基于PI3K/Akt通路探讨健脾清化散瘀饮抑制IGF-1诱导GES-1细胞增殖

摘要

目的 基于PI3K/Akt通路探讨健脾清化散瘀饮对胰岛素样生长因子1（IGF-1）诱导人胃黏膜上皮细胞株GES-1细胞增殖的影响。 方法 将GES-1细胞分为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。模型组和低、中、高剂量组给予2.5 ng/mL IGF-1溶液刺激，在此基础上低、中、高剂量组分别给予25、50、100 μg/mL健脾清化散瘀饮药液干预，对照组给予0.5 μL无菌水干预，分别干预24 h。采用CCK-8检测细胞活力；采用集落形成实验检测细胞存活能力；采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况；Western blot检测细胞磷脂酰肌醇激酶3（PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt蛋白表达量。 结果 与对照组比较，模型组细胞活力和集落形成存活率明显提高（P＜0.05），细胞凋亡率明显降低（P＜0.05），p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt均明显提高（P＜0.05）。与模型组比较，高剂量组细胞活力和集落形成存活率明显降低（P＜0.05），细胞凋亡率明显提高（P＜0.05），p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt均明显降低（P＜0.05）；中剂量组细胞凋亡率明显提高（P＜0.05），p-Akt/Akt明显降低（P＜0.05）。 结论 健脾清化散瘀饮能改善由IGF-1诱导的GES-1细胞异常增殖，其机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路活化有关。

Graphical abstract

关键词

隆起糜烂性胃炎 / 健脾清化散瘀饮 / 胃黏膜上皮细胞 / 增殖 / 凋亡 / PI3K/Akt信号通路

隆起糜烂性胃炎（raised erosive gastritis，REG）是临床常见慢性胃炎之一，以胃黏膜上皮细胞增殖为主要特征，临床以中上腹部胀痛感、烧灼感以及嗳气为主症，少数会继发上消化道出血，出现贫血或者低蛋白血症等^［1-2］。西医临床常规治疗主要包括抗幽门螺杆菌、抑酸及保护胃黏膜、内镜下治疗等^［3-5］，但仍有复发率高、内镜下治疗存在创面大、易出血等问题^［6］。中医学认为脾虚、湿热、血瘀在REG的发病中占有重要地位，治宜健脾清热、化湿散瘀，前期研究证实健脾清化散瘀饮可明显缓解脾虚湿热血瘀型REG患者胃脘痛、胀满、厌食、嗳气等症状，胃镜下观察到胃黏膜上的单个或多个疣状、膨大皱襞状或丘疹样隆起，黏膜缺损或脐样凹陷，中央糜烂也得到显著减小（少）或消退^［7］，但其作用机制尚未完全阐明。已有研究证实磷脂酰肌醇激酶3/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路对REG胃黏膜细胞的异常增殖具有重要调控作用^［8］。因此，本研究拟采用Akt激活剂胰岛素样生长因子1（IGF-1）诱导人胃黏膜上皮细胞株GES-1构建REG细胞模型，基于PI3K/Akt通路探讨健脾清化散瘀饮对细胞增殖的影响，以期为临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验细胞

正常人胃黏膜上皮细胞株GES-1细胞购买自中国科学院上海细胞生物所。

1.2 实验药物

健脾清化散瘀饮药物组成：党参15 g，茵陈9 g，鳖甲18 g，白术9 g，扁豆15 g，茯苓15 g，陈皮9 g，半夏9 g，厚朴9 g，黄连3 g，莪术9 g，丹参 15 g，砂仁6 g，炙甘草3 g，由福建中医药大学附属第二人民医院制成复方颗粒剂。加无菌水将复方颗粒配制成浓度为10 mg/mL健脾清化散瘀饮药液，30 min超声溶解，高压灭菌后分装于1.5 mL EP管，置于4 ℃冰箱备用。将IGF-1粉末溶解于无菌水配制成10 mg/mL IGF-1溶液，保存至-80 ℃冰箱。

1.3 实验试剂

Western及IP细胞裂解液（批号：P0013）、ECL发光试剂盒（批号：P0018）、PMSF（批号：P0100）均购自碧云天生物技术有限公司；PhosSTOP^TM（德国Roche公司，批号：4906837001）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：23225）；PVDF膜（德国Millipore公司，批号：ISEQ 00010）；IGF-1（中国赛业生物科技公司，批号：HEGFP-09013）；p-PI3K抗体（批号：4228）、PI3K抗体（批号：4257）、p-Akt抗体（批号：4060）、Akt抗体（批号：4691）均购自美国Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗体（中国亚科因生物技术有限公司，批号：ABL1021）；兔二抗（美国Singnalway Antibody公司，批号：L3012）；Annexin V-AbFluor™ 488/PI凋亡检测试剂盒（中国亚科因生物技术有限公司，批号：KTA0002）。

1.4 实验仪器

电泳仪、转膜仪、化学成像系统（美国Bio-Rad公司）：倒置显微镜（德国Leica公司）；Multi-skan FC多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；流式细胞仪（美国BD公司，型号：FACSCelesta）。

2 实验方法

2.1 细胞培养

将GES-1细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，放置于5% CO₂、37 ℃细胞培养箱进行培养，细胞长满培养皿底部后，用0.25%胰蛋白酶进行消化传代，选择对数生长期细胞并分别按一定的密度接种到相应的细胞培养板中。

2.2 分组与干预

将对数生长期GES-1细胞分为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。模型组和低、中、高剂量组给予2.5 ng/mL IGF-1溶液刺激，在此基础上低、中、高剂量组分别给予25、50、100 μg/mL健脾清化散瘀饮溶液干预，对照组给予0.5 μL无菌水干预，干预24 h进行后续实验操作。

2.3 CCK-8检测细胞的活力

干预结束后向每孔加入10 μL CCK-8试剂，置于5% CO₂、37 ℃细胞培养箱中孵育2 h，孵育结束后，应用酶标仪在波长450 nm处测定吸光度（OD）值，根据检测得出的吸光度值进行增殖曲线的绘制。

细胞活力＝实验组OD值/对照组OD值×100%

2.4 集落形成实验检测细胞存活能力

干预结束后收集5组细胞并进行计数，随后按0.5×10³个/孔将细胞重新接种到12孔板中继续培养8 d，2～3 d更换新鲜DMEM培养基。培养结束后，PBS溶液清洗3次，加入４%多聚甲醛固定15 min，固定结束后PBS溶液清洗3次，结晶紫染色15 min，结束后用PBS溶液清洗3次，倒扣放置晾干后进行拍照。计算每组的细胞所形成的集落数量后，以对照组细胞存活率为100%为基准计算每组的细胞存活率。

细胞存活率＝\frac{\mathrm{实验}\mathrm{组集}\mathrm{落数}\mathrm{量}}{\mathrm{对照}\mathrm{组集}\mathrm{落数}\mathrm{量}}×100%

2.5 Annexin V/PI染色和流式细胞仪检测细胞凋亡情况

干预结束后收集细胞于流式管中，用提前预冷的PBS溶液清洗1次，每管加入100 μL 1×Assay Buffer进行重悬，后加入5 μL Annexin V-APC及2 μL PI，室温避光孵育15 min，最后每管添加400 μL 1×Assay Buffer混匀，通过流式细胞仪对细胞的凋亡情况进行检测，计算凋亡率。

2.6 Western blot检测PI3K/Akt通路相关蛋白表达量

干预结束后收集细胞，应用细胞裂解液提取总蛋白，采用BCA法检测蛋白质含量。经过蛋白变性、凝胶电泳、转膜后封闭1 h，TBST溶液洗膜，置于PI3K（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）一抗中，4 ℃摇床孵育过夜。TBST溶液洗膜，置于对应的辣根过氧化物酶标记的兔/鼠二抗（1∶5 000）中孵育1 h，TBST溶液洗膜，滴加ECL发光液，应用凝胶成像系统进行扫描成像，采用ImageJ软件进行定量分析，每组实验重复3次。

2.7 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐则采用Games-Howell检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 5组细胞活力比较

与对照组比较，模型组细胞活力明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，高剂量组细胞活力明显降低（P＜0.05）。见图1。

3.2 5组细胞集落形成情况

与对照组比较，模型组细胞存活率明显提高（P＜0.05）；与模型组比较，高剂量组细胞存活率明显降低（P＜0.05）。见图2、图3。

3.3 5组细胞凋亡情况比较

与对照组比较，模型组细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，中、高剂量组细胞凋亡率明显提高（P＜0.05）。见图4、图5。

3.4 5组细胞PI3K/Akt通路相关蛋白表达量比较

与对照组比较，模型组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均明显提高（P＜0.05）；与模型组比较，中、高剂量组p-Akt/Akt明显降低（P＜0.05），高剂量组p-PI3K/PI3K明显降低（P＜0.05）。见表1、图6。

4 讨　论

REG属于中医学“胃脘痛”“嘈杂”“痞满”等范畴，以脾虚湿热血瘀证最为常见，多与气滞、湿、热、血瘀、气虚等因素有关^［9］。健脾清化散瘀饮中党参补益脾气、健运中焦；茵陈清化郁积之湿热，荡涤湿浊；鳖甲破血化积、软坚散结，共为君药；白术、扁豆、茯苓健运脾气、淡渗利湿；陈皮、半夏、厚朴辛开苦降，具有行气开滞、化痰燥湿之效；黄连苦寒助茵陈清中焦湿热；莪术、丹参活血养血，助鳖甲散瘀血痞结，共为臣药；砂仁健脾芳化；甘草清热健中，调和诸药，共为佐药。诸药合用，共奏健脾益气、清化湿热、软坚散结、活血化瘀之功。全方寒热并用，攻补兼施，使脾气得健，郁热得清，湿浊得化，痰气瘀血得散，则病得痊愈^［10］。

PI3K/Akt通路可以调节细胞内许多正常的细胞活动，与细胞增殖关系密切^［11］。PI3K磷酸化激活后可以生成3，4二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2），产生3，4，5二磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）^［12］。PIP2、PIP3与Akt结合后，Akt蛋白的苏氨酸磷酸化位点（Thr308）和丝氨酸磷酸化位点（Ser473）发生磷酸化而将其激活^［13-15］。激活后的PI3K/Akt信号通路进一步激活下游相关靶蛋白，发挥调控细胞增殖、凋亡等重要作用^［16］。前期研究发现 REG 患者PI3K/Akt信号通路显著活化，导致胃黏膜组织细胞处于高度异常增殖状态，出现上皮、胃小凹增生，腺颈部延长，纤维组织增生，部分再生腺管伴有不同程度的异型增生和或肠上皮化生，黏膜肌层过度增生^［17-18］；而抑制PI3K/Akt通路活化可调控REG胃黏膜细胞增殖和细胞周期^［19］。由此可见，胃黏膜组织细胞的异常增殖以及PI3K/Akt信号通路的活化可能与REG的发生、发展有着密不可分的联系。胰岛素样生长因子（IGFs）具有重要的生物学活性，IGF-1主要通过IGF-1R发挥其生物学作用和功能。IGF-1与IGF-1R结合改变a和b亚基的构象，引起激酶的活化，进而激活PI3K/Akt信号通路^［20］。因此，本文采用IGF-1刺激胃黏膜上皮细胞GES-1导致其异常增殖，模拟REG细胞模型。

本研究中结果显示：与对照组比较，模型组细胞活力和集落形成存活率明显提高，细胞凋亡率明显降低，p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt明显升高，提示IGF-1刺激后胃黏膜上皮细胞GES-1出现异常增殖，REG细胞模型构建成功。经健脾清化散瘀饮干预后，细胞活力和集落形成存活率明显降低，细胞凋亡率明显提高，p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt明显降低，提示健脾清化散瘀饮能有效抑制由IGF-1诱导GES-1细胞引起的异常增殖，抑制PI3K/Akt通路的活化。

综上所述，健脾清化散瘀饮可明显抑制GES-1细胞经IGF-1诱导后的细胞增殖，促进异常增殖的细胞产生凋亡，其机制可能通过抑制PI3K/Akt信号通路来实现。

参考文献

[1] 付唆林，吴云林. 疣状胃炎的历史、现状与思考［J］. 国外医学（消化系疾病分册），2005，25（3）：155-157.

[2] 柯晓，黄泽辉，方文怡，等. 福州地区隆起糜烂性胃炎病理分类和中医临床证候学的研究［J］. 中国中西医结合消化杂志，2010，18（5）：306-311.

[3] 谢志练. 三联疗法联合施维舒治疗慢性糜烂性胃炎的临床分析［J］. 中外医疗，2012，31（27）：23-24.

[4] 全红梅. 胃黏膜保护剂替普瑞酮对疣状胃炎疗效的观察［J］. 临床医药文献电子杂志，2017，4（85）：16708.

[5] 耿云瑶. 80例疣状胃炎内镜下微波治疗的临床疗效分析［J］. 中国医药指南，2017，15（1）：40-41.

[6] 付志昊，王秀娟. 疣状胃炎中西医研究进展［J］. 河北中医，2017，39（12）：1900-1903.

[7] 林燕玉，柯晓，方文怡，等. 健脾清化散瘀饮治疗隆起糜烂性胃炎的疗效观察［J］. 中国中西医结合消化杂志，2013，21（12）：621-625.

[8] 赵晓倩，张庆瑜. PTEN和p-Akt在疣状胃炎中的表达及其意义［J］. 中外医疗，2018，37（4）：31-33.

[9] 冯其海. 疣状胃炎中医辨证分型文献分析［J］. 浙江中医杂志，2008，43（4）：198-199.

[10] 毛欣欣. 健脾清化散瘀饮对隆起糜烂性胃炎患者表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的影响［D］. 福州：福建中医药大学，2014：18-19.

[11] GOU W F， SHEN D F， YANG X F，et al. ING5 suppresses proliferation，apoptosis，migration and invasion，and induces autophagy and differentiation of gastric cancer cells：a good marker for carcinogenesis and subsequent progression ［J］. Oncotarget，2015，6（23）：19552-19579.

[12] FATTAHI S， AMJADI-MOHEB F， TABARIPOUR R，et al. PI3K/Akt/mTOR signaling in gastric cancer：epigenetics and beyond ［J］. Life Sci，2020，262：118513.

[13] KEREMU A， MAIMAITI X， AIMAITI A，et al. NRSN2 promotes osteosarcoma cell proliferation and growth through PI3K/Akt/MTOR and Wnt/β-catenin signaling ［J］. Am J Cancer Res，2017，7（3）：565-573.

[14] FU Y L， ZHANG Q H， WANG X W，et al. Antidiabetic drug metformin mitigates ovarian cancer SKOV3 cell growth by triggering G2/M cell cycle arrest and inhibition of m-TOR/PI3K/Akt signaling pathway ［J］. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21（5）：1169-1175.

[15] 郭雪峰. 基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死临床与实验研究［D］. 沈阳：辽宁中医药大学，2021：89-90.

[16] YU J S L， CUI W. Proliferation，survival and metabolism：the role of PI3K/Akt/mTOR signalling in pluripotency and cell fate determination ［J］. Development，2016，143（17）：3050-3060.

[17] 方文怡，高尤亮，毛欣欣，等. 健脾清化散瘀饮对脾虚湿热血瘀型隆起糜烂性胃炎患者EGF、bFGF、Ki67表达的影响［J］. 福建中医药，2017，48（5）：6-8.

[18] 赵培琳. 健脾清化散瘀饮对隆起糜烂性胃炎患者Bax、Bcl-2表达的影响［D］. 福州：福建中医药大学，2016：11-12.

[19] 陈波. 健脾清化散瘀饮对隆起糜烂性胃炎患者CyclinD1、CDK4、P21表达的影响［D］. 福州：福建中医药大学，2018：12-14.

[20] CHAI H， PENG W Y， ZHU Z Q，et al. Effects of propofol on IGF-1 activity and cell behaviour in the GES 1 mucosal cell model ［J］. Growth Factors，2023，41（1）：32-42.

基金资助

国家自然科学基金项目(81973621)

国家自然科学基金项目(82274188)