HPLC法测定红景天苷原料药中红景天苷的含量

摘要

目的 采用高效液相色谱（HPLC）法建立红景天苷原料药中红景天苷含量测定方法。 方法 采用Phenomenex C₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；以甲醇∶水（20∶80）为流动相；检测波长220 nm；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量20 μL。 结果 红景天苷在10.36～93.24 μg/mL浓度范围内呈现良好的线性关系，精密度良好，3批原料药中红景天苷的平均含量分别为99.38%、99.48%和99.66%，均＞99.00%。 结论 本文建立HPLC法测定红景天苷原料药含量的方法可靠、简便。

Graphical abstract

关键词

红景天苷 / HPLC / 红景天苷原料药 / 含量测定

红景天的药用历史久远，始载于《四部医典》，被李时珍誉为上品，其味甘涩、寒、无毒，具有祛邪恶气、补诸不足之效。研究证实红景天无毒副作用及成瘾性^［1］，其免疫补益作用优于人参和刺五加，且不具有人参和刺五加容易引起便秘的缺点。红景天苷是红景天的主要活性成分之一，可促进血管形成，改善缺血性脑损伤细胞的再生能力^［2］，还具有抑制恶性胸腔积液生成的作用^［3］。目前，国家批准已注册以红景天为原料的保健品种有302项，建立快速、高效、准确的方法对红景天保健品中的红景天苷进行检测尤为重要。目前已建立的红景天苷测定方法，包括高效液相色谱（HPLC）法^［4］、超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器（UPLC-PDA）法^［5］、高效液相色谱-串联质谱法^［6］、二阶校正法结合三维荧光^［7］、HPLC特征图谱^［8］、LC-MS/MS法^［9-10］和UHPLCMS-QQQ负离子检测模式^［11］等，以上检测方法多集中在复方制剂、中药材原料中红景天苷的测定，而红景天苷原料药中红景天苷的检测较为少见。因此，本研究通过建立HPLC法测定红景天苷原料药中红景天苷的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（美国Waters公司，型号：E2695）；十万分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，型号：XS205）；超纯水机（德国Merck公司，型号：Milli-Q）。

1.2 试药

红景天苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110818-201708）；红景天苷原料药（福建某制药股份有限公司，本原料药质量满足新药研究指导原则及ICH的规定及要求）；甲醇（德国Merck公司，色谱纯）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Phenomenex C₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇∶水（20∶80）为流动相；检测波长220 nm；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量20 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液制备

称取红景天苷原料药约10 mg，精密称定后置于20 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解并稀释，再取适量甲醇定容至刻度，摇匀；精密量取2 mL溶液，置于20 mL容量瓶中，加适量流动相稀释，再取适量流动相定容至刻度，摇匀后即得供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液制备

称取红景天苷对照品约10 mg，精密称定后置于20 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解稀释，再取适量甲醇定容至刻度，摇匀；精密量取2 mL溶液，置于20 mL容量瓶中，加适量流动相稀释，再取适量流动相定容至刻度，摇匀后即得红景天苷对照品溶液。

2.3 HPLC定量分析

2.3.1 系统适用性试验

取“2.2”项中红景天苷对照品溶液和供试品溶液，分别按“2.1”项中色谱条件进行测定，并记录下色谱图。如有杂质峰，分离度应符合规定，理论板数按主峰计算不低于3 500。实验结果表明，红景天苷主峰测定无干扰，理论塔板数为6 924。见图1。

2.3.2 线性关系考察

取“2.2.2”项下对照品溶液，用流动相稀释成不同梯度浓度的红景天苷对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别测定，以红景天苷对照品浓度（µg/mL）为横坐标X，峰面积为纵坐标Y进行线性回归，计算得回归方程为Y＝27 587X－56 262，r＝1.000，在10.36～93.24 μg/mL浓度范围内红景天苷呈现良好的线性关系。

2.3.3 精密度试验

2.3.3.1 重复性试验

按 “2.2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别测定，用峰面积计算红景天苷含量。结果显示红景天苷平均含量为100.5%，RSD为0.9%，提示该方法符合要求。

2.3.3.2 中间精密度试验

按“2.2.1”项下方法分别制备6份供试品溶液，由不同实验员在不同日期使用不同仪器重新进行检测。结果显示红景天苷平均含量为100.3%，RSD为0.7%，提示该方法符合要求。

2.3.4 稳定性试验

取“2.2.1”项下供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12 h按“2.1”项下色谱条件进样分析。结果显示供试品溶液在12 h内稳定，7次进样峰面积无明显变化，RSD为0.4%。

2.3.5 定量限与检测限试验

为了考察是否具备灵敏的定量检测能力，分别进行定量限与检测限试验。取标准溶液，用流动相逐步稀释，按信噪比3∶1为最低检测限，信噪比10∶1为定量限进行测定。实验结果表明：红景天苷最低检测限为0.05 μg/mL，定量限为0.2 μg/mL。

2.3.6 样品含量测定

分别取3批红景天苷原料药样品，按“2.2”项下方法制备红景天苷对照品溶液和供试品溶液，依照“2.1”项下色谱条件分别测定红景天苷的含量，记录色谱图。根据回归方程计算得出3批原料药中红景天苷的平均含量分别为99.38%、99.48%、99.66%。

3 讨　论

对于检测波长选择，本次实验取红景天苷对照品溶液，按紫外-可见分光光度法进行扫描，红景天苷最大吸收波长分别为196、220、274 nm。196 nm处流动相有末端吸收，干扰测定；274 nm处响应值较小，检测灵敏度低。因此选用220 nm作为红景天苷含量测定波长。对于供试溶液浓度选择，含量测定供试品浓度一般为有关物质浓度的1/10～1/50，本实验选择1/20，此浓度下杂质不干扰主成分测定。

在前期有关物质研究中，红景天苷原料药主要存在3个杂质，含量均＜0.1%以下，在含量测定项浓度下，杂质含量水平远远低于检测限。同时，主峰峰纯度＜纯度阈值。因此，本方法准确性及专属性良好。采用本方法对红景天苷原料药进行测定，红景天苷在10.36～93.24 μg/mL浓度范围内呈现良好的线性关系，精密度良好，3批原料药含量分别为99.38%、99.48%和99.66%，均＞99.00%。此方法可操作性强、测试时间短、结果准确度高。可为以红景天苷原料药的保健品制剂质量控制提供参考，也为相关部门对红景天苷原料药中有效性成分的监管提供技术支持。

参考文献

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2021J01925)

泉州医学高等专科学校校级课题(XJS1702B)