基于网络药理学及分子对接技术探讨陈皮-半夏治疗慢性萎缩性胃炎的作用机制

摘要

目的 运用网络药理学及分子对接技术探讨陈皮-半夏治疗慢性萎缩性胃炎（CAG）的潜在作用机制。 方法 利用TCMSP平台筛选陈皮-半夏的有效成分及药物靶点，并利用Cytoscape 3.9.1软件构建中药-有效成分-药物靶点可视化网络；通过GeneGards、OMIM数据库筛选CAG疾病靶点，与药物靶点绘制韦恩图，获取陈皮-半夏与CAG的交集靶点；在STRING数据库中构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，根据度中心性（DC）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC）结果筛选出核心靶点；通过Metascape数据库对交集靶点进行GO生物功能分析及KEGG通路富集分析；运用Cytoscape 3.9.1软件构建有效成分-交集靶点-信号通路-CAG网络并筛选出关键有效成分；最后选取关键有效成分与核心靶点在DockThor网站中进行分子对接，验证其结合的稳定性。 结果 获取陈皮-半夏有效成分18个，药物靶点126个，CAG疾病靶点892个，交集靶点39个；柚皮素、川陈皮素、黄芩素、β-谷甾醇为关键有效成分；Akt1、TP53、Jun、VEGFA等是陈皮-半夏治疗CAG的核心靶点；GO生物功能分析提示陈皮-半夏参与氧化应激反应、对活性氧的反应、分泌颗粒腔、转录因子结合等生物过程，KEGG通路富集分析共获得信号通路146条，包括癌症的途径、脂质与动脉粥样硬化以及IL-17、TNF、MAPK、PI3K-Akt等信号通路；分子对接结果显示关键有效成分与其相关的核心靶点结合能均＜-5 kcal/mol，表明二者结合稳定。 结论 陈皮-半夏药对可能通过柚皮素、川陈皮素、黄芩素、β-谷甾醇等有效成分作用于Akt1、TP53、Jun、VEGFA等核心靶点，涉及或参与癌症的途径、脂质与动脉粥样硬化以及IL-17、TNF、MAPK、PI3K-Akt等信号通路调控细胞凋亡、抑制炎症反应，从而达到治疗CAG的目的。

Graphical abstract

关键词

慢性萎缩性胃炎 / 陈皮 / 半夏 / 网络药理学 / 分子对接 / 作用机制

慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是以胃黏膜固有腺体萎缩为主要病理改变的慢性炎性疾病，被定为胃癌前病变的重要阶段。胃黏膜固有腺体萎缩的程度是CAG癌变风险评估的重要指标^［1］，因此早期发现和治疗CAG是预防胃癌的关键。现代医学主要通过胃镜及病理检查来明确诊断^［2］，以根除幽门螺杆菌等对症治疗为主，远期疗效不佳，对于防治CAG具有一定的局限性。中医基于整体观念、辨证论治的理论体系，在早期逆转或延缓CAG病变发展具有独特的优势^［3］，且中药不良反应小，能通过调控多条信号通路发挥治疗作用^［4］。

中医认为CAG病位在胃，以脾虚为本。若脾运化失司，津液输布失常，则可致痰湿内生。陈皮-半夏性温，共归脾、肺经，是临床常用的理气健脾、燥湿化痰药对，在CAG治疗中被广泛运用并取得良好疗效。近年来药理学研究发现陈皮-半夏药对具有抗炎、抑菌等作用，能有效改善细胞氧化损伤，促进胃肠蠕动和胃黏膜的修复^［5-6］，延缓CAG进展。然而，陈皮-半夏治疗CAG的潜在分子机制还需进一步研究。

网络药理学是以系统生物学理论为基础，对生物系统进行网络分析，揭示药物治疗疾病的作用机制^［7-8］，故本研究采用网络药理学的方法探讨陈皮-半夏治疗CAG的潜在作用机制，并选取关键有效成分与核心靶点进行分子对接，为后续相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 陈皮-半夏有效成分、药物靶点的筛选及其网络的构建

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索陈皮、半夏的化学成分，并设置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性指数（drug like index，DL）≥0.18为标准，筛选出陈皮、半夏的有效成分及药物靶点。将药物靶点导入Uniprot（https：//www.uniprot.org/）数据库中进行基因名转化，删除无对应基因名称的靶点。将陈皮-半夏有效成分、药物靶点等信息经整合后导入Cytoscape 3.9.1软件中构建中药-有效成分-药物靶点可视化网络。

1.2 CAG疾病靶点及交集靶点获取

在GeneCards（http：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）数据库中以“chronic atrophic gastritis”为关键词检索CAG疾病靶点，将2个数据库搜集的疾病靶点进行整合，剔除重复。将药物靶点与CAG疾病靶点导入Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）在线工具中绘制韦恩图，获得陈皮-半夏药物靶点与CAG疾病靶点的交集靶点，即为陈皮-半夏治疗CAG的潜在作用靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建及核心靶点筛选

将交集靶点导入STRING（https：//cn.string-db.org/）数据库中，物种分类选择“Homo sapiens”，设置“highest confidence（0.9）”筛选分析结果^［9］。获得PPI网络。下载文件并导入Cytoscape 3.9.1软件中进行拓扑分析，分别将度中心性（DC）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC）的结果按降序排列，筛选出三者均排名前10的核心靶点。

1.4 GO生物功能与KEGG通路富集分析

在Metascape（https：//metascape.org/）数据库中进行GO生物功能分析与KEGG通路富集分析，物种分类选择“H.sapiens”，下载分析结果。运用微生信网站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）绘制GO生物功能分析条形图与KEGG通路富集分析气泡图。

1.5 有效成分-交集靶点-信号通路-CAG网络的构建和关键有效成分筛选

将有效成分、交集靶点、信号通路等信息导入Cytoscape 3.9.1软件中绘制有效成分-交集靶点-信号通路-CAG网络图，并进行拓扑分析，将分析结果按DC值降序排列，筛选出排名靠前的4个关键有效成分。

1.6 分子对接分析

选取PPI网络拓扑分析结果中DC排名前5的核心靶点输入RSCB PDB（http：//www.rcsb.org/）数据库中，物种分类选择“Homo sapiens”，分辨率选择“Best to worst”，筛选出合适的蛋白结构并下载文件。在Pub Chem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中下载关键有效成分的3D分子结构文件。将2个结构文件导入DockThor（https：//dockthor.lncc.br）平台中进行分子对接，计算分子对接的结合能^［10］。在Autodock Tools 1.5.7软件中对受体、配体进行去水、加全氢等处理后，将对接结果导出为PDBQT格式，通过Open Babel软件转化为PDB格式后，导入PyMol软件中进行对接结果可视化分析。

2 结　果

2.1 陈皮-半夏有效成分、药物靶点的筛选及其网络的构建

从TCMSP数据库中共筛选出陈皮-半夏有效成分18个，其中陈皮5个，半夏13个。将18个有效成分进行药物靶点筛选，发现半夏中的有效成分12，13-环氧-9-羟基十九碳-7，10-二烯酸无对应的药物靶点，故剔除，通过Uniprot数据库进行基因名转化，剔除无对应基因名及重复靶点后共获得126个药物靶点，陈皮-半夏有效成分及药物靶点数见表1。

将陈皮-半夏有效成分及药物靶点信息转换成Network和Type文件后导入Cytoscape 3.9.1软件构建中药-有效成分-药物靶点可视化网络图，见图1。图中“节点”共包含145个，分别表示中药名、有效成分及药物靶点；“边”共有268条，表示三者之间的相互关系。

2.2 CAG疾病靶点及与陈皮-半夏药物靶点交集靶点获取

在GeneCards、OMIM 2个数据库中检索CAG的疾病靶点，通过整合、剔除重复后，共获得CAG疾病靶点892个，绘制疾病靶点与药物靶点的韦恩图，见图2。图中显示陈皮-半夏药物靶点与CAG交集靶点共39个。

2.3 PPI网络的构建与分析

将39个交集靶点输入STRING数据库中，构建PPI网络，隐藏1个与其他节点无任何相互作用的离散节点毒蕈碱型胆碱受体M3（CHRM3），可见38个节点，共产生411条相互作用的连线，如图3所示。下载PPI网络相关数据文件，将文件导入Cytoscape 3.9.1软件中，选择“Analysis Network”进行拓扑分析，筛选出DC、BC、CC排名均为前10位的核心靶点共9个，包括丝氨酸/苏氨酸激酶1（Akt1）、肿瘤抗原p53（TP53）、激活子蛋白-1（Jun）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、低氧诱导因子-1α（HIF-1α）、胱天蛋白酶3（CASP3）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3），见表2。

2.4 GO生物功能分析与KEGG通路富集分析

将相互连接的交集靶点导入Metascape数据库中进行GO生物功能分析与KEGG通路富集分析。GO生物功能分析共获得富集条目902条（P＜0.05），其中包括生物学过程（BP）795条、细胞组分（CC）38条、分子功能（MF）69条。将各分析结果中的P值按升序排列，P值越小代表富集越显著。选取BP、CC、MF中P值排名前10的富集条目，绘制GO生物功能分析条形图，见图4。图4中纵坐标代表BP、CC、MF排名前10的富集条目，横坐标代表每个条目富集的基因数。进一步分析可知：BP主要涉及氧化应激反应、对活性氧的反应、激素的反应、细胞对化学应激的反应等；CC主要涉及分泌颗粒腔、囊泡腔等；MF主要涉及转录因子结合、DNA-结合转录因子结合、转录协同调节因子结合等。

KEGG通路富集分析表明陈皮-半夏治疗CAG的机制主要涉及146条信号通路（P＜0.05），主要包括癌症的途径、脂质与动脉粥样硬化、IL-17信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等，表明陈皮-半夏治疗CAG是通过调控多条信号通路发挥作用。选取富集结果中P值较小且富集基因数最多的前30条信号通路绘制KEGG通路富集分析气泡图，见图5。

2.5 有效成分-交集靶点-信号通路-CAG网络的构建

将陈皮-半夏治疗CAG的排名前20的信号通路和其信号通路相关的有效成分、交集靶点等信息导入Cytoscape 3.9.1软件中，构建有效成分-交集靶点-信号通路-CAG网络图，探究其有效成分、交集靶点和信号通路之间相互作用关系，见图6。图6所示：网络中共有76个节点，共产生395条相互作用的连线；与20条信号通路相关的有效成分15个，其中陈皮5个、半夏10个，交集靶点38个；节点的平均连接性为10.368，网络中心性为0.228。拓扑分析结果显示DC排名前4的关键有效成分为柚皮素、川陈皮素、黄芩素、β-谷甾醇，表明陈皮-半夏中上述4个关键有效成分与Akt1、TP53、Jun、VEGFA等核心靶点之间通过多次相互作用于多条信号通路来达到治疗CAG的目的。

2.6 分子对接分析

选取DC排名前5的核心靶点（Akt1、TP53、Jun、VEGFA、PTGS2）与互作的关键有效成分。通过DockThor平台进行分子对接分析，获得分子结合能数值，见表3。分子结合能数值越小表示该分子结构构象越稳定，配体与受体之间的亲和力越好，结合程度越紧密，相互作用的可能性越高。结合能＜0 kcal/mol表示配体与受体之间能够自发结合；结合能＜-5 kcal/mol表示配体与受体结合稳定^［11］。分子对接结果显示：关键有效成分与其相关的核心靶点结合能均＜-5 kcal/mol，其中黄芩素与VEGFA结合能最小，表明其分子结构构象最稳定。见图7。

3 讨　论

CAG是correa模式（正常胃黏膜-慢性炎症-萎缩性胃炎-肠化生-胃癌前病变-胃癌）演变进程的关键环节^［12］，根除病因缓解胃黏膜炎症损伤是逆转CAG癌变的重要治疗措施。中医学认为CAG的病机以脾虚为本，痰、湿、气滞、血瘀等为标^［13］。痰由湿转化而来，是CAG发展到胃癌前病变重要的病理产物^［14］。《医宗必读》云：“脾土虚弱，清者难升，浊者难降，留中滞膈，凝聚为痰。”^［15］脾为气血化生之源，脾气转输布散精微于全身，若平素脾胃气虚，脾气转输津液失常，则湿浊内生，湿聚成痰，痰凝日久化瘀，损伤胃络，加快CAG向胃癌前病变转化的进程。陈皮-半夏是临床上常用于理气健脾、燥湿化痰的代表药对，在治疗CAG中具有重要作用。

本研究通过对有效成分-交集靶点-信号通路-CAG网络图的可视化分析，获得陈皮-半夏治疗CAG关键有效成分为柚皮素、黄芩素、β-谷甾醇、川陈皮素。其中柚皮素、黄芩素、川陈皮素均属于黄酮类化合物，具有抗癌、抑菌、抗炎、抗氧化等作用。据报道，柚皮素具有抗炎活性，通过抑制iNOS等促炎标志物，减轻CAG胃黏膜炎症反应，促进胃黏膜的修复^［16］；另外，柚皮素还能够抑制癌细胞对药物的耐药性，并通过下调MMP2、MMP9的表达抑制人胃癌细胞的生长，诱导癌细胞凋亡^［17］。黄芩素通过抑制NF-κB活化减少炎症因子的释放，缓解胃黏膜炎症损伤，阻断CAG的进一步发展^［18］，亦可下调p-PI3K和p-Akt蛋白表达从而抑制人胃癌细胞增殖、迁移，诱导细胞自噬^［19］。β-谷甾醇属于植物甾醇^［20］，具有止咳、祛痰及抑制肿瘤的作用，能够抑制巨噬细胞分泌炎症因子^［21］，减轻炎症反应，促进胃黏膜组织的修复。近年来体外研究实验发现，川陈皮素能够抑制人胃癌（SGC-7901）细胞中STAT3通路的表达，进而降低人胃癌细胞的侵袭能力，达到抗癌的治疗作用^［22］。综上，表明陈皮-半夏中关键有效成分可能通过化痰、抗炎、抑菌、抗氧化、促进胃黏膜修复等作用达到治疗CAG的目的。

通过对PPI网络拓扑分析，获得综合排名较前的核心靶点有Akt1、TP53、VEGFA、Jun等。这些核心靶点都是由多成分共同作用，表明中医药多成分、多靶点相互作用的特点。Akt1通常由PI3K激活，参与调节细胞增殖、凋亡等生物过程^［22］。P53是TP53基因编码的一种分子量为53 kDa的蛋白质，人类癌症中主要的遗传改变就是p53发生突变，p53突变后空间构象发生改变，自身的抑癌作用会转变为促癌作用，刺激VEGF中肿瘤血管的生成。VEGFA是一种促血管内皮细胞生长因子，促进血管内皮细胞增殖、细胞新生等作用^［23］。相关研究发现，VEGFA在正常组织内以低水平表达，在胃癌组织中以高水平表达^［24］，其表达程度与肿瘤的分期密切相关，VEGFA表达越高，说明肿瘤临床分期越差^［25］。C-jun是Jun家族中活性最强的转录激活因子。有研究发现，C-jun过量表达会引起胃黏膜上皮细胞过度增殖、凋亡，加快CAG向胃癌的转变^［26］。

GO生物功能分析结果显示，陈皮-半夏治疗CAG的潜在作用靶点参与的生物学过程主要涉及对活性氧的反应、激素的反应、细胞对化学应激的反应等。KEGG通路富集分析结果表明陈皮-半夏治疗CAG主要通过调控癌症的途径、脂质与动脉粥样硬化以及IL-17、TNF、MAPK、PI3K-Akt等多条信号通路发挥作用。研究表明，IL-17表达增强时激活NF-κB信号通路，诱导下游炎症因子的产生，加重CAG的进展^［27］。肿瘤坏死因子TNF，诱导细胞增殖、促进原癌基因表达^［28］。MAPK受到激素、神经递质等不同的细胞外刺激后被激活，参与氧化应激，细胞的增殖、迁移、浸润等病理、生理过程。研究表明，在CAG向胃癌发展进程中p-PI3K和p-Akt的表达也会逐渐升高，PI3K-Akt信号通路过度激活上调NF-κB等促炎因子的表达并诱导癌细胞的增殖，促进凋亡蛋白与伴侣蛋白结合，进而抑制异常细胞凋亡^［29］，促进胃癌的发展。分子对接结果显示陈皮-半夏关键有效成分与其相关的核心靶点结合稳定，有较好的结合活性。证实了陈皮-半夏治疗CAG的有效性。

本研究发现了陈皮-半夏可能通过柚皮素、川陈皮素、黄芩素、β-谷甾醇等有效成分作用于Akt1、TP53、Jun、VEGFA等核心靶点，或参与调控癌症的途径、脂质与动脉粥样硬化、IL-17、TNF、MAPK、PI3K-Akt、HIF-1等多条信号通路，起到抗炎、抑菌、减少细胞氧化损伤、促进胃肠蠕动和胃黏膜修复的作用，达到治疗CAG的目的。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2021J01929)