金线莲多糖体外抗氧化活性及其对D-半乳糖诱导肝脏损伤小鼠的保护作用

摘要

目的 评价金线莲多糖（ARP）及其近缘品台湾银线兰多糖（AFP）、血叶兰多糖（LDP）的体外抗氧化活性，初步探讨金线莲多糖对D-半乳糖诱导肝脏损伤小鼠的保护作用。 方法 ① 体外实验：以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）和超氧阴离子（•O^2-）自由基清除率为指标，以抗环血酸（VC）为阳性对照，评价ARP、AFP、LDP的体外抗氧化活性。② 体内实验：将60只ICR雄性小鼠随机分为正常组、模型组、阳性组、低剂量组、中剂量组和高剂量组各10只。除正常组外其余5组每日按200 mg/kg颈背部皮下注射D-半乳糖溶液，正常组每日颈背部皮下注射同剂量生理盐水；阳性组按100 mg/（kg∙d）予维生素C药液灌胃，低、中、高剂量组分别按250、500、1 000 mg/（kg∙d）予金线莲多糖药液灌胃，正常组及模型组按20 mL/（kg∙d）予生理盐水灌胃，连续干预42 d。ELISA测定小鼠肝组织丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量。 结果 ① 体外实验：与VC比较，除3.0 mg/mL ARP外，各浓度ARP、AFP、LDP DPPH、ABTS、•O^2-自由基清除率均明显降低（P＜0.05）；与ARP比较，除0.5 mg/mL AFP外，各浓度AFP、LDP DPPH、ABTS、•O^2-自由基清除率均明显降低（P＜0.05）。② 体内实验：与正常组比较，模型组ALT、AST、MDA含量均明显升高（P＜0.05），GSH-Px、T-SOD含量均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组ALT、AST、MDA含量均明显降低（P＜0.05），GSH-Px、T-SOD含量均明显升高（P＜0.05）。 结论 ARP体外抗氧化活性优于AFP和LDP，且ARP能通过调节肝脏氧化应激水平缓解D-半乳糖诱导氧化应激小鼠的肝脏氧化损伤。

关键词

肝氧化损伤 / 金线莲多糖 / 抗氧化 / 氧化应激 / D-半乳糖

中医药有着独特的临床疗效和理论体系，目前越来越多的人偏向中医药治疗，中药提取物、中药复方等已作为治疗肝损伤疾病的补充剂和替代剂^［1-2］。金线莲为兰科植物花叶开唇兰Anoectochilus roxburghii （Wall.） Lindl.的新鲜或干燥全草，为闽产特色药材，临床主要用于治疗肝炎、小儿发热等病症，多糖为其主要活性成分群^［3-4］。随着金线莲的经济价值和药用价值不断被发掘，国内外对其需求量也随之增加，不法商家为谋取非法暴利，常掺杂性状较为相似的金线莲同属不同种植物台湾银线兰Anoectochilus formosanus、同科不同属植物血叶兰Ludisia discolor等近缘品，影响用药安全与有效性。既往研究表明金线莲多糖具有1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、超氧阴离子（•O^2-）自由基、羟基自由基等清除能力^［5-7］，但对于金线莲多糖（ARP）、台湾银线兰多糖（AFP）及血叶兰多糖（LDP）体外抗氧化活性的对比研究较为少见。研究表明金线莲多糖能通过提高抗氧化酶活性，抑制肝丙二醛（MDA）的形成等途径发挥抗氧化、抗炎等药理活性，缓解肝损伤所引发的氧化应激反应^［8-10］。而台湾银线兰虽有研究报道其具有一定肝保护作用^［11］，但还不明确其用于治疗肝脏疾病的活性成分。相关研究未发现血叶兰具有明显的保肝作用^［12］。

本研究以2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、DPPH和•O^2-自由基清除能力为指标^［13-14］，评价ARP、AFP和LDP的体外抗氧化活性，并探讨ARP对D-半乳糖诱导的小鼠肝脏氧化损伤模型的保护作用，为治疗肝脏疾病提供新思路，为金线莲药用价值进一步开发提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

6～8周SPF级ICR雄性小鼠60只，体质量（22±2）g，购自杭州医学院实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002。动物饲养于福建中医药大学SPF级动物房内，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2020-0002。动物房温度21～23 ℃，相对湿度65%～70%，12 h循环光照环境下，自由饮水进食，适应性喂养7 d后用于实验。本实验经福建中医药大学动物伦理委员会批准（FJTCM IACUC 2023025）。

1.2 实验仪器

旋转蒸发仪（上海亚荣仪器有限公司，型号：RE52-A）；多功能酶标仪（瑞士TECAN公司，型号：INFINTE 200 PRO）；低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司，型号：DLSB-5/20）；低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司，型号：SC-04）；十万分之一天平（型号：EX225DZH）、万分之一天平（型号：AR224CN）均购自美国OHAUS公司；超纯水机（美国Millipore公司，型号：MILLI-Q Direct16）；冷冻干燥机（德国CHRIST公司，型号：Alpha 1-4LSCbasic）。

1.3 实验试剂

无水乙醇（中国医药集团有限公司，批号：20191208）；三氯甲烷（批号：190316）、正丁醇（批号：20181127）均购自国药集团化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。DPPH（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C12550546）；ABTS（上海碧云天生物技术股份有限公司，批号：052621211112）；抗坏血酸（VC，广州鼎国生物技术有限公司，批号：8AF10240）；邻苯三酚（批号：T1150）、D-半乳糖（批号：D8310-25G）、Tris-HCl缓冲液（批号：ST1434-25 g）均购自北京索莱宝科技有限公司；丙氨酸转氨酶（ALT）试剂盒（批号：20220311）、天冬氨酸转氨酶（AST）试剂盒（批号：20220312）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒（批号：A001-1）、MDA试剂盒（批号：A003-1）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（批号：A005-1）均购自南京建成生物工程研究。

1.4 实验药物

金线莲和台湾银线兰来源于福建永泰金线莲种植基地，栽培方式为林下种植1个月。血叶兰来源于福建三明。金线莲、台湾银线兰、血叶兰经由福建中医药大学黄泽豪教授分别鉴定为Anoectochilus roburghii、Anoectochilus formosanus、Ludisia discolor的新鲜全草。以上3种全草低温烘干，避光保存。

2 实验方法

2.1 多糖制备

取金线莲、台湾银线兰和血叶兰药材各1 kg，以料液比1∶10加入超纯水，超声提取30 min，超声功率为300 W，重复提取2次，合并提取液，过滤，静置过夜，3 600 r/min离心15 min，取沉淀物，加超纯水复溶。溶液中加入4倍量的Savage试剂（氯仿∶正丁醇＝4∶1）萃取，振摇20 min，4 000 r/min离心5 min，弃去下层溶液，重复3次。上层溶液添加4倍体积无水乙醇，静置过夜，4 000 r/min离心10 min，弃去上清液，得多糖沉淀物。沉淀物加水溶解，经透析、浓缩，冷冻干燥48 h，得ARP、AFP和LDP冻干粉末^［10］。

2.2 ARP、AFP、LDP体外抗氧化活性实验

2.2.1 DPPH自由基清除能力测定

将1.0 mL 0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL的ARP、AFP、LDP、VC水溶液和乙醇溶液分别与1.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液混合，摇匀，避光孵育30 min，应用多功能酶标仪于波长517 nm处测吸光度（OD）值，平行测定3次，计算DPPH自由基清除率^［15］。

DPPH自由基清除率＝（OD₀－OD_i）/OD₀×100%

其中，OD₀为空白吸光度值，OD_i为多糖样品或阳性对照吸光度值。

2.2.2 ABTS自由基清除能力测定

分别取0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL ARP、AFP、LDP和VC水溶液各40 μL于96孔板中，加入970 μL ABTS工作液，混匀，置暗处反应6 min，应用多功能酶标仪于波长734 nm处测定OD值，平行测定3次，计算ABTS自由基清除率^［16］。

ABTS自由基清除率＝（OD₀－OD_i）/OD₀×100%

其中，OD₀为空白吸光度值，OD_i为多糖样品或阳性对照吸光度值。

2.2.3 •O^2-自由基清除能力测定

分别取0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL ARP、AFP、LDP和VC水溶液1.0 mL，加入4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液（pH＝8.2），混匀，25 ℃水浴锅中反应6 min，加入1.0 mL 10 mmol/L 邻苯三酚溶液，25 ℃水浴锅中反应6 min，立即加入1.0 mL 10 mmol/L盐酸终止反应，应用多功能酶标仪于波长320 nm下测定OD值，平行测定3次，计算•O^2-自由基清除率^［17］。

•O^2-自由基清除率＝（OD₀－OD_i）/OD₀×100%

其中，OD₀为空白吸光度值，OD_i为多糖样品或阳性对照吸光度值。

2.3 金线莲多糖体内抗氧化能力评价

2.3.1 分组及干预

60只ICR小鼠随机分为正常组、模型组、阳性组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只。除正常组外，其余5组每日按200 mg/kg颈背部皮下注射D-半乳糖溶液，正常组每日颈背部皮下注射同剂量生理盐水；阳性组按100 mg/（kg∙d）予维生素C药液灌胃，低、中、高剂量组分别按250、500、1 000 mg/（kg∙d）予金线莲多糖药液灌胃，正常组及模型组按20 mL/（kg∙d）予生理盐水灌胃，连续干预42 d。

2.3.2 ELISA测定肝组织肝功能和氧化应激指标

最后1次给药24 h后脱颈椎处死小鼠，迅速取出肝脏，置于冰生理盐水中，洗去血渍，取适量肝组织，按重量（g）∶体积（mL）＝1∶10的比例加入PBS溶液置于研磨仪充分研磨，4 ℃下4 000 r/min离心10 min，取上清液得10%肝组织匀浆，依据试剂盒说明书，检测ALT、AST、GSH-Px、T-SOD和MDA含量。

2.4 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析。计量资料属正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐者两两比较采用LSD-t检验，方差不齐采用Tambane´s T2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 金线莲及其近缘品多糖体外抗氧化结果

3.1.1 不同浓度VC和多糖DPPH自由基清除率比较

与VC比较，除3.0 mg/mL ARP外，各浓度ARP、AFP、LDP DPPH自由基清除率均明显降低（P＜0.05）；与ARP比较，各浓度AFP、LDP DPPH自由基清除率均明显降低（P＜0.05）。见表1。

3.1.2 不同浓度VC和多糖ABTS自由基清除率比较

与VC比较，各浓度ARP、AFP、LDP ABTS自由基清除率均明显降低（P＜0.05）；与ARP比较，各浓度AFP、LDP ABTS自由基清除率均明显降低（P＜0.05）。见表2。

3.1.3 不同浓度VC和多糖•O^2-自由基清除率比较

与VC比较，各浓度ARP、AFP、LDP•O^2-自由基清除率均明显降低（P＜0.05）；与ARP比较，除0.5 mg/mL AFP外，各浓度AFP、LDP•O^2-自由基清除率均明显降低（P＜0.05）。见表3。

3.2 5组肝功能和氧化应激指标比较

与正常组比较，模型组ALT、AST、MDA含量均明显升高（P＜0.05），GSH-Px、T-SOD含量均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组ALT、AST、MDA含量均明显降低（P＜0.05），GSH-Px、T-SOD含量均明显升高（P＜0.05）。见表4。

4 讨　论

关于金线莲及其近缘品多糖体外抗氧化活性比较研究较为少见。本研究结果表明：金线莲及其近缘品的多糖对DPPH、ABTS和•O^2-均具有一定的自由基清除能力，其中3.0 mg/mL ARP对DPPH清除能力最接近于VC的清除能力。与ARP比较，AFP、LDP对ABTS和•O^2-自由基的清除能力较弱。

D-半乳糖会使体内产生大量的自由基，机体无法维持自由基的产生和消除之间的平衡，导致组织器官细胞的过氧化损伤，因此D-半乳糖诱导的氧化应激模型常用于抗氧剂的筛选^［18-20］。VC是一种天然的抗氧化剂，研究表明VC可以通过抑制自由基的形成与累积，调节机体炎性细胞因子的产生，抑制炎性细胞的浸润，从而达到控制炎症的作用^［21-22］。VC通过与自由基反应，影响细胞氧化还原机制，可以缓解因肝损伤导致的AST、ALT水平上升，进而保护肝脏免受氧化损伤^［23-25］，因此选其作为阳性药。ALT、AST是肝细胞损害的敏感指标，其水平能反映肝损伤发生与否^［26］。SOD是平衡机体氧化与抗氧化的关键酶，其含量可间接反映机体清除自由基的能力^［27］；GSH是机体内最重要的非酶性抗氧化物，它可以通过清除自由基来防止氧化损伤，其水平的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素^［28］。MDA是氧化应激的标志物，也是自由基引起的脂质过氧化过程中生成的一种醛类物质，可以反映机体内脂质过氧化程度^［29-30］，肝脏MDA的增加会加剧肝细胞的氧化损伤。

本研究结果显示：模型组T-SOD、GSH-Px的活性与正常组比较明显降低，ALT、AST和MDA含量均明显升高（P＜0.01），提示D-半乳糖引起的氧化应激导致肝脏的氧化损伤；各给药组与模型组比较，T-SOD和GSH-Px活力均明显升高（P＜0.05），ALT、AST和MDA含量均明显降低（P＜0.05），提示金线莲多糖可以通过清除氧自由基来抑制过氧化反应，通过调节肝脏抗氧化酶水平来缓解D-半乳糖诱导氧化应激小鼠的肝损伤。

综上所述，相比于AFP和LDP，ARP更能有效清除DPPH、ABTS和•O^2-自由基，并且ARP对D-半乳糖诱导的小鼠肝脏氧化损伤具有保护作用。ARP具有较强的体内外抗氧化活性，有望成为区分真伪的活性差异成分群。本研究为金线莲多糖药用价值的进一步开发提供科学依据。

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基金资助

福建省卫生健康委员会中药研究项目(2021ZYYJ59)

福建中医药大学校管课题（X2021011-重点）