温针灸对膝骨关节炎模型大鼠软骨组织Caspase-3、Caspase-9 mRNA转录水平的影响

Effect of Needle-Warming Moxibustion on Transcription Level of Caspase-3 and Caspase-9 in Cartilage Tissue of Rats with Knee Osteoarthritis

摘要

目的 分析温针灸对膝骨关节炎（KOA）模型大鼠软骨组织Caspase-3、Caspase-9 mRNA转录水平的影响，探讨温针灸治疗KOA的可能作用机制。 方法 将24只8周龄SPF级雄性SD大鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组与温针灸组，每组8只。模型组与温针灸组采用4 %木瓜蛋白酶注射法建立KOA模型，空白组不做任何处理，当大鼠出现膝关节肿大，局部刺激有疼痛反应且Lequesne MG行为学评分≥3分时，提示造模成功。造模成功后温针灸组取双侧内膝眼、犊鼻穴，以毫针直刺，深度约5 mm，将艾段点燃放置于针柄末端，共灸2壮，留针20 min；空白组与模型组同等抓取固定20 min，1次/d，不做任何治疗。3组每周均干预6 d，休息1 d，共干预2周。干预后采用Lequesne MG行为学评分评估3组大鼠行为学表现，HE染色法及番红-固绿染色法观察3组大鼠膝关节软骨组织形态变化，Mankin's评分评估3组大鼠软骨退变程度，TUNEL染色法观察3组大鼠膝关节软骨细胞凋亡率，qPCR检测3组大鼠膝关节软骨组织Caspase-3、Caspase-9 mRNA转录水平。 结果 与空白组比较，模型组Lequesne MG行为学评分明显升高（P＜0.05）；HE染色结果显示膝关节软骨组织各层结构不清，表层出现缺损、裂隙，软骨细胞数量弥漫性增多或局部减少且软骨细胞排列紊乱；番红-固绿染色结果显示软骨基质番红染色不均，固绿染色范围增加，潮线不清；Mankin's评分升高（P＜0.05），膝关节软骨组织细胞凋亡率升高（P＜0.05），Caspase-3 mRNA转录水平无明显变化（P＞0.05），Caspase-9 mRNA转录水平升高（P＜0.05）。与模型组比较，温针灸组Lequesne MG行为学评分降低（P＜0.05），HE染色结果显示膝关节软骨组织表层较为平整，软骨细胞数量弥漫性增多且排列不规则，但优于模型组；番红-固绿染色结果显示软骨基质番红染色未见明显异常，潮线清晰，Mankin's评分下降（P＜0.05），膝关节软骨细胞凋亡率下降（P＜0.05），Caspase-3 mRNA转录水平降低不明显（P＞0.05），Caspase-9 mRNA转录水平降低（P＜0.05）。 结论 温针灸能够有效保护膝关节功能，抑制膝关节软骨细胞的凋亡，延缓KOA软骨退变，其机制可能与调控凋亡因子Caspase-9 mRNA转录水平有关。

Abstract

Objective To analyze the effect of needle-warming moxibustion on transcription levels of Caspase-3 and Caspase-9 in cartilage tissue of knee osteoarthritis (KOA) model rats, so that to explore the possible mechanism of needle-warming moxibustion(NWM) in the treatment of KOA. Methods A total of 24 SPF male SD rats aged 8 weeks were randomly divided into the blank group, model group and NWM group, with 8 in each group. Establishing KOA models using 4% papain injection in the model and NWM groups, while the blank group received no treatment. The knee joint of rats enlarged and showed pain response to local stimulation, with Lequesne MG behavioral score ≥3, which indicated that the KOA models were successfully established. Then the NWM group acuputured bilateral Xiyan and Dubi acupoints, the depth was about 5 mm. Placing a small section of moxa stick onto the handle of an inserted needle and igniting it. The moxibustion was carried out for twice, and the retention of needle was for 20 minutes. The blank and model groups were equally captured and fixed for 20 minutes without any treatment once a day. All the three groups were intervened for 6 days a week and rested for 1 day for 2 weeks. The Lequesne MG score was used to evaluate the behavioral performance of rats, the HE staining and the safranin-fast green staining methods were used to observe the morphological changes of knee cartilage, the Mankin's scoring system was used to evaluate the degree of cartilage degeneration, and the TUNEL staining was used to observe the apoptosis rate of cartilage cells from knee joints of rats in the three groups. The transcription level of Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in knee cartilage were detected by qPCR. Results Compared with the blank group, the Lequesne MG score in the model group significantly increased (P<0.05). The result of HE staining showed that the structure of all layers of the knee cartilage tissue was unclear, surface defects and cracks appeared, the number of chondrocyte diffuse increased or locally decreased, and the arrangement of chondrocytes was disordered. The result of safranin-fast green staining showed uneven saffranin staining of cartilage matrix, increased staining range of solid green, unclear tide line; the Mankin's score and the apoptosis rate of knee cartilage tissue cells increased (P<0.05), and no significant increase in Caspase-3 transcription level (P>0.05). The transcription level of Caspase-9 mRNA increased (P<0.05). Compared with the model group, the Lequesne MG score of the NWM group was lower (P<0.05), the HE staining result showed the surface layer of knee cartilage tissue was relatively flat, the number of chondrocytes increased diffusely and arranged irregularly, but it was better than the model group, the safranin-fast green staining showed that no obvious abnormality was found in matrix staining and the tide line was clear; and the Mankin's score decreased (P<0.05). The apoptosis rate of knee cartilage cells was decreased (P<0.05), the transcription level of Caspase-3 mRNA didn’t significantly decrease (P>0.05), while the transcription level of Caspase-9 mRNA decreased (P<0.05). Conclusion Needle-warming moxibustion can effectively protect the function of knee joint, inhibit the apoptosis of chondrocytes and delay the degeneration of KOA cartilage, the mechanism of which may be related to the regulation of transcription level of Caspase-9 mRNA.

Graphical abstract

关键词

膝骨关节炎 / 温针灸 / 凋亡 / Caspase-3 / Caspase-9

Key words

knee osteoarthritis / needle-warming moxibustion / apoptosis / Caspase-3 / Caspase-9

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以膝关节软骨发生退行性改变、局部出现缺损及软骨下骨赘形成为主要特征的慢性骨关节疾病，其软骨退变的病理过程不可逆转，临床上暂无特效疗法，治疗重点在于缓解疼痛、肿胀等症状，改善关节功能^［1］，故在疾病早期应积极采用保守治疗，以延缓软骨退行性变进程。温针灸作为中医传统外治法之一，结合了刺法疏通经络与灸法的温热效用，治疗KOA收效满意，且无口服药物可能引起的毒副作用，但具体的起效机制尚未被完全被阐明。

软骨细胞异常凋亡是软骨组织发生退变的主要病理因素，亦是造成软骨破坏的中心环节^［2］。现代研究表明Caspase级联系统直接参与介导细胞凋亡，在细胞凋亡不同途径的信号诱导、传递和放大中均发挥了至关重要的作用^［3］。而温针灸可有效减缓软骨及软骨下骨退变，抑制病情发展^［4-5］，其作用是否与Caspases级联系统有关尚不清楚。故本研究观察温针灸干预内膝眼、犊鼻穴对KOA模型大鼠动物行为学、膝关节软骨组织形态学、软骨细胞凋亡率与软骨组织Caspase-3、Caspase-9 mRNA转录水平的影响，以探讨温针灸治疗KOA的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

24只SPF级雄性SD大鼠，8周龄，体质量（200±20）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0008，大鼠饲养于福建中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2020-0002，分笼饲养，饮水与进食不作限制，适应性喂养1周。实验方案经福建医科大学附属第二医院动物实验伦理委员会批准，审批号为〔2020〕福医附二伦理审字（403号）。动物处理方法符合中华人民共和国科技部2006年颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要试剂、耗材与仪器

1.2.1 主要试剂

木瓜蛋白酶（上海麦克林生化科技有限公司，批号：P6321）；异氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司，批号：R510-22-10）；戊巴比妥钠（德国Merck公司，批号：20140820）；中性多聚甲醛固定液（批号：G1101）、EDTA脱钙液（批号：G1105）、HE染液套装（批号：G1003）、骨组织番红-固绿染液套装（批号：G1053）、TUNEL试剂盒（批号：G1502）均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；反转录试剂盒（批号：AT301）、实时荧光定量PCR试剂盒（批号：AQ101）均购自北京全式金生物技术有限公司；qPCR引物委托福州尚亚生物技术有限公司合成。

1.2.2 主要耗材

艾段（南阳仲圣药业有限公司，规格：0.7 cm×1 cm，产品批号：20220608）；华佗牌一次性使用无菌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司，规格：0.25 mm×13 mm，产品批号：20220608）。

1.2.3 主要仪器

脱水机（意大利DIAPATH公司，型号：Donatello）；包埋机（型号：JB-P5）、冻台（型号：JB-L5）均购自武汉俊杰电子有限公司；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016）；组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号：KD-P）；正置光学显微镜（日本Nikon公司，型号：Nikon Eclipse E100）；高速低温离心机（德国Eppendorf公司，型号：Centrifuge 5424R）；微量紫外-可见光分光光度计（型号：NanoDrop One）、荧光定量PCR仪（型号：ABI QuantStudio 3）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 分组及模型制备方法

根据计算机生成的随机数字将大鼠分为空白组、模型组与温针灸组，每组8只。模型组与温针灸组均采用木瓜蛋白酶注射法^［6-7］建立KOA模型，具体操作如下：在适应性喂养后的第1、4、7天，将异氟烷呼吸麻醉后的大鼠仰卧位放置，剃除双侧膝关节局部毛发，常规消毒后，术者持1 mL一次性无菌注射器抽取4 %木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.2 mL，从双侧髌韧带外侧凹陷处进针，针下有明显落空感说明注射器针头已进入关节腔，此时可注入药液。第3次注射结束后大鼠饲养2周，于饲养最后1 d对3组大鼠进行Lequesne MG行为学评分。模型组与温针灸组出现膝关节肿大^［8］、局部刺激疼痛反应且Lequesne MG行为学评分≥3分时，提示造模成功^［9］。见表1。

1.4 干预方法

以提尾法将温针灸组大鼠从笼中抓取至操作台，取黑色长袜套住其头部与上肢，再将皮筋绕过腋下固定于胸部；随后用自制鼠板将大鼠仰卧位固定，双侧膝关节自然屈曲。腧穴定位参考《实验针灸学》^［10］并结合动物比较学方法，取双侧内膝眼、犊鼻穴，穴位局部消毒后以毫针直刺，深度约5 mm，将大小为0.7 cm×1 cm的艾段点燃放置于针柄末端，共灸2壮，留针20 min；空白组、模型组同等抓取固定，每日1次，每次20 min。3组每周均干预6 d，休息1 d，共干预2周。干预期间温针灸组1只大鼠因束缚过紧死亡，故温针组最终样本量为7只。

1.5 取材方法

最后1次干预结束后予以禁食，预备次日取材。大鼠用3%戊巴比妥钠依据0.3 mL/100 g体质量腹腔注射麻醉后处死；依次剥离大鼠后肢皮毛、肌肉、韧带等组织，暴露膝关节。每组随机挑选半数大鼠，打开其左膝关节，取胫骨平台与股骨髁软骨组织至研磨管，暂存液氮中，后转至超低温冰箱-80 ℃保存，用于qPCR检测；剩余半数大鼠经同样方法处理后，以咬骨钳分离完整的左膝关节，置于多聚甲醛固定液中固定24 h，用于后续实验。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 膝关节损伤程度

干预前后参照Lequesne MG行为学评分标准^［11］，对3组大鼠左侧膝关节的局部疼痛刺激反应、关节肿胀程度、步态改变程度及关节活动范围进行评分。其中局部疼痛刺激反应分4级，评分0～3分；关节肿胀程度3级，评分0～2分；步态改变分4级，评分0～3分；关节活动范围分4级，评分0～3分。评分由同一观察者进行操作，评分越高表明膝关节损伤越严重。

1.6.2 左膝关节软骨组织形态学

取出固定好的左膝关节浸没于EDTA脱钙液中，摇床缓慢脱钙，隔天查看一次脱钙程度并更换脱钙液，当针可轻松刺入骨组织后说明脱钙完成。常规脱水包埋后，取蜡块用切片机切成4 μm厚的石蜡切片，按HE染液套装说明书及骨组织番红-固绿染液套装说明书进行相关染色操作；染色完成后，脱水封片，于光学显微镜下观察软骨组织形态。

1.6.3 左膝关节软骨组织损伤程度

根据光镜下番红-固绿染色的软骨组织形态观察结果，参照Mankin's评分^［12］评估。

1.6.4 左膝关节软骨组织细胞凋亡率

取石蜡切片，按TUNEL试剂盒说明书进行相关操作，染色完成后，脱水封片，于荧光显微镜下观察软骨细胞凋亡情况，在200倍视野下进行图像采集，每个样本选取3个不连续视野，计算凋亡细胞数与细胞总数，取其平均值并计算细胞凋亡率。

细胞凋亡率＝凋亡细胞数/细胞总数×100%

1.6.5 左膝关节软骨组织Caspase-3、Caspase-9 mRNA转录水平

取在超低温冰箱-80 ℃保存的软骨组织置于液氮预冷过的研钵，用研钵充分研磨至粉末状，再转移至1.5 mL离心管中，用强化RNA提取试剂盒提取总RNA后，按反转录试剂盒说明书操作：42 ℃ 孵育15 min，85 ℃灭活5 s，得到cDNA。按实时荧光定量PCR试剂盒说明书配置qPCR总反应体系进行扩增操作，条件为：94 ℃ 30 s预变性；94 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s循环40次；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，94 ℃ 15 s终止。GAPDH为内参，2^-ΔΔCt法计算Caspase-3、Caspase-9 mRNA转录水平，具体引物序列见表2。

1.7 统计学方法

采用软件IBM SPSS 26.0进行统计学处理。计量资料符合正态分布的以（\overline{x}±s）表示，组内比较采用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析，方差平齐以LSD-t法检验，方差不齐则用Game's-Howell法；计量资料不符合正态分布的以M（P₂₅，P₇₅）表示，组内比较采用配对秩和检验，组间比较采用多样本秩和检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结　果

2.1 3组干预前后Lequesne MG行为学评分比较

见表3。

2.2 3组大鼠膝关节软骨组织形态比较

2.2.1 3组大鼠膝关节软骨组织HE染色结果比较

结果显示，大鼠膝关节软骨组织中的软骨细胞核呈蓝紫色，软骨胞质及基质呈粉色。空白组大鼠软骨组织各层结构清晰，表层平整，细胞排列齐整，基质着色均匀，潮线完整；模型组大鼠膝关节软骨组织表层出现缺损、裂隙，各层结构不清，软骨细胞数量减少且排列失序；温针灸组大鼠膝关节软骨表层平整，软骨细胞数量弥漫性增多且排列不规则，但优于模型组。见图1。

2.2.2 3组大鼠膝关节软骨组织番红-固绿染色结果比较

番红-固绿染色后大鼠膝关节软骨基质中的糖胺聚糖呈红色，软骨组织中的胶原纤维及软骨下骨呈绿色。结果显示：空白组大鼠软骨组织基质番红着色均匀，与软骨下骨界限清晰，潮线完整；模型组大鼠膝关节软骨表层毛糙，局部有丝绒样改变，表层及移行层番红着色不均，基质固绿染色范围扩大，提示软骨基质中糖胺聚糖成分相对减少，胶原纤维成分增加，潮线较为模糊；温针灸组大鼠膝关节软骨表层平整，基质番红着色较均匀，潮线清晰，整体形态优于模型组。见图2。

2.3 3组大鼠膝关节软骨组织Mankin's评分比较

见表4。

2.4 3组大鼠膝关节软骨组织TUNEL染色结果及软骨细胞凋亡率比较

TUNEL染色后大鼠膝关节软骨组织中凋亡的软骨细胞呈绿色荧光表达。结果显示：空白组大鼠关节软骨可见少量弱阳性或阳性表达，散在分布于软骨基质中，说明正常软骨细胞亦有少量细胞凋亡；模型组软骨组织中可见大量绿色阳性表达，密集分布于软骨基质中。与空白组比较，模型组大鼠软骨组织细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，温针灸组软骨组织细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）。见表5、图3。

2.5 3组软骨组织Caspase-3、Caspase-9 mRNA转录水平比较

实验结果显示：与空白组比较，模型组大鼠膝关节软骨组织Caspase-3 mRNA转录水平无明显变化（P＞0.05），Caspase-9 mRNA转录水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，温针灸组大鼠膝关节软骨组织Caspase-3 mRNA转录水平降低不明显（P＞0.05），Caspase-9 mRNA转录水平降低（P＜0.05）。见表6。

3 讨　论

中医认为KOA属“痹证”范畴，其病位在筋骨，是因患者素体肝肾亏虚或劳逸过度，复外感风寒湿邪，邪气痹阻经络，气血运行不畅，导致筋脉关节失于濡养，气滞血瘀，出现疼痛、麻木、肿大、关节屈伸不利等症状，为本虚标实证，治宜标本兼治。《素问·至真要大论》曰：“寒者热之……结者散之……损者温之。”温针灸结合艾灸“温补”与针刺“行散”的功效，具有温肾散寒止痛、疏经通络活血的作用^［13］。诸多研究证实温针灸治疗KOA疗效显著，能有效延缓关节软骨的退变^［14-18］，但其机制仍未完全明确。

软骨细胞与其分泌合成的细胞外基质共同构成关节软骨。软骨细胞维持细胞外基质的正常理化结构与功能，细胞外基质又对软骨细胞起保护作用，二者相互依存，维护关节软骨的相对稳定。KOA发生时，关节软骨损伤可引起软骨细胞的凋亡，导致细胞外基质的降解，使软骨细胞失去保护，进一步引发细胞凋亡，形成恶性循环，最终导致关节软骨发生退变，引发一系列临床症状^［19］。本研究结果显示：温针灸干预可维持软骨细胞结构与功能的相对正常，调节膝关节软骨中糖胺聚糖与胶原纤维的相对含量，降低关节软骨的损伤程度，维护关节软骨结构的相对稳定，延缓关节软骨退变进程，改善KOA疼痛、肿胀及功能障碍等症状，从而有效治疗KOA。

凋亡性Caspases是细胞凋亡机制的核心成分，其又分为“启动子”与“执行者”^［20］。在线粒体介导的内源性细胞凋亡途径中，凋亡启动子Caspase-9受上游信号刺激后活化，并进一步激活下游执行者Caspase-3和Caspase-7，最终导致细胞凋亡发生^［21-25］。现代研究表明KOA发生后，Caspase-3和Caspase-9 mRNA转录水平均显著升高^［26-27］。本研究结果显示：模型组Caspase-9 mRNA转录水平与软骨细胞凋亡率较空白组明显升高，但Caspase-3 mRNA的转录水平未见到明显改变。考虑可能是造模方法、整体周期等实验设计与既往研究^［28-29］不同，激活的内源性凋亡途径不同所致。既往研究自开始建立KOA模型至干预结束，历时8周及以上，为KOA中期软骨退变模型。而本研究的实验周期较短，采用动物生存质量较高的木瓜蛋白酶注射法而非手术法或关节制动法建立KOA模型，且药液注射完毕至干预结束仅历时4周，KOA尚处于早期阶段^［30］。MACFARLANE等^［31］发现，启动子Caspase-9和执行者Caspase-7、Caspase-3的激活，具有明显的时间顺序，说明不同凋亡执行者发挥效应的时间也可能不同，其中启动子Caspase-9的激活是启动内源性凋亡途径的关键^［32］。本研究结果显示：温针灸组Caspase-9 mRNA转录水平与软骨细胞凋亡率较模型组显著下降，说明温针灸干预可通过降低启动子Caspase-9 mRNA的转录水平，抑制内源性凋亡途径激活，从而降低软骨细胞凋亡率。

综上所述，温针灸能有效保护膝关节功能，抑制软骨细胞的凋亡，治疗早期KOA，这可能与其降低内源性凋亡信号关键启动子Caspase-9 mRNA的转录水平，进而抑制Caspase-3以外的执行者参与的内源性凋亡途径，发挥其在软骨细胞稳态中的抗凋亡功能有关^［33］。但不同KOA病程中激活的凋亡通路可能不同，考虑在后续研究中添加不同造模周期的KOA模型大鼠，观察Caspase级联系统在软骨细胞凋亡过程中发挥的作用，对温针灸在不同时间段调控软骨细胞凋亡的作用机制做进一步研究。

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基金资助

福建省卫健委中青年骨干人才项目(2020GGA056)

福建医科大学附属第二医院博士启动基金(BS202005)