股骨头坏死愈胶囊对激素性股骨头坏死大鼠破骨细胞生成的影响

摘要

目的 观察股骨头坏死愈胶囊（FHNHC）对激素性股骨头坏死（SANFH）大鼠破骨细胞生成的影响。 方法 ① 体外实验：体外分离和培养大鼠骨髓巨噬细胞（BMDMs），活死细胞荧光染色检测FHNHC提取物对BMDMs活性的影响。将BMDMs分为对照组、FHNHC低剂量组和FHNHC高剂量组，3组均使用含30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL的α-MEM完全培养基向破骨细胞诱导，与此同时FHNHC低剂量组和FHNHC高剂量组分别加入200、400 μg/mL FHNHC提取物溶液进行干预。每3 d更换培养基，诱导7 d。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察破骨细胞生成情况；免疫荧光染色检测破骨细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达；Western blot检测组织蛋白酶K（CTSK）、MMP-9、核因子性活化T细胞转录因子1（NFATc1）蛋白表达量。② 体内实验：将32只8周龄SD大鼠随机分为对照组（n＝8）和造模组（n＝24），造模组采用注射脂多糖联合甲泼尼松龙琥珀酸钠建立SANFH大鼠模型。采用随机数字表法将造模成功的大鼠分为模型组、低剂量组和高剂量组。低、高剂量组分别按生药量0.4、0.6 g/（kg·d）给予FHNHC提取物药液灌胃，对照组和模型组按4 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃，连续灌胃8周。Micro-CT观察大鼠股骨头结构并分析骨密度（BMD）、骨体积与总积比（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁分离度（Tb.Sp）；HE染色观察大鼠股骨头病理形态学。 结果 ① 体外实验：与对照组比较，FHNHC低、高剂量组破骨细胞生成减少，体积变小；MMP-9荧光强度明显减弱（P＜0.05），CTSK、NFATc1、MMP-9蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）。与FHNHC低剂量组比较，FHNHC高剂量组MMP-9蛋白荧光强度明显减弱（P＜0.05），CTSK、NFATc1、MMP-9蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）。② 体内实验：模型组大鼠股骨头骨小梁体断裂稀疏、结构紊乱，出现细胞核固缩，空骨陷窝增加，在骨髓腔内可见大量脂肪颗粒；低、高剂量组大鼠股骨头骨小梁的断裂稀疏情况改善，空骨陷窝以及脂肪颗粒的数量减少，其中高剂量改善更明显。与对照组比较，模型组BMD、BV/TV、Tb.Th均明显降低（P＜0.05），Tb.Sp明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、高剂量组BMD、BV/TV、Tb.Th均明显升高（P＜0.05），Tb.Sp明显降低（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组BMD、BV/TV、Tb.Th均明显升高（P＜0.05），Tb.Sp明显降低（P＜0.05）。 结论 FHNHC能够抑制破骨细胞的生成以及骨吸收功能，改善SANFH大鼠的股骨头结构。

Graphical abstract

关键词

激素性股骨头坏死 / 股骨头坏死愈胶囊 / 破骨细胞 / 骨吸收

激素性股骨头坏死（steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH）是由于长期或大剂量使用糖皮质激素所导致的髋关节疾病，以髋关节疼痛、功能障碍为主要临床表现^［1］。在长期接受激素治疗的患者中，SANFH发生率高达40%^［2］。SANFH确切的细胞和分子机制仍有争议，但破骨细胞过度生成被认为是导致SANFH的重要原因^［3］。研究发现在股骨头坏死区域破骨细胞过度生成，而抑制破骨细胞的生成可以降低骨吸收，从而改善股骨头的骨骼结构，抑制股骨头坏死的发展^［4-5］。股骨头坏死愈胶囊（femoral head necrosis healing capsule，FHNHC）是河南省洛阳正骨医院的院内制剂（批准文号：20210607），能够减轻患者髋部疼痛，改善下肢跛行，缩小骨头坏死区及增生硬化区的面积，具有良好的临床疗效^［6］。现代研究表明：FHNHC能够抑制因血液循行不畅而导致的骨小梁坏死、塌陷，在改善SANFH骨骼结构方面拥有巨大的潜力^［7-8］。但是FHNHC治疗SANFH的机制是否与抑制破骨细胞的生成有关尚不明确。本研究通过细胞实验和动物实验研究FHNHC对破骨细胞的生成、骨吸收相关蛋白表达以及SANFH大鼠股骨头结构的影响，以期探讨FHNHC治疗SANFH的机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

8周龄雄性SD大鼠32只，体质量250～280 g；4周龄雄性SD大鼠8只，体质量80～100 g，均购自泰州昱欣生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2020-0009。大鼠均饲养于江苏华创信诺医药科技有限公司，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2020-0041。大鼠自由进食与饮水，饲养环境恒温恒湿，每天光照时间12 h。所有动物实验经过河南大学生物医学科研伦理委员会批准（HUSOM2023-459）。

1.2 实验药物

FHNHC（河南省洛阳正骨医院，批号：20210607）。FHNHC提取物制备：100 g FHNHC粉末加入10倍体积纯水浸泡过夜，煎煮2 h，无菌滤纸过滤，煮沸浓缩煎煮液至50 mL，冷冻干燥仪干燥浓缩后的药液，最终得到股骨头坏死愈胶囊冻干粉^［9］，即FHNHC提取物。将FHNHC提取物溶于α-MEM培养基中配置成FHNHC提取物溶液用于细胞干预；溶解于无菌生理盐水配制成FHNHC提取物药液用于大鼠灌胃。甲泼尼松龙琥珀酸钠（MPSS，重庆华邦制药有限公司，批号：YBH1340 2021）。

1.3 实验试剂

巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，批号：C470）；核因子-κB受体激活因子配体（RANKL）抗体（批号：400-30）、活化T细胞核因子1（NFATc1）抗体（批号：66963-1-Ig）、辣根过氧化物酶偶联的Affinipure山羊抗小鼠IgG（H＋L）（批号：SA00001-1）、GAPDH多克隆抗体（60004-1-Ig）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；钙黄绿素/碘化丙啶（Calcein/PI）细胞活性与细胞毒性检测试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司，批号：C2015S）；组织蛋白酶K（CTSK）抗体（批号：SC-48353）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）抗体（批号：SC-393859）均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒（批号：G1492）、脂多糖（批号：IL2020-10 mg）均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.4 实验仪器

倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；共聚焦荧光显微镜（德国Leica公司）；酶标仪（美国Thermo公司）；Micro-CT扫描仪（比利时SkyScan公司）；UC-6超薄切片机（德国Leica公司）；电泳仪、快速湿转仪、电泳槽均购自中国金斯瑞生物科技公司；离心机（德国Eppendorf公司）；化学发光成像系统（中国杭州申花科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 体外实验

2.1.1 体外分离培养

取4周龄SD大鼠，按40 mg/kg腹腔注射0.3%戊巴比妥钠溶液麻醉，脱臼处死，在无菌条件下取出大鼠股骨，将股骨的两端剪断，分离出骨髓。收集冲洗液，离心后去上清，加入红细胞裂解液，离心后弃上清，用α-MEM完全培养基重悬细胞，接种于细胞培养皿内，24 h后取培养液离心，离心后用含有30 ng/mL M-CSF的α-MEM完全培养基重悬，接种到孔板中，每隔3 d更换培养基，去除未附着的细胞。6 d后细胞呈椭圆形，形态相似，表明纯化为骨髓巨噬细胞（BMDMs）^［10］。

2.1.2 活死细胞荧光染色检测BMDMs活性

将BMDMs按2×10⁵个/孔接种于24孔板，分为对照组和FHNHC低、高剂量组。FHNHC低剂量组和FHNHC高剂量组分别加入200、400 μg/mL FHNHC提取物干预24、48 h，吸去培养基，用PBS溶液洗涤3遍，加入300 μL Calcein AM/PI细胞活性与细胞毒性检测工作液，37 ℃下避光孵育30 min，用荧光显微镜观察并分析结果。

2.1.3 破骨细胞诱导与干预

将BMDMs按2×10⁵个/孔接种于24孔板中，分为对照组、FHNHC低剂量组和FHNHC高剂量组。3组均使用含30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL的α-MEM完全培养基向破骨细胞诱导。与此同时，FHNHC低剂量组和FHNHC高剂量组分别加入200、400 μg/mL FHNHC提取物溶液进行干预。每3 d更换培养基，诱导7 d。

2.1.4 TRAP染色检测破骨细胞生成情况

弃培养液，4%多聚甲醛固定，破膜液破膜10 min，TRAP工作液37 ℃孵育1 h，用PBS溶液冲洗细胞3次，显微镜下观察并拍摄，TRAP染色阳性细胞呈现紫红色，其中含3个及以上细胞核的阳性细胞被认为是成熟破骨细胞。

2.1.5 免疫荧光染色检测破骨细胞MMP-9表达

弃培养液，用4%多聚甲醛固定，常规破膜封闭，加入MMP-9抗体（1∶200）4 ℃孵育过夜。回收一抗，二抗（1∶500）室温孵育2 h。DAPI染色后，共聚焦荧光显微镜下观察。

2.1.6 Western blot 检测CTSK、NFATc1、MMP-9蛋白表达量

细胞裂解液提取蛋白并测定浓度，经变性、电泳、转膜，用封闭液封闭15 min，置于CTSK（1∶100）、NFATc1（1∶2 000）、MMP-9（1∶100）、GAPDH（1∶5 000）一抗中4 ℃孵育过夜，TBST溶液清洗后置于二抗（1∶2 000）中室温孵育1 h，使用显影液进行显色，采用ImageJ软件进行定量分析。

2.2 体内实验

2.2.1 分组和造模

将32只8周龄SD大鼠随机分为对照组（n＝8）和造模组（n＝24）。造模组连续2 d按10 μg/（kg·d）腹腔注射脂多糖溶液，第2次注射脂多糖溶液24 h后，连续3 d按40 mg/（kg·d）臀大肌注射MPSS溶液，建立SANFH大鼠模型^［11］，对照组大鼠不进行处理。最后1次注射MPSS后8周，随机抽取3只大鼠取股骨头进行Micro-CT及HE染色，骨小梁稀疏断裂，骨细胞核固缩、空骨陷窝增加、髓腔内出现脂肪颗粒被认为造模成功^［12-13］。采用随机数字表法将造模成功的大鼠分为模型组、低剂量组和高剂量组。

2.2.2 干预

低、高剂量组分别按生药量0.4、0.6 g/（kg·d）给予FHNHC提取物药液灌胃^［7］，对照组和模型组按4 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃，每日1次，连续灌胃8周。最后1次灌胃后24 h，异氟烷麻醉大鼠，脱臼处死，取出股骨置于4%多聚甲醛固定。

2.2.3 Micro-CT观察大鼠股骨头结构

使用Micro-CT扫描仪对大鼠股骨头进行扫描，选择股骨头骨骺线中心下方1 mm处作为感兴趣区域（ROI）。量化并分析ROI区域的骨密度（BMD）、骨体积与总积比（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）以及骨小梁分离度（Tb.Sp）。

2.2.4 HE染色观察大鼠股骨头病理形态学

将固定后的股骨头进行脱钙、包埋和切片，在二甲苯中脱蜡并用乙醇脱水。最后，应用苏木精和伊红进行染色后显微镜下观察。

2.3 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐采用LSD-t法，方差不齐采用Games-Howell法。检验水平α＝0.05。

3 结　果

3.1 体外实验

3.1.1 3组BMDMs活死细胞荧光染色情况

与对照组比较，FHNHC低、高剂量组在干预24、48 h后荧光相对值差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

3.1.2 3组破骨细胞TRAP染色情况

3组均诱导出破骨细胞，其中对照组破骨细胞更为密集，破骨细胞体积较大。与对照组比较，FHNHC低、高剂量组破骨细胞数量变少，体积变小，其中FHNHC高剂量组对破骨细胞生成的抑制作用更明显。见图2。

3.1.3 3组破骨细胞MMP-9免疫荧光情况比较

与对照组比较，FHNHC低、高剂量组破骨细胞MMP-9荧光强度明显减弱，其中FHNHC高剂量组减弱最为明显（P＜0.05）。见图3、图4。

3.1.4 3组破骨细胞CTSK、NFATc1、MMP-9蛋白表达量比较

与对照组比较，FHNHC低、高剂量组CTSK、NFATc1、MMP-9蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）；与FHNHC低剂量组比较，FHNHC高剂量组CTSK、NFATc1、MMP-9蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）。见图5、表1。

3.2 体内实验

3.2.1 Micro-CT分析大鼠股骨头结构变化

对照组大鼠股骨头的骨小梁呈多孔网架结构，规律性排列，骨小梁数量较多，排列致密。模型组大鼠股骨头骨小梁体断裂稀疏、结构紊乱。低、高剂量组大鼠股骨头骨小梁的断裂稀疏情况改善，其中高剂量改善更明显，见图6。与对照组比较，模型组BMD、BV/TV、Tb.Th明显降低（P＜0.05），Tb.Sp均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、高剂量组BMD、BV/TV、Tb.Th均明显升高（P＜0.05），Tb.Sp明显降低（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组BMD、BV/TV、Tb.Th均明显升高（P＜0.05），Tb.Sp明显降低（P＜0.05）。见表2。

3.2.2 4组大鼠股骨头组织HE染色情况

对照组大鼠股骨头的骨小梁呈网状结构，规律性排列，骨小梁数量较多，排列致密，未见骨小梁断裂、脂肪颗粒等表现；模型组大鼠股骨头骨小梁体断裂稀疏，骨小梁结构紊乱，出现细胞核固缩，空骨陷窝增加，在骨髓腔内可见大量脂肪颗粒；给药组骨小梁数量增加，空骨陷窝以及脂肪颗粒的数量减少。见图7。

4 讨　论

破骨细胞是骨吸收的主要细胞，破骨细胞数量过度增加可能导致骨吸收过度，从而导致骨质疏松、股骨头坏死等骨代谢疾病的发生^［14］。既往研究表明：破骨细胞的过度生成与SANFH的发生以及塌陷密切相关，而抑制破骨细胞生成则是治疗SANFH的一种重要策略^［15］。TRAP是一种主要存在于破骨细胞的酸性磷酸酶，因此通过TRAP染色可以观察到破骨细胞的形态特征和数量^［16］。NFATc1作为破骨细胞生成的主要转录因子，能够从蛋白水平反应破骨细胞的生成情况^［17］。本研究结果显示：与对照组比较，FHNHC提取物干预后破骨细胞减少，NFATc1蛋白表达下降，表明FHNHC提取物能够抑制破骨细胞的生成。破骨细胞是骨组织降解和吸收的最主要细胞，MMP-9和CTSK则是破骨细胞骨吸收过程中的关键细胞因子^［18-19］。其中MMP-9能够降解骨基质中的非胶原蛋白成分^［20］，而CTSK在Ⅰ型胶原蛋白的降解中发挥主要作用^［21］。实验结果表明：FHNHC提取物干预后，破骨细胞中MMP-9、CTSK蛋白表达下降，说明FHNHC对破骨细胞的骨吸收功能具有抑制作用。BMD、BV/TV、Tb.Th能够直接的反应骨密度、骨体积的情况，SANFH大鼠体内研究发现：与模型组比较，FHNHC干预后大鼠股骨头BMD、BV/TV、Tb.Th升高，骨骼结构改善，说明FHNHC能够改善激素引起的骨骼破坏，增加骨量。

综上所述，FHNHC能够抑制破骨细胞的生成和骨吸收功能，改善骨骼结构。但本研究尚存在不足之处，未对FHNHC抑制破骨细胞生成的相关通路机制进行研究，下一步将对FHNHC抑制破骨细胞生成的机制做更为深入探索。

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基金资助

河南省中医药科学研究专项课题(20-21ZYZD10)