川贝清肺糖浆对病毒性肺炎斑马鱼的治疗作用

摘要

目的 探讨川贝清肺糖浆对病毒性肺炎斑马鱼的干预作用。 方法 选取受精后5 d（5dpf）转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼或转基因巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，鱼鳔注射给予10 mg/mL聚肌胞苷酸，每尾注射10 nL，建立病毒性肺炎斑马鱼模型。将180尾斑马鱼随机分为对照组、模型组、阳性组、低剂量组、中剂量组和高剂量组各30尾。除对照组外，其余5组建立斑马鱼病毒性肺炎模型。造模成功后低、中、高剂量组分别水溶给予3.12、6.25、12.5 μL/mL川贝清肺糖浆；阳性组给予21.5 μg/mL吲哚美辛溶液，对照组和模型组不予干预，均连续干预3 h。荧光显微镜下拍照并检测鱼鳔中性粒细胞数量和巨噬细胞荧光强度；HE染色观察鱼鳔组织病理情况；qPCR检测白介素-1β（il-1β）、肿瘤坏死因子-α（tnf-α）基因相对表达水平。 结果 鱼鳔组织HE染色显示：模型组斑马鱼鱼鳔内可见明显炎性浸润，提示模型建立成功；各给药组均未观察到炎性浸润。与对照组比较，模型组中性粒细胞数量、巨噬细胞荧光强度均明显升高（P＜0.05），il-1β和tnf-α基因相对表达水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组中性粒细胞数量和il-1β、tnf-α基因相对表达水平均明显降低（P＜0.05），阳性组和中、高剂量组巨噬细胞荧光强度明显降低（P＜0.05）。 结论 川贝清肺糖浆可以抑制病毒性肺炎的炎症反应。

Graphical abstract

关键词

病毒性肺炎 / 川贝清肺糖浆 / 斑马鱼 / 炎症反应

病毒性肺炎是一种急性呼吸道传染病，由病毒感染所致，好发于秋冬两季，可导致肺部炎性病变的常见病毒有腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、冠状病毒等^［1］，被病毒感染后人体会出现发热、咳嗽、咽干、咽痛等症状，严重者还会出现呼吸衰竭、肺部纤维化等症状^［2］。病毒性肺炎可引起暴发或局部流行，近年来爆发的新型冠状病毒感染（COVID-19）导致大规模人群感染，甚至死亡，在全球影响广泛^［3］。川贝清肺糖浆是由川贝母、枇杷叶、苦杏仁、麦冬、桔梗等中药组成，具有清肺润燥、止咳化痰的功效，用于治疗痰热郁肺所致的干咳、咽干、咽痛等症状，具有良好的抗炎作用^［4］。斑马鱼与人类非常相似，是哺乳动物遗传学中非常重要的同类模式动物，斑马鱼模型价格低廉，试验周期短，克服了传统小鼠模型发育时间长、筛选局限性大的缺点，也克服了传统细胞体外模型筛选试验结果准确性低的缺点^［5］。本研究通过鱼鳔注射聚肌胞苷酸建立斑马鱼病毒性肺炎模型，分析鱼鳔组织病理，检测鱼鳔中性粒细胞数量、鱼鳔巨噬细胞荧光强度和白介素-1β（il-1β）、肿瘤坏死因子-α（tnf-α）基因表达水平的变化，评价川贝清肺糖浆抗病毒性肺炎的功效。

1 实验材料

1.1 实验动物

转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼和转基因巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，由杭州环特生物科技股份有限公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2022-0004，饲养管理符合国际AAALAC认证（认证编号：001458）的要求，实验动物使用许可证号：SCXK（浙）2022-0003。自然成对交配繁殖，受精后5 d（5dpf），饲养于28 ℃培养水中，水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为450～550 μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100 mg/L CaCO₃。

1.2 实验药物

川贝清肺糖浆（福建延年药业有限公司，批号：230301）；吲哚美辛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：F1905137），用DMSO配制成21.5 mg/mL吲哚美辛溶液，-20 ℃储存。

1.3 实验试剂

无水乙醇（批号：20230329）、二甲苯（批号：20221207）、氨水（批号：20201225）均购自国药集团化学试剂有限公司；4%组织细胞固定液（批号：20221014）、中性树胶（批号：330A021）均购自北京索莱宝科技有限公司；伊红染色液（批号：20220120）、苏木素染色液（批号：20220120）均购自上海依赫生物科技有限公司；高效切片石蜡（熔点54～56 ℃，批号：20201020）、高效切片石蜡（熔点62～64℃，批号：20210828）均购自上海华永石蜡有限公司；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号：7G642J2）；FastKing cDNA第一链合成试剂盒（去基因组）（天根生化科技有限公司，批号：X0320）；Universal RNA Extraction TL Kit C（佛山奥维生物科技有限公司，货号：TL2204001643C）；聚肌胞苷酸（加拿大Toronto Research Chemicals公司，批号：1-KMS-178-2）；稀盐酸（深圳市博林达科技有限公司，批号：2021 0104）；甲基纤维素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：C2004046）。

1.4 实验仪器

解剖显微镜（日本Olympus公司）；VertA1CCD相机（上海土森视觉科技有限公司）；电动聚焦连续变倍荧光显微镜（日本Nikon公司，型号：AZ100）；精密电子天平（美国Ohaus公司，型号：CP214）；全自动样品快速研磨仪（上海净信实验设备科技部，型号：JXFSTPRP-24L）；全自动核酸提取仪（杭州奥盛仪器有限公司，型号：Auto-Pure32A）；T100普通PCR扩增仪、CFX Connect荧光定量PCR仪均购自美国Bio-Rad公司；IM300显微注射仪、PC-10拉针仪均购自日本Narishige公司；高速冷冻离心机（型号：Heraeus Fresco17）、紫外-可见光分光光度计（型号：Nanodrop2000）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

2 研究方法

2.1 模型制备

将斑马鱼按30尾/孔置于6孔板中，每孔容量3 mL。选取受精后5 d（5dpf）转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼或转基因巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，按10 nL/尾鱼鳔注射10 mg/mL聚肌胞苷酸，建立病毒性肺炎斑马鱼模型^［6］，实验环境温度设置为28 ℃。在实验终点，病毒性肺炎斑马鱼模型鱼鳔中性粒细胞数量与正常斑马鱼比较差异有统计学意义，即造模成功。

2.2 川贝清肺糖浆的最大耐受浓度（MTC）筛选

病毒性肺炎模型斑马鱼按30尾/孔置于6孔板中，分别水溶给予质量浓度为6.25、12.5、25.0、50.0、100 μL/mL的川贝清肺糖浆，同时设置空白孔（斑马鱼培养水），每孔容量3 mL。在试验过程中，观察记录斑马鱼的死亡情况并移除死亡的斑马鱼。试验终点，斑马鱼在6.25、12.5 μL/mL浓度中无死亡现象，也无明显形态和行为异常。因此，在本实验条件下，川贝清肺糖浆抗病毒性肺炎功效最大检测浓度（MTC）为12.5 μL/mL。本实验选取3.12、6.25、12.5 μL/mL为川贝清肺糖浆低、中、高剂量组的干预浓度。

2.3 分组和干预

将180尾斑马鱼随机分为对照组、模型组、阳性组、低剂量组、中剂量组、高剂量组各30尾。除对照组外，其余5组建立斑马鱼病毒性肺炎模型。造模成功后，低、中、高剂量组分别水溶给予3.12、6.25、12.5 μL/mL川贝清肺糖浆；阳性组按21.5 μg/mL加入吲哚美辛溶液；对照组和模型组不予干预，连续干预3 h。其中转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼用于鱼鳔中性粒细胞数量测定、HE染色和qPCR检测，转基因巨噬细胞绿色荧光斑马鱼用于鱼鳔巨噬细胞荧光强度测定。

2.4 观察指标

2.4.1 鱼鳔中性粒细胞数量测定

6组各随机选取10尾斑马鱼于荧光显微镜下拍照，用NIS-ElementsD 3.20高级图像处理软件分析鱼鳔中性粒细胞数量。

2.4.2 鱼鳔巨噬细胞荧光强度测定

6组各随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照，用ImageJ图像处理软件分析鱼鳔巨噬细胞荧光强度。

2.4.3 HE染色观察鱼鳔组织病理情况

用4%组织细胞固定液将斑马鱼固定，经系列脱水-包埋-切片-染色-封片等步骤后，对斑马鱼进行组织病理学HE染色分析。

2.4.4 qPCR检测il-1β、tnf-α基因相对表达水平

采用Universal RNA Extraction TL Kit C提取各组斑马鱼总RNA，利用紫外-可见光分光光度计对总RNA浓度和纯度进行测定。取2.00 μg斑马鱼样品总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明操作，合成20.0 μL cDNA，通过qPCR检测β-actin、il-1β和tnf-α基因的表达。用β-actin作为基因表达内参，计算il-1β和tnf-α基因相对表达水平，基因引物序列见表1。

2.5 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐则采用Games-Howell检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 6组鱼鳔中性粒细胞数量比较

与对照组比较，模型组中性粒细胞数量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组中性粒细胞数量明显降低（P＜0.05）。见图1、图2。

3.2 6组鱼鳔巨噬细胞荧光强度比较

与对照组比较，模型组巨噬细胞荧光强度明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性组和中、高剂量组巨噬细胞荧光强度明显降低（P＜0.05）。见图3、图4。

3.3 6组斑马鱼鱼鳔组织HE染色情况

对照组斑马鱼鱼鳔组织结构规则，细胞形态完整，细胞质均匀；模型组斑马鱼鱼鳔内可见明显炎性浸润，提示模型建立成功；各给药组均未观察到炎性浸润。见图5。

3.4 6组il-1β、tnf-α基因相对表达水平比较

与对照组比较，模型组il-1β和tnf-α基因相对表达水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组il-1β和tnf-α基因相对表达水平均明显降低（P＜0.05）。见表2。

4 讨　论

目前临床上用于治疗病毒性肺炎的西药有RNA聚合酶抑制剂、血凝素抑制剂、神经氨酸酶抑制剂和M2离子通道阻滞剂等，这些药物在治疗过程中可能会产生不良反应，且随着病毒的变异其有效性也存在很大的不确定性^［7-8］。中药在治疗病毒性肺炎中主要从调节免疫功能、抑制炎症反应、降低病毒复制转导等方面发挥作用，作用机制主要与抗炎、抗病毒和免疫调节有关。

炎症反应是导致病毒性肺炎发生的核心环节，也是导致患者出现器官功能性损伤的重要机制之一，中性粒细胞和巨噬细胞是炎症反应的中心细胞。范中娥等^［9］研究显示病毒性肺炎患者炎性反应增强，血清中IL-6、C反应蛋白等炎性因子显著性增高，因此有效阻断和调节肺组织的炎症反应是治疗病毒性肺炎的关键^［10］。TNF-α作为重要的炎症因子，在抵抗细菌和病毒感染以及清除被感染的细胞等方面发挥着重要的作用^［11］。IL-1β是一种引发炎症的介体，可激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化，在炎症反应中起重要作用^［12］。

本研究结果显示：与模型组比较，各给药组斑马鱼鱼鳔中性粒细胞和巨噬细胞减少，鱼鳔组织炎性浸润减少，il-1β和tnf-α基因相对表达水平均明显降低，表明川贝清肺糖浆可以抑制病毒性肺炎的炎症反应。

参考文献

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基金资助

福建省科技厅引导性项目(2022Y0036)

福建省大学生创新创业训练计划(S202210393018)