运动训练联合电针对缺血性脑卒中大鼠突触可塑性及PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达量的影响

Effects of Exercise Training Combined with Electroacupuncture on Synaptic Plasticity and PI3K/AKT Signaling Pathway-Related Protein Expression in Rats with Ischemic Stroke

摘要

目的 观察运动训练联合电针对缺血性脑卒中模型大鼠突触可塑性及PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达量的影响，探讨运动训练联合电针治疗缺血性脑卒中模型大鼠的作用机制。 方法 将50只SPF级雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、电针组、运动组和联合组，每组10只。其中模型组、电针组、运动组和联合组参照Zea-Longa线栓法构建大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的缺血性脑卒中大鼠模型，假手术组仅分离左侧颈动脉，不插入线栓，直接缝合，当Zea-Longa神经功能缺损评分为1～3分则表示模型制备成功。电针组电针百会、神庭穴，30 min/次；运动组予以跑台训练，30 min/次；联合组先予跑台训练30 min，再电针百会、神庭穴30 min。各组干预周期均为2周，1 次/d，5 d/周。模型组、假手术组大鼠仅予以同等抓取及固定，不做任何干预。干预前后采用Zea-Longa神经功能缺损评分评定大鼠神经功能缺损情况；7.0T小动物核磁共振扫描观察脑梗死体积占比；干预后采用Morris水迷宫实验观察5组大鼠逃避潜伏期以及穿越平台次数；采用Golgi染色法观察左侧海马CA1区树突棘形态及数量变化；采用Western blot检测大鼠左侧海马组织PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达量。 结果 与假手术组比较，模型组大鼠Zea-Longa神经功能缺损评分、脑梗死体积占比显著升高，Morris水迷宫实验逃避潜伏期、穿越平台次数显著增加，树突棘形态呈现脱落萎缩，排列紊乱，数量减少，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值显著降低（P均＜0.05）。与模型组比较，电针组、运动组和联合组大鼠干预后Zea-Longa神经功能缺损评分降低，脑梗死体积占比减少，Morris水迷宫实验逃避潜伏期减少、穿越平台次数增加，树突棘形态更完整、排列整齐、数量增多，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值显著升高（P均＜0.05）。与电针组、运动组比较，联合组干预后Zea-Longa神经功能缺损评分显著降低，脑梗死体积占比显著下降，Morris水迷宫实验逃避潜伏期显著减少，且穿越平台次数显著增加，树突棘形态更加完整、数量明显增多，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值显著升高（P均＜0.05）。 结论 运动训练联合电针可减轻缺血性脑卒中大鼠神经功能损伤，缩小脑梗死体积，促进海马突触可塑性修复，改善学习记忆能力，其机制可能与调控PI3K/Akt信号通路有关。

Abstract

Objective To explore the effect and mechanism of exercise training combined with electroacupuncture on synaptic plasticity and PI3K/AKT signaling pathway-related protein expression in ischemic stroke model rats. Methods Fifty SPF male SD rats were randomly divided into the sham operation group, model group, electroacupuncture group, exercise group and combination group, with 10 rats in each group. The ischemic stroke rat model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) was established by the modified Zea-Longa thread occlusion method in the latter four groups, while rats in the sham operation group were separated from the left carotid artery without inserting the thread plug and then directly sutured it. The successful establishment of the model was indicated when the Zea-Longa score was 1 to 3. The electroacupuncture group received electroacupuncture on Baihui and Shenting acupoints for 30 minutes; the exercise group was given treadmill training for 30 minutes; the combination group was treated with treadmill training and then received electroacupuncture intervention for 30 minutes each. All groups were intervened for 2 weeks, once per day for 5 days per week. The rats in the model and sham operation groups were only equally grasped and fixed without any intervention. Zea-Longa scoring system was used to evaluate the neurological impairment of rats. Observation of the proportion of cerebral infarction volume by 7.0 T small animal magnetic resonance scanning. Morris water maze test was used to observe the escape latency and the number of times crossing the platform of rats in 5 groups. Morphological and quantitative changes of dendritic spines in left hippocampal CA1 region were observed by Golgi staining. Western Blot was used to detect the protein expression of PI3K, AKT, p-PI3K and p-AKT in the left hippocampal tissue of rats. Results Compared with the sham operation group, the Zea-Longa score increased significantly in the model group, the volume ratio of cerebral infarction increased significantly, the escape latency and the number of crossings of the Morris water maze experiment increased significantly, dendritic spines were atrophy, disordered, and reduced in number, and the ratio of p-PI3K/PI3K and p-AKT/AKT decreased significantly (P all<0.05). Compared with the model group, the Zea-Longa score in the electroacupuncture, exercise and combination groups were reduced; the proportion of cerebral infarction volume decreased in rats; the time of escape latency reduced and the number of crossing the platform increased; the dendritic spines were more complete in morphology, neatly arranged and increased in number; the p-PI3K/PI3K and p-AKT/AKT ratios were significantly higher (P all<0.05). Compared with the electroacupuncture and exercise groups, the Zea-Longa score decreased significantly in the combination group; the proportion of cerebral infarction volume decreased significantly; the time of escape latency reduced significantly, and the number of crossing the platform increased significantly; the morphology of hippocampal CA1 dendritic spines were more complete and increased in number; the ratios of p-PI3K/PI3K and p-AKT/AKT were significantly up-regulated (P all<0.05). Conclusion Exercise training combined with electroacupuncture could reduce the neurological impairment, decrease the volume of cerebral infarction, promote the repair of hippocampal synaptic plasticity, and improve the learning and memory ability in ischemic stroke rats. The mechanism may be related to the regulation of PI3K/AKT signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

缺血性脑卒中 / 电针 / 运动 / 突触可塑性 / PI3K/Akt信号通路

Key words

ischemic stroke / electroacupuncture / exercise / synaptic plasticity / PI3K/AKT signaling pathway

脑卒中是一种高发病率、高病死率和高致残率的疾病，已成为致残的第二大原因^［1］。缺血性脑卒中占脑卒中的80%^［2-3］，高达65%患者患有认知功能障碍^［4］，给家庭和社会带来了沉重的负担。运动和电针疗法均是临床上常用于治疗脑卒中认知功能障碍的非药物疗法^［5-8］，然而，单一的康复治疗恢复效果有限^［9］。随着研究深入，更多学者发现运动与电针联合使用可以提高疗效，加速脑卒中后认知功能康复^［10-11］。本研究前期的Meta分析显示：针刺联合康复运动训练可以显著提高脑卒中后认知功能障碍患者简易智力状态检查量表（MMSE）和蒙特利尔认知评估量表（MoCA）评分，改善患者认知功能，疗效优于单一康复运动训练^［12］，但其机制尚未阐明。

认知功能包括言语加工、空间认知、学习和记忆等，这些功能的实现与突触可塑性密切相关^［13-14］。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信号转导通路在突触可塑性中发挥重要作用，PI3K/Akt途径的激活可激活N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体，促进钙离子内流和钙调蛋白激活，增强神经细胞的突触可塑性，从而促进神经功能恢复^［15-16］。然而，运动训练联合电针诱导的缺血性脑卒中神经保护机制是否通过PI3K/Akt通路而实现尚不清楚。鉴于此，本研究拟观察运动训练联合电针对缺血性脑卒中大鼠突触可塑性及PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达量的影响，探讨运动训练联合电针治疗缺血性脑卒中的机制。

1 材料及方法

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠50只，体质量（280±20） g，购自上海斯莱克有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2020-0002，由福建中医药大学SPF级实验动物中心饲养，动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007，每笼随机饲养5只，室内保持恒湿恒温（温度控制在21～25 ℃，湿度控制在40%～60%），提供24 h自由饮水饮食。本实验已通过福建中医药大学动物实验伦理委员会审批（审批号：FJTCMIACUC2022045），并严格遵守国家实验动物卫生指导使用原则。

1.2 实验试剂

Golgi试剂盒（美国FD Neurotech公司，批号：PK401A）；4%多聚甲醛（武汉博士德生物工程有限公司，批号：AR1069）；三溴乙醇（南京爱贝生物科技有限公司，批号：M2820）；异氟烷（批号：R510-22）、大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）线栓（批号：MSRC40B250PK50）购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；PMSF（批号：ST506）、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（批号：P0012A）、TBS溶液（批号：ST661）、BCA工作液（批号：P0012S）、Western一抗稀释液（批号：P0023A）、Western二抗稀释（批号：P0023D）、Western转膜液（批号：P0021B）均购自上海碧云天生物技术股份有限公司；Akt抗体（批号：#9272）、p-Akt抗体（批号：#4060s）均购自美国CST公司；PI3K抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：20584-1-AP）；p-PI3K抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，批号：AF3242）；异氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批号：R540）。

1.3 实验仪器

电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司，型号：SDZ-V）；大鼠Morris水迷宫（型号：XR-XM101）、小动物实验跑步机（型号：XR-PT-10B）均购自上海欣软信科技有限公司；7.0 T小动物核磁共振仪（德国Bruker公司，型号：70/20）；蛋白电泳仪（型号：041BR301398）、凝胶成像系统（型号：721BR18682）均购自美国 Bio-Rad公司。

1.4 分组及大鼠缺血性脑卒中模型构建

将50只SPF级雄性SD大鼠按照随机数字表法随机分为假手术组、模型组、电针组、运动组、联合组，每组各10只。除假手术组外，其余4组均参照改良的Zea-Longa法^［17］构建MCAO的缺血性脑卒中大鼠模型：术前12 h开始禁食，可饮水，采用三溴乙醇溶液按体质量6 mL/kg进行腹腔注射麻醉；成功麻醉后将大鼠固定在固定台上，保持仰卧位；常规消毒、备皮后，沿颈中线剪开皮肤，钳钝性分离皮下筋膜脂肪，而后分离并充分暴露大鼠左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉、深部分支翼腭动脉；用4-0医用结扎线结扎颈外动脉和颈总动脉，用微动脉血管夹轻柔夹闭远端翼腭动脉和颈内动脉，用显微剪在距离颈总动脉分叉近端1.0 mm处剪一切口，将线栓缓慢推动插入切口，进入颈内动脉直至大脑中动脉，将颈内动脉结扎并固定线栓，切口消毒缝合；手术完毕后，立即腹腔注射青霉素钠0.2 mL以预防感染；手术2 h后，缓慢拔出线栓退回至颈总动脉分叉口，使大脑中动脉恢复血流灌注。造模完成后将大鼠从固定台移至铺有敷料的鼠笼中，使大鼠体温保持在（37±0.5）℃，直至大鼠苏醒并恢复活动。假手术组大鼠只分离同样的血管，不予以插入线栓和结扎，随后缝合皮肤。当Zea-Longa神经功能缺损评分^［17］为1～3分则表明模型制备成功。评分标准见表1。

1.5 干预方法及取材

电针组予以电针治疗，取穴方法参考《实验针灸学》^［18］，穴位局部消毒后，予以0.5寸华佗牌不锈钢毫针（苏州医疗用品厂有限公司，规格：0.25 mm×13 mm，批号：140260）斜刺大鼠百会、神庭穴，针刺深度为5 mm，连接电子针疗仪，设置参数为电压6 V、疏密波、频率2/20 Hz，每次电针30 min；运动组采用小动物实验跑步机对大鼠进行运动训练，设置参数为跑台速度15 m/s、跑台坡度为0°，每次运动30 min^［19］；联合组先采用运动训练30 min，再予电针百会、神庭穴30 min。以上3组均为1次/d，5 d/周，持续2周。假手术组与模型组大鼠仅予以同等抓取及固定，不做其他干预。在5组中各随机选6只，用三溴乙醇对大鼠进行腹腔注射麻醉后快速断头、取脑，取其中3只大鼠的脑组织进行Golgi染色实验；另外3只大鼠的脑组织置于放有冰块的培养皿上进行组织分离，将分离出的缺血侧海马组织放入EP管中，移置-80 ℃冰箱中保存，用于Western blot实验。

1.6 观察及检测指标

1.6.1 测定大鼠脑梗死体积占比

将5组大鼠放于麻醉诱导盒内进行气体（由5 %异氟烷与95 %氧气构成）麻醉约5 min。当大鼠完全麻醉后，将大鼠俯卧位固定于扫描架上，采用循环热水泵维持大鼠体温，并通过呼吸检测仪实时监测每只大鼠的生命体征，随后用7.0 T小动物核磁共振仪进行核磁扫描：先采集定位像，确定动物位置摆放正确及图像质量，再行T2结构像扫描。具体参数如下：回波时间（Echo Time）＝60 ms，重复时间（Repetition time）＝10 140 ms，平均次数（Average）＝8，循环次数（Repetition）＝1，FOV＝20×20。扫描结束后采用ITK-SNAP软件对脑梗死区域图像进行分割，并通过matlab2013b程序计算每只大鼠的梗死体积及其占比。梗死体积计算公式如下：

脑梗死体积＝脑梗死区域像素点数目×像素点的空间分辨率

脑梗死体积占比＝脑梗死体积/全脑体积×100%

1.6.2 Morris水迷宫实验比较大鼠学习记忆能力

水迷宫水池正上方安装小动物追踪定位摄像头，记录大鼠游泳时长和轨迹。Morris水迷宫为一圆桶形水池，直径120 cm，深50 cm，水池内壁被漆为白色，池内水深30 cm，水温保持在18～23 ℃左右，池壁上4个等距离点将水池为4个象限，并在池周边缘予以标记，把直径6 cm的平台置于第3象限（目标象限），水深高于平台1～2 cm。本实验分为定位航行实验和空间探索实验，共5 d。第1～4天为Morris水迷宫训练，提捏大鼠尾部将其头朝池壁依次从4个象限固定入水点放入水中，测其在90 s内找到平台所需的时间，即为逃避潜伏期，如果大鼠90 s内未找到平台，需将其放置于平台停留15 s，此时逃避潜伏期记为90 s，每天训练1次。第5天进行空间探索实验，将第3象限平台撤除，将大鼠从第1象限的相同入水点面朝池壁放入水中，记录大鼠在90 s内穿越平台所在位置的次数。

1.6.3 Golgi染色法观察大鼠海马CA1树突棘形态及数量

按照Golgi试剂盒使用说明书，在取材前24 h将等量的A、B液混合并放入包有锡箔纸的EP管中，置于干燥避光环境中保存。取材后将大鼠全脑组织放入提前配好的A、B混合液中，24 h后，更换A、B混合液，再转移至避光场所中静置14 d。随后将其转移至溶液C中至少72 h后换新的C液，浸泡完成后使用冰冻切片制备成100 μm厚度切片。将切片置于工作液（双蒸水∶E溶液∶D溶液＝2∶1∶1）中。在50%、75%、95%乙醇中进行梯度脱水各1次，无水乙醇中脱水4次，再将其置于二甲苯中完成透明化处理，树脂封片后使用光学显微镜进行拍片，每只大鼠随机选取左侧海马CA1区树突棘的20个视野进行拍照，并采用ImageJ软件计算树突棘数量取其均值。

1.6.4 Western blot检测大鼠海马p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值

将大鼠海马组织从冰箱取出置于冰上，按1∶10比例加入含有1%PMSF蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液充分裂解，用超声裂解仪研磨组织，于低温高速离心机中以4 ℃、14 000 r/min离心15 min，提取上清液后分装，并采用BCA方法对提取的海马组织总蛋白进行定量，蛋白经变性、电泳、转膜后采用5%的脱脂牛奶封闭1 h；纯水5 min洗3次；分别置于PI3K（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）一抗中4 ℃摇床过夜；TBST漂洗后孵育二抗，置于摇床上常温孵育1 h；随后用提前配置好的ECL显影液进行显影处理，凝胶成像系统曝光成像后，采用ImageJ软件分析并计算蛋白条带灰度值。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 25.0处理。计量资料符合正态分布者，采用（\overline{x}±s）进行描述，多组间比较采用单因素方差分析，方差符合齐性分布时采用LSD-t法，若方差不齐行Game's Howell法检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结　果

2.1 5组大鼠Zea-Longa神经功能缺损评分比较

见表2。

2.2 5组大鼠脑梗死体积占比比较

见表3、图1。

2.3 5组大鼠干预后Morris水迷宫实验逃避潜伏期比较

见表4。

2.4 5组大鼠干预后Morris水迷宫实验穿越平台次数比较

见表5、图2。

2.5 5组大鼠左侧海马CA1区树突棘形态及数量比较

与假手术组比较，模型组大鼠海马CA1树突棘形态呈现脱落萎缩，排列紊乱，数量减少（P＜0.05）；与模型组比较，电针组、运动组和联合组大鼠海马CA1树突棘形态较完全，排列较整齐，数量明显增多（P＜0.05），且联合组较电针组和运动组，树突棘数量明显增多（P＜0.05）。见图3、表6。

2.6 5组大鼠海马p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比较

见表7、图4。

3 讨　论

缺血性脑卒中是由于脑的供血动脉狭窄或闭塞，导致脑供血不足而引发的脑组织坏死^［20］。目前临床上对于治疗缺血性脑卒中后认知障碍尚无统一的标准^［21］。本团队前期研究发现，电针百会、神庭穴可通过直接作用于大脑从而刺激特定相关脑区，改善学习记忆能力^［22-23］，而有氧运动可以通过增加脑内神经营养因子含量、增强突触可塑性等途径改善认知障碍^［24-25］。

突触可塑性是学习记忆的细胞生理学基础^［26］。突触功能紊乱和突触减少是脑卒中后认知障碍典型的病理特征^［27］，脑缺血损失可影响突触结构，导致突触数量减少，形态改变^［28-29］。树突棘存在于树突表面的细小突起，是兴奋性突触的突触后成分，树突棘的动态变化是突触重构的重要表现^［30］。脑卒中后可导致树突棘密度明显降低，并随着缺血时间延长而呈现逐渐降低趋势^［31］。本研究发现模型组大鼠海马树突棘排列紊乱，树突棘密度、分支减少。由此表明，缺血性脑卒中模型存在突触超微结构损伤，影响海马突触结构可塑性。与模型组比较，电针组、运动组和联合组树突棘形态较完整，排列整齐，数量、密度增多，且联合组改善程度明显优于电针组和运动组，表明运动联合电针能够增加树突棘密度、数量，促进树突棘再生，从而修复脑缺血后突触结构损伤。

PI3K/Akt通路可以通过多种机制影响突触可塑性^［16］。研究发现，PI3K/Akt通路调节突触前和突触后蛋白质的合成，影响突触连接的形态和功能。此外，PI3K/Akt通路还可以影响神经元的存活和凋亡，从而影响突触可塑性的持续时间和程度^［32］。本研究结果显示，与模型组、电针组、运动组比较，联合组大鼠Zea-Longa神经功能缺损评分、脑梗死体积显著下降，Morris水迷宫实验穿越平台次数、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值显著升高，这可能是由于运动联合电针激活PI3K/Akt信号通路，改善海马突触可塑性，从而缩小脑梗死体积，改善神经功能评分，促进大鼠学习记忆能力的恢复。

综上，运动联合电针可减轻缺血性脑卒中大鼠神经功能损伤，缩小脑梗死体积，促进海马突触可塑性修复，改善学习记忆能力，其机制可能与调控PI3K/Akt信号通路有关。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2023J011160)

福建医科大学启航基金项目(2020QH1137)