青娥方对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织PI3K/Akt信号通路的影响

Effect of Qing'e Formula on PI3K/Akt Signaling Pathway in Bone Tissue of Ovariectomized Osteoporosis Rats

摘要

目的 探讨青娥方对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路的影响。 方法 采用随机数字表法将72只3月龄SPF级雌性SD大鼠分为假手术组、模型组和青娥方组，每组24只。大鼠均按40 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉，于下腹部正中作切口，模型组和青娥方组均切除双侧卵巢，假手术组切除卵巢周围少量脂肪组织后立即关腹，缝合伤口。造模1周后，假手术组和模型组予2 mL 0.9%氯化钠溶液灌胃，青娥方组按浸膏量0.42 g/（kg·d）予青娥方药液灌胃，每日1次，连续灌胃12周。3组分别于干预4、8、12周后各处死8只并取材。Masson染色法观察股骨颈形态；检测股骨骨密度和骨生物力学指标最大载荷；ELISA法检测血清PI3K、Akt含量；qPCR和Western blot检测腰椎PI3K、Akt和糖原合成酶激酶3β（GSK3β） mRNA相对表达水平和蛋白表达量。 结果 与假手术组比较，模型组干预第4周腰椎Akt mRNA相对表达水平明显升高（P＜0.05）；第12周股骨最大载荷明显降低（P＜0.05）；第8、12周股骨骨密度明显降低（P＜0.05），腰椎PI3K mRNA相对表达水平均明显升高（P＜0.05），PI3K蛋白表达量明显升高（P＜0.05）；第4、8、12周血清PI3K、Akt含量均明显升高（P＜0.05），腰椎Akt、GSK3β蛋白表达量均明显升高（P＜0.05），GSK3β mRNA相对表达水平明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，青娥方组干预第4周腰椎Akt mRNA相对表达水平和蛋白表达量明显降低（P＜0.05）；第12周股骨最大载荷明显升高（P＜0.05），血清Akt含量均明显降低（P＜0.05），腰椎Akt蛋白表达量明显降低（P＜0.05）；第8、12周股骨骨密度明显升高（P＜0.05），腰椎PI3K、GSK3β mRNA相对表达水平均明显降低（P＜0.05），PI3K蛋白表达量明显降低（P＜0.05）；第4、8、12周血清PI3K含量明显降低（P＜0.05）。 结论 青娥方可改善去卵巢骨质疏松模型大鼠骨密度及骨生物力学性能，其机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of Qing'e formula on the PI3K/Akt signaling pathway in bone tissue of ovariectomized osteoporosis rats. Methods 72 3-month-old SPF grade female SD rats were randomly divided into sham group, model group and Qing'e formula group using a random number table method, with 24 rats in each group. Rats were anesthetized by intraperitoneal injection of 2% pentobarbital sodium solution at a dose of 40 mg/kg, and an incision was made in the middle of the lower abdomen. Both the model and Qing'e formula groups had bilateral ovaries removed, while the sham group had a small amount of adipose tissue around the ovaries removed and immediately closed the abdomen and sutured the wound. After one week of modeling, the sham and model groups were given 2 mL of 0.9% sodium chloride solution by gavage, while the Qing'e formula group was given Qing'e formula solution by gavage at a dose of 0.42 g/(kg·d), once a day for 12 consecutive weeks. After intervention for 4, 8, and 12 weeks, 8 mice were euthanized and samples were taken from each of the 3 groups. The Masson staining method was used to observe the morphology of the femoral neck; femoral bone mineral density and maximum load of the femur were detected; ELISA method was used to detect serum PI3K and Akt level; qPCR and western blot were used to detect the mRNA relative expression level and protein expression of PI3K, Akt, and glycogen synthase kinase 3β (GSK3β) in the lumbar spine. Results Compared with the sham group, the mRNA relative expression level of Akt in the model group significantly increased in the lumbar spine at week 4 of intervention (P<0.05), while the maximum load of the femur significantly decreased in the 12th week (P<0.05); at weeks 8 and 12, the femoral bone mineral density significantly decreased (P<0.05), and the mRNA relative expression level of PI3K in the lumbar spine significantly increased (P<0.05), while the protein expression of PI3K significantly increased (P<0.05); at weeks 4, 8, and 12, the level of serum PI3K and Akt significantly increased (P<0.05), and the protein expression of Akt and GSK3β in the lumbar spine significantly increased (P<0.05), while the mRNA relative expression level of GSK3β significantly increased (P<0.05). Compared with the model group, the mRNA relative expression level and protein expression of Akt in the lumbar vertebrae of the Qing'e formula group significantly decreased at week 4 (P<0.05); at the 12th week, the maximum load of the femur significantly increased (P<0.05), and the level of serum Akt significantly decreased (P<0.05), while the protein expression of Akt in the lumbar spine significantly decreased (P<0.05); at weeks 8 and 12, the femoral bone mineral density significantly increased (P<0.05), and the mRNA relative expression level of PI3K and GSK3β in the lumbar spine significantly decreased (P<0.05), while the protein expression level of PI3K significantly decreased (P<0.05); at weeks 4, 8, and 12, the level of serum PI3K significantly decreased (P<0.05). Conclusion Qing'e formula can improve bone mineral density and biomechanical properties in osteoporosis model rats, and its mechanism may be related to the inhibition of the PI3K/Akt signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

骨质疏松症 / 去卵巢大鼠 / 青娥方 / 骨密度 / 生物力学 / PI3K / Akt

Key words

osteoporosis / ovariectomized rats / Qing'e formula / bone mineral density / biomechanics / PI3K / Akt

骨质疏松症是一种全身性骨病，以低骨量、骨微结构损坏、骨脆性增加为特征^［1］，其致死率、致残率较高，已成为不可忽视的公共卫生问题。预计到2050年，我国骨质疏松症患者将从2019年的6 000万增加到1.2亿以上^［2］，给社会带来严重的医疗和经济负担。骨质疏松症的发病机制主要在于骨形成-骨吸收失衡，而胞内磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路动态维持骨结构的平衡^［3］。本研究采用切除雌性大鼠卵巢的方法建立骨质疏松模型，从骨吸收的角度探讨青娥方对模型大鼠骨组织PI3K/Akt信号通路的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物

3月龄SPF级雌性SD大鼠72只，体质量（213±7）g，由浙江省医学科学院提供，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002，饲养于福建省中医药科学院比较医学中心动物实验室，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2016-0005。动物实验室温度22～24 ℃，湿度40%～70%，光照12 h昼夜循环，自由摄食饮水。本实验通过福建省中医药科学院动物伦理委员会审核批准（FJATCM-IAEC 2021004）。

1.2 实验药物

青娥方药物组成：杜仲（盐炒）16 g，补骨脂（盐炒）8 g，核桃仁（炒）5 g，大蒜4 g，购于漳州片仔癀药业股份有限公司，由福建中医药大学医学实验中心中药制剂室制备。8倍量水浸泡后常规煎煮法煎煮2次，合并煎煮液，旋转蒸发器中蒸发浓缩，在水浴锅上浓缩成膏，1 mg浸膏含5.79 mg生药，4 ℃保存，待用时溶解于0.9%氯化钠溶液制成青娥方药液。

1.3 实验试剂

PI3K ELISA试剂盒（货号：ml003142）、Akt ELISA试剂盒（货号：ml038288）均购自上海酶联生物科技有限公司；qPCR荧光染料（北京全式金生物技术股份有限公司，货号：AQ131-03）；PI3K抗体（货号：20584-1-AP）、Akt抗体（货号：10176-2-AP）、糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）抗体（货号：22104-1-AP）、GAPDH抗体（货号：10494-1-AP）均购自美国Proteintech公司；反转录试剂盒（货号：A5001）、RNA提取试剂盒（货号：LS1040）均购自美国Promega公司。注射用青霉素钾（石药集团中诺药业有限公司）

1.4 实验仪器

双能X线骨密度仪（美国Hologic公司）；万能材料试验机（日本Shimadzu公司）；超纯水装置（美国Milipore公司）；凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；荧光实时定量PCR仪（瑞士Roche公司）；酶标仪（瑞士Tecan公司）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。

2 方　法

2.1 动物分组及造模

选取3月龄健康未孕雌性SD大鼠72只，适应性饲养7 d，采用随机数字表法分为假手术组、模型组和青娥方组，每组24只。大鼠均按40 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉，于下腹部正中作切口，模型组和青娥方组均切除双侧卵巢，假手术组切除卵巢周围少量脂肪组织后立即关腹，缝合伤口。术后连续3 d腹腔注射8万U注射用青霉素钾抗感染，分笼饲养。

2.2 药物干预

造模1周后，假手术组和模型组以2 mL 0.9%氯化钠溶液灌胃，青娥方组按浸膏量0.42 g/（kg·d）予青娥方药液灌胃，每日1次，均连续灌胃12周。3组大鼠自由摄食和饮水，每周根据体质量调整灌胃剂量。

2.3 取材

每组大鼠分别于干预4、8、12周后各处死8只并取材。处死前称取大鼠体质量，按40 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉，腹主动脉采血，所取全血室温静置2 h后，4 ℃下3 000 r/min离心10 min，取血清，冻存待测。分离左侧股骨颈用于Masson染色；分离右侧股骨颈用于骨密度检测，股骨用于骨生物力学检测；分离第1腰椎用于qPCR实验；分离第2腰椎用于Western blot实验。

2.4 观察指标

2.4.1 Masson染色法观察股骨颈形态

左侧股骨颈置于4%中性多聚甲醛固定48 h，以10% EDTA溶液脱钙6周，梯度乙醇脱水及二甲苯透明，浸蜡后常规石蜡包埋，制作厚度约5 μm的石蜡切片。石蜡切片经二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水；以Bouin氏液固定1 h，流水冲洗直至切片无色；Masson液浸染10 min，流水冲洗直至水澄清；1%磷钼酸液分色5～10 min，直至骨小梁褪色；0.5%固绿染液浸染5 min，脱水、透明后封片，光学显微镜下进行拍照。

2.4.2 骨密度测定

将右侧股骨颈放置于双能X线骨密度仪探头下，探头对准后，应用骨密度测定软件自动分析骨密度值。

2.4.3 骨生物力学检测

将右股骨置于万能材料试验机，采用三点弯曲法，支座跨距约20 mm，以股骨中心点作为加力点，压力加载速度设定为1 mm/min，直至股骨骨折，通过电脑描记载荷-变形曲线，计算出股骨最大载荷。

2.4.4 ELISA法检测血清PI3K、Akt含量

从-80 ℃冰箱取出血清，按照试剂盒说明书步骤测定血清PI3K、Akt含量。

2.4.5 qPCR检测腰椎PI3K、Akt、GSK3β mRNA相对表达水平

用研钵液氮研磨骨组织，TriZol法提取RNA，测定其浓度。基因引物由厦门赛特奥斯生物技术有限公司合成，见表1。根据说明书步骤，配置反转录体系和qPCR反应体系，反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共45个循环。以GADPH作为内参，校正各组样品，应用2^-ΔΔCT法计算基因相对表达水平。

2.4.6 Western blot检测腰椎PI3K、Akt、GSK3β蛋白表达量

于冰上RIPA裂解骨组织，4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取上清，收集总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。经过蛋白变性、电泳、转膜，置于5%脱脂奶粉中室温摇床封闭30 min，分别加入PI3K（1∶300）、Akt（1∶3 000）、GSK3β（1∶1 000）、GAPDH（1∶3 000）一抗，4 ℃孵育过夜。TBST溶液清洗，置于二抗（1∶10 000）中37 ℃摇床孵育1～2 h，TBST溶液清洗，ECL化学发光与曝光，采用Image Lab软件分析灰度值。

2.5 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐者两两比较采用LSD-t检验，方差不齐采用Tambane´s T2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 3组股骨颈甲苯胺蓝染色情况

第4周3组骨小梁均较致密，完整性尚好。第8、12周模型组可见骨小梁明显稀疏、变细、断裂，完整性差；青娥方组相对于模型组明显改善，随时间推移，改善越明显。见图1。

3.2 3组不同干预时间股骨颈骨密度比较

见表2。

3.3 3组不同干预时间股骨最大载荷比较

见表3。

3.4 3组不同干预时间血清PI3K、Akt含量比较

见表4。

3.5 3组不同干预时间腰椎PI3K、Akt、GSK3β mRNA相对表达水平比较

见表5。

3.6 3组不同干预时间腰椎PI3K、Akt、GSK3β蛋白表达量比较

见图2、表6。

4 讨　论

绝经后骨质疏松症的病机主要为肾亏脾虚，以肾虚为本^［4］。青娥方中杜仲为君，补肝肾、强筋骨；补骨脂为臣，温补脾肾使气血生化有源；核桃仁为佐，补肾强骨、温肺润肠；大蒜为使，宣通祛寒、温经通络。全方共奏补肾、健脾、强骨之效。前期研究显示，青娥方能够降低骨质疏松模型大鼠血清MMP-9、TRACP5b的含量^［5］，下调FAK/Src/p130Cas信号的表达^［6］，提示青娥方能够有效抑制破骨细胞的骨吸收^［7］。骨密度是诊断骨质疏松的主要指标^［8-9］，本研究结果显示：干预第8、12周，模型组骨密度明显下降，骨形态学显示骨小梁明显稀疏、变细、断裂，完整性差，提示切除卵巢后骨密度持续下降，出现骨质疏松，说明去卵巢骨质疏松模型大鼠造模成功。与模型组比较，青娥方组骨密度明显升高，骨形态学显示骨小梁逐渐致密，提示随着干预时间的延长，青娥方可明显提高骨密度，这与临床观察的结果一致^［10-11］。干预第12周，青娥方组股骨最大载荷较模型组明显升高，提示青娥方可以明显改善骨强度，从实验角度证明“补肾健脾”是绝经后骨质疏松症的理论基础。

PI3K/Akt信号通路参与调节破骨细胞代谢^［12］，当PI3K完全激活后，可活化下游的Akt因子，从而调节破骨细胞的存活与分化。研究表明抑制PI3K/Akt信号通路及下游因子GSK3β可以抑制破骨细胞的生成及骨吸收能力^［13-15］。本研究结果显示：干预第4周模型组腰椎Akt mRNA和蛋白表达较假手术组均明显提高（P＜0.05）；干预第8、12周模型组血清PI3K含量和腰椎PI3K、GSK3β mRNA和蛋白表达较假手术组均明显提高（P＜0.05），提示卵巢功能的丧失可以激活PI3K/Akt信号通路，从而促进破骨细胞的活性^［16］，其表达态势也符合高转换型骨质疏松的特点^［17］。与模型组比较，青娥方组腰椎PI3K、Akt、GSK3β mRNA及蛋白表达在不同干预时间点出现降低（P＜0.05），提示青娥方可以抑制PI3K/Akt信号通路表达，从而抑制破骨细胞的活性，达到治疗骨质疏松的目的。

综上所述，青娥方可能通过抑制PI3K/Akt通路来提高骨密度及骨生物力学性能，达到护骨的目的。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81904228)

福建省自然科学基金项目(2023J011853)

福建省中医药科研项目(2021ZYJC24)

漳州市自然科学基金项目(ZZ2023J14)