汤中黄芪、党参、当归、川芎、赤芍、桃仁、红花、枳实、茯苓、橘红、石菖蒲、甘草的活性成分及对应的药物作用靶点，药方中的竹茹、法半夏、胆南星、地龙通过中国科学院上海有机化学研究所化学数据库（http：//www.organchem.csdb.cn）、文献检索获取活性成分^［6］，并通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获得化合物的化学结构式^［7］，然后导入SwissADME平台（http：//www.swissadme.ch）^［8］进行口服生物利用度筛选。先设定肠胃吸收（gatrointestinal absortion；GIabsortion）为“High”作为药物可以被吸收的条件，用于筛选具有较好口服生物利用度的活性化合物；其次，4种类药性预测指标包括分子量＞500、log P（Clog P）＞5或Mlog P＞4.15、氢键给体数目（OH与NH数目之和）＞5、氢键受体数目（O与N数目之和＞10中，只要满足2个及2个以上的化合物即可作为活性化成分；将筛出的活性成分后导入STITCH和Target数据库中获取药物作用靶点。

1.2 “中药-活性成分-靶点”网络构建与加减补阳还五汤主要活性成分的筛选

将加减补阳还五汤活性成分信息及其对应的药物作用靶点导入网络图像化软件Cytoscape 3.8.2，构建“中药-活性成分-靶点”网络，分析其网络特征^［9］，其中“节点”（node）表示分子与靶蛋白，“边”（edge）表示中药活性成分与靶点之间的关系。将节点中心性（degree centrality，DC）按照从大到小进行排序，选择排名前9的活性成分作为加减补阳还五汤的主要活性成分。

1.3 加减补阳还五汤治疗OSAS脑损伤作用靶点获取

以“brain damage of Sleep Apnea Syndromes”为检索词，在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM数据库（https：//omim.org/）中进行检索，去除重复项，获取OSAS脑损伤的疾病靶点。利用Venny 2.1.0在线工具，获得加减补阳还五汤药物作用靶点与OSAS脑损伤疾病靶点的交集靶点，即为加减补阳还五汤治疗OSAS脑损伤作用靶点。

1.4 加减补阳还五汤治疗OSAS脑损伤核心靶点的筛选

将加减补阳还五汤治疗OSAS脑损伤的药物作用靶点导入String数据库（https：//cn.string-db.org/），将物种设为“Homo Sapiens”，最低阈值设为≥0.4，进行PPI分析。从String数据库导出分析所得数据并导入Cytoscape 3.8.2软件，绘制交集靶点蛋白互作（PPI）网络图，以中介中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）和节点中心性（degree centrality，DC）三者大于各自中位数作为筛选条件进行筛选，最后保留符合条件的交集靶点作为加减补阳还五汤治疗OSAS脑损伤的核心靶点。

1.5 GO生物功能与KEGG通路富集分析

将上述交集靶点导入DAVID数据库（http：//david.ncifcrf.gov/）进行基因本体（gene ontology，GO）的生物学过程（biological process，BP），分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cell components，CC）以及KEGG通路富集分析，以P＜0.05为筛选条件，取矫正后P值排名前10的生物学功能和排名前20的信号通路，导入微生信（https：//www.bioinformatics.com.cn/）网站进行可视化分析，排名越靠前表示富集程度越高，说明该指标在加减补阳还五汤治疗OSAS脑损伤的机制调节中发挥的作用越大。

2 结　果

2.1 加减补阳还五汤活性成分筛选结果

共筛选出加减补阳还五汤活性成分161个，药物作用靶点1 565个，见表1。汇总去重后最终获得133个活性成分、331个药物作用靶点。

2.2 加减补阳还五汤治疗OSAS脑损伤作用靶点预测结果

在GeneCards和OMIM数据库中检索，分别获取疾病靶点3 656和548个，汇总去重后获得3 784个疾病靶点。将加减补阳还五汤药物作用靶点与OSAS脑损伤疾病靶点进行交集映射，得到交集靶点160个，并绘制韦恩图，见图1。

2.3 “中药-活性成分-靶点”网络构建分析结果

利用Cytoscape构建中药的活性成分及药物作用靶点的关系网络，见图2。此网络包括507个节点、2 656条边，通过比较DC大小进行分析筛选，DC越大表示其在网络中具有越重要的作用，筛选出DC排名前9的活性成分，见图2、表2。

2.4 加减补阳还五汤治疗OSAS脑损伤核心靶点筛选结果

将160个药物及疾病的共同作用的交集靶点输入到String数据库，构建PPI网络模型，根据节点中心性的大小进行筛选并绘制新的PPI网络图，筛选流程图见图3，最终获得11个核心靶点，见表3。

2.5 GO生物功能与KEGG通路富集分析结果

将加减补阳还五汤治疗OSAS脑损伤的交集靶点输入DAVID数据库进行GO生物功能富集分析，获得符合P＜0.05的数据（BP 481个、MF 136个、CC 85个），根据P值由小到大进行排列，将前10名作图呈现，见图4。结果显示：BP主要富集于尼古丁的反应、雌二醇的反应、兴奋性突触后电位、乙醇的反应、脂多糖的反应、丝裂原激活的蛋白激酶级联反应正调节、缺氧的反应等生物过程。CC主要富集于突触后膜、前膜的整体成分、脂筏、神经元投射、神经元细胞体、质膜的整体组成部分等生物过程。MF主要富集于谷氨酸受体活动、类固醇结合、细胞外配体门控性钙通道活动、调节突触后膜电位的递质门控离子通道活动、转录共激活因子结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性配体激活序列特异性DNA结合等生物过程。基于160个交集靶点，通过DAVID数据库对KEGG富集分析，经筛选得到191条信号通路（P＜0.05），按照包含基因数量多少进行排序，筛选出KEGG通路富集分析中排名前20名的通路作可视化分析，见图5。结果显示：加减补阳还五汤治疗OSAS脑损伤的交集靶点涉及到的信号通路主要有癌症通路、配体-受体相互作用、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、钙离子信使通路、脂质与动脉粥样硬化、化学致癌作用-受体激活、cAMP信号通路、癌症中的蛋白聚糖、乙型肝炎、化学致癌作用-活性氧、流体剪切应力与动脉粥样硬化、逆行内源性大麻素信号传导等信号通路。

3 讨　论

加减补阳还五汤含有大量的化合物，本研究筛选加减补阳还五汤的活性成分160个及药物作用靶点331个。“中药-活性成分-作用靶点”网络分析结果显示：加减补阳还五汤可通过多成分作用于多靶点来治疗OSAS脑损伤，单个药物可与不同的活性成分相对应，不同药物中都含有同一活性成分，如赤芍、当归、红花、橘红、桃仁共同化合物为β-谷甾醇，赤芍、当归、红花、党参共同化合物为豆甾醇，党参、甘草共同化合物为7-甲氧基2-甲基异黄酮，赤芍、当归、红花、橘红、桃仁、甘草中的含有多个活性成分并且其DC值排前10，分析结果显示：β-谷甾醇、豆甾醇、7-甲氧基2-甲基异黄酮、常春（藤苷）配基为加减补阳还五汤治疗OSAS脑损伤的关键活性成分节点，可作用于网络中的多个靶点。尽管每味中药作用的靶点数量不同，但不同中药之间存在较多重叠的作用靶点，提示加减补阳还五汤所含的多种不同化合物针对同一靶点可能具有协同效应，靶点之间复杂交错相互影响，形成复杂的作用网络。β-谷甾醇和豆甾醇是代表性的植物甾醇，具有抗炎、抗氧化、抗癌、降脂等多种药理活性^［10］，7-甲氧基2-甲基异黄酮、黄芩素均属黄酮类化合物，其作为强烈的抗氧化剂、自由基清除剂、二价阳离子螯合剂和脂质过氧化剂，在抗病毒、消炎、降血脂、降血糖、抑菌和抗癌等方面发挥着重要的作用^［11］。

通过PPI分析加减补阳还五汤治疗OSAS相关脑损伤的核心靶点11个，其中Akt1分值最高。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸酶，为PI3K下游重要的靶激酶，其在生长因子和细胞外刺激存在的情况下，对干预细胞的生长、生化、凋亡与增殖起关键调节作用。有文献报道补阳还五汤可减轻脑缺血、缺氧后神经细胞凋亡，改善神经功能，其机制与PI3K/Akt信号通路密切相关^［12］。临床文献报道OSAS患者患原发性脑癌的风险明显增高^［13-14］，补阳还五汤对化疗后所致神经损伤具有良好的疗效^［15］，药方中黄芪、赤芍、当归等可通过抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，诱导肿瘤细胞凋亡，调节机体免疫功能，逆转肿瘤细胞多耐药性，抑制血管生成等多种途径发挥抗肿瘤作用^［16-18］。综合KEGG通路富集和PPI分析结果可知癌症通路中的TP53、FOS可作为补阳还五汤治疗OSAS脑损伤研究的靶点。

GO生物功能及KEGG通路富集分析结果提示，加减补阳还五汤主要通过调控癌症通路、配体-受体相互作用、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、钙离子信使通路、脂质与动脉粥样硬化、化学致癌作用-受体激活、cAMP信号通路、癌症中的蛋白聚糖、乙型肝炎、化学致癌作用-活性氧、流体剪切应力与动脉粥样硬化、逆行内源性大麻素信号传导等信号通路，参与尼古丁的反应、雌二醇的反应、兴奋性突触后电位、突触后膜和前膜的整体成分、脂筏、神经元投射、谷氨酸受体活动、类固醇结合、细胞外配体门控性钙通道活动等生物过程起到治疗OSAS脑损伤的作用。OSAS已被证实是动脉粥样硬化的独立危险因素^［19］，血管内皮生长因子（VEGF）在动脉粥样硬化的发生、发展中具有双重作用，既有利于血管内膜的修复，又降低动脉粥样硬化斑块的稳定性^［20］。VEGF-A与其受体结合后，可通过Akt信号通路调节血管内皮细胞的分裂、增殖、迁移及生存^［21］。补阳还五汤可通过上调VEGF蛋白表达以促进血管新生，激活PI3K/Akt信号传导通路，从而减轻神经元损伤^［22-23］。本研究通过网络药理学分析提示加减补阳还五汤可通过核心靶点VEGF、Akt参与动脉粥样硬化相关信号通路发挥治疗OSAS脑损伤作用。

综上所述，加减补阳还五汤治疗OSAS脑损伤的机制涉及多个活性成分、作用靶点及通路，这与中医药治疗疾病“多成分、多靶点、多通路”的作用特点相符合。加减补阳还五汤活性成分复杂，通过作用相应靶点来调控雌激素反应、化学突触传递、神经元投射、脂质代谢、受体配体结合、细胞缺氧反应等生物过程，降低神经细胞的免疫反应、凋亡和促进神经干细胞的增殖修复作用，进而达到治疗OSAS脑损伤的目的，其作用机制可能与调控癌症通路、脂质与动脉粥样硬化、钙离子信使、cAMP、松弛素信号、雌激素等信号通路有关。本文仅从理论层面研究了加减补阳还五汤治疗 OSAS脑损伤的作用机制，本课题组后期将通过临床试验和实验进行进一步验证研究。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2020J01764)