五苓散通过NF-κB/NLRP3信号通路抑制糖尿病肾病小鼠肾纤维化

Wuling Powder Inhibits Renal Fibrosis in Diabetic Nephropathy Mice via NF-κB/NLRP3 Signaling Pathway

摘要

目的 探究五苓散对糖尿病肾病db/db小鼠肾纤维化的改善作用及机制。 方法 将24只8周龄db/db小鼠按照体质量随机分成模型组、五苓散组、厄贝沙坦组，每组8只，另取8只同周龄db/m小鼠为正常组。五苓散组给予五苓散7.2 g/（kg·d）灌胃，厄贝沙坦组给予厄贝沙坦22.5 mg/（kg·d），正常组和模型组db/db小鼠给予等体积生理盐水，连续给药8周。观察4组小鼠一般情况，检测糖化血清蛋白（GSP）、24 h尿蛋白定量（24 h-UTP）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、血肌酐（SCr）及尿素氮（BUN）含量；Masson染色观察肾组织病理改变；Western blot、qPCR法检测肾组织中核因子NF-κB p65、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）mRNA表达水平和蛋白表达量。 结果 与正常组比较，模型组db/db小鼠体质量及GSP、24 h-UTP、TG、TC、SCr、BUN含量均明显升高（P＜0.05）；肾小球体积增大，基底膜增厚，肾间质大量胶原纤维沉积；肾组织中NF-κB p65、NLRP3 mRNA表达水平及蛋白表达量均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，五苓散组db/db小鼠治疗后体质量及GSP、24 h-UTP、TG、TC、SCr、BUN含量均明显降低（P＜0.05），厄贝沙坦组db/db小鼠24 h-UTP、SCr、BUN含量均明显降低（P＜0.05）；五苓散组和厄贝沙坦组db/db小鼠肾小球基底膜增厚明显改善，肾间质胶原纤维沉积明显减少，肾组织中NLRP3、NF-κB p65 mRNA表达水平及蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）。 结论 五苓散可能通过调控NF-κB/NLRP3信号通路，抑制糖尿病肾病db/db小鼠肾脏组织纤维化。

Abstract

Objective To investigate the effect and mechanism of Wuling Powder on renal fibrosis in db/db mice with diabetic nephropathy. Methods According to body weight, 24 8-week-old db/db mice were randomly divided into model group, Wuling Powder group and irbesartan group, 8 db/db mice in each group, and 8 db/m mice of the same age were selected as normal group. The Wuling Powder group was given Wuling Powder 7.2 g/(kg·d) by gavage, the irbesartan group was given irbesartan 22.5 mg/(kg·d), db/db mice in the normal group and model group were given equal volume normal saline, all groups were intervened for 8 weeks. The general situation of mice were observed, the content of glycated serum protein (GSP), 24 hour urine total protein quantity (24 h-UTP), triglyceride (TG), total cholesterol (TC), serum creatinine (SCr), and blood urea nitrogen (BUN) were tested; the pathological changes of renal tissue were observed by Masson staining; Western blot and qPCR were used to detect the mRNA and protein expression of nuclear factor NF-κB p65 and NOD-like receptor protein 3 (NLRP3) in renal tissue. Results compared with the normal group, the body weight, the content of GSP, 24 h-UTP, TG, TC, SCr, and BUN of db/db mice in the model group increased significantly (P<0.05); the volume of glomerulus increased, the glomerular basement membrane thickened, and a large amount of collagen fibers deposited in renal interstitium; the mRNA and protein expression of NF-κB p65 and NLRP3 in renal tissues increased significantly (P<0.05). Compared with the model group, the body weight, the content of GSP, 24 h-UTP, TG, TC, SCr, and BUN of db/db mice in the Wuling Power group decreased significantly (P<0.05) after treatment, the content of 24 h-UTP, SCr and BUN of db/db mice in the irbesartan group significantly decreased (P<0.05); the glomerular basement membrane thickening of db/db mice in the Wuling Powder and irbesartan groups was significantly improved, and the collagen fibers deposition in renal interstitium reduced significantly, the mRNA and protein expression of NF-κB p65 and NLRP3 in renal tissues significantly decreased (P<0.05). Conclusion Wuling Powder may inhibit renal fibrosis in db/db mice with diabetic nephropathy by regulating NF-κB/NLRP3 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

糖尿病肾病 / 肾纤维化 / 五苓散 / NF-κB/NLRP3信号通路

Key words

diabetic nephropathy / renal fibrosis / Wuling Powder / NF-κB/NLRP3 signaling pathway

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病重要的微血管并发症，也是终末期肾功能衰竭和糖尿病患者死亡的原因之一。DN肾纤维化是导致DN患者终末期肾功能衰竭的常见途径^［1］，主要表现为细胞外基质（ECM）在肾脏中的过度沉积、肾实质硬化及瘢痕形成。目前，临床主要通过运用降糖药、血管紧张素酶抑制剂（ACEI）和血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂（ARB）类降压药或他汀类降脂药结合抗炎、改善循环等方法延缓肾纤维化的发生^［2］，但因多种因素限制未能取得良好疗效。中医药在治疗DN肾纤维化的过程中积累了丰富的经验，随着实验的开展，其治疗机制也不断得到证实。

研究表明，在高糖条件下核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）活化，引起核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）表达增加，NLRP3与肾纤维化密切相关^［3-4］。WEN等^［5］研究证实，下调NF-κB/NLRP3信号通路能够减轻大鼠的肾纤维化。既往研究表明，五苓散具有利尿、降低血压、保护肾脏的作用^［6］。临床运用五苓散联合西药治疗DN较单纯西药治疗疗效更好，各项肾功能指标得到明显改善^［7］。五苓散可能通过抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞NF-κB活化，缓解肾纤维化^［8］。目前，五苓散对DN疗效的具体机制尚不明确，因此本实验以db/db小鼠为研究对象，探讨五苓散通过调控NF-κB/NLRP3通路抑制DN肾纤维化的作用机制，为中医药防治DN提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

db/db雄性小鼠24只，SPF级，体质量（39.66±2.46） g；db/m雄性小鼠8只，体质量（22.61±1.56） g。小鼠均为8周龄，均购自江苏华创信诺医药科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2020-0009，在福建中医药大学实验动物中心SPF级环境中饲养，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007。实验期间，普通饲料喂养，自由饮食进水，环境条件为温度22～25 ℃，空气流通，相对湿度60％～70％，12 h光照维持，昼夜循环。本实验方案经福建中医药大学实验动物伦理委员会批准（FJTCM IACUC 2022043）。

1.2 实验药物

五苓散组成：猪苓9 g，泽泻15 g，白术9 g，茯苓9 g，桂枝6 g。上述中药购于福建省第三人民医院，加水10倍量浸泡30 min后，煎煮1 h，过滤；再次加水10倍量，煎煮1 h，过滤；合并滤液，浓缩至含生药量为0.72 g/mL的药液，保存于4 ℃冰箱备用。

1.3 实验试剂

厄贝沙坦（货号：CHG0356，赛诺菲制药有限公司）；糖化血清蛋白（glycated serum protein，GSP）（货号：20230701）、24 h尿蛋白定量（24 hours urinary total protein，24 h-UTP）（货号：20230209）、总胆固醇（total cholesterol，TC）（货号：20220924）、甘油三酯（triglyceride，TG）（货号：2022 0926）、血肌酐（serum creatinine，SCr）（货号：2023 0404）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）（货号：20230404）均购自南京建成生物工程研究所；逆转录试剂盒（货号：RR047A）、PCR试剂盒（货号：RR420A）均购自日本TaKaRa公司；β-肌动蛋白抗体（货号：66009-1，美国Proteintech公司）；NF-κB p65抗体（货号：ab16502）、NLRP3抗体（货号：ab263899）均购自英国Abcam 公司。

1.4 实验仪器

Elx800酶标仪（美国Bio-Tek公司）；55i生物显微镜（日本尼康公司）；ChemiDoc MP凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；Mini-PROTEAN Tetra电泳槽（美国Bio-Rad公司）；DYY-6C电泳仪（北京市六一仪器厂）。

2 实验方法

2.1 分组及给药

24只8周龄db/db小鼠和8只8周龄db/m小鼠，适应性饲养1周后，按体质量随机分组进行干预，分别为模型组、五苓散组、厄贝沙坦组，db/m小鼠为正常组。各组分别灌胃给药，根据人和小鼠体表面积等效剂量比值换算，五苓散组给予五苓散7.2 g/（kg·d），厄贝沙坦组给予厄贝沙坦22.5 mg/（kg·d），正常组和模型组小鼠给予等体积生理盐水。4组小鼠每天灌胃1次，连续给药8周。

2.2 样本采集

给药8周后，将小鼠放入代谢笼中，禁食不禁水，收集24 h尿液，用于检测24 h-UTP。称取小鼠体质量，给予2%戊巴比妥钠（10 mL/kg）麻醉后眼眶采集血液样本，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，分离出血清，保存于-80 ℃冰箱，用于检测SCr、BUN、GSP、TG及TC。将小鼠处死后，取出肾脏组织，生理盐水清洗，一部分置于4%多聚甲醛中固定，用于Masson染色；另一部分-80 ℃保存，用于Western blot和qPCR检测。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 一般情况

观察4组小鼠精神、对外界刺激反应、进食、皮毛光泽及排便排尿等情况；治疗期间每周监测体质量。

2.3.2 生化检测

收集的尿液用尿蛋白检测试剂盒测定24 h-UTP；血清测定肾功能指标SCr和BUN，血糖相关指标GSP，血脂相关指标TG及TC含量。

2.3.3 肾脏组织病理学观察

肾脏组织石蜡包埋、切片，经Masson染色、脱水、透明、封片，在光学显微镜下观察各组肾脏病理学改变。

2.3.4 qPCR法检测肾脏组织中NF-κB p65、NLRP3 mRNA的表达

用TriZol提取肾脏组织总RNA，微量核酸蛋白分析仪测量RNA浓度和纯度，经逆转录试剂盒合成cDNA，使用PCR试剂盒进行扩增反应；PCR反应体系为25 μl，扩增条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，循环40次。采用2^-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。PCR引物由福州尚亚生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

2.3.5 Western blot检测肾脏组织中NLRP3、NF-κB p65蛋白表达量

取各组肾脏，在液氮环境研磨成粉末，加入适量蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min，经低温高速离心机离心，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取蛋白样本上样，以SDS-PAGE凝胶电泳，湿转至PVDF膜、室温封闭，分别加入一抗NLRP3（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、β-actin（1∶25 000），4 ℃ 孵育过夜；TBST漂洗后加入二抗室温孵育1 h，之后利用TBST漂洗3次，经电化学发光液（ECL）显影，观察结果。用Image Lab图像分析软件进行目的蛋白条带灰度值分析，以目的蛋白与β-actin的比值表示蛋白表达量。

2.4 统计学方法

采用SPSS 24.0统计软件分析数据。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时组间比较采用LSD-t法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 一般情况观察

正常组小鼠精神状态良好，对外界刺激感受灵敏，各种行为活动频繁，毛色光泽；模型组小鼠精神萎靡，对外界刺激感受迟钝，行动迟缓，毛色晦暗；五苓散组和厄贝沙坦组小鼠一般情况较正常组小鼠情况差，但较模型组有所改善。

3.2 4组体质量比较

见表2。

3.3 4组GSP水平比较

见图1。

3.4 4组24 h-UTP含量比较

见图2。

3.5 4组TG、TC指标比较

见图3。

3.6 4组SCr、BUN含量比较

见图4。

3.7 4组小鼠肾脏组织病理形态学比较

Masson染色结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肾小球体积增大，基底膜增厚，肾间质大量胶原纤维沉积。与模型组比较，五苓散组、厄贝沙坦组小鼠肾小球基底膜增厚明显改善，肾间质胶原纤维沉积明显减少。见图5。

3.8 4组肾脏组织NLRP3、NF-κB p65 mRNA相对表达水平比较

见表3。

3.9 4组肾脏组织NLRP3、NF-κB p65蛋白表达量比较

见表4、图6。

4 讨　论

中医学认为DN属“消渴”范畴，继发“水肿”“胀满”“尿浊”“关格”等，主要病位在肾，与肝、脾的功能障碍相关^［9］。《圣济总录》曰：“消渴病久，肾气受伤，肾主水，肾气虚衰，气化失常，开阖不利，能为水肿。”长期肾功能减退，会引起低蛋白血症和水钠潴留，最终导致全身水肿^［10］。五苓散是《伤寒论》中化气利湿的名方，由猪苓、茯苓、白术、泽泻和桂枝组成。以泽泻为君药，甘淡入肾、膀胱经，渗湿利水；以猪苓、茯苓为臣药，三者合用，增强渗湿利水功效；佐以白术、桂枝，白术性味苦温，健脾益气，燥湿利水，桂枝性味甘辛，温阳化气以行水液，助三焦行气利水。诸药合用，起到调节水液代谢的作用^［11-12］。

DN引起的肾纤维化与多种途径相关，包括氧化应激、炎症反应、晚期糖基化终产物的产生和生长因子介导的反应。其中，高糖状态下持续存在的炎症反应能够加速肾纤维化的进展^［13］。在DN炎症反应中，NOD样受体（NLRs）、Toll样受体（TLRs）、NF-κB等炎症信号通路激活，炎症介质大量释放，引起炎症细胞浸润^［14］。同时，炎症反应引起上皮细胞-间充质转分化（EMT）、成纤维细胞转化为肌成纤维细胞以及成纤维细胞募集，这些变化会引起细胞外基质异常沉积，从而促进肾纤维化^［15］。NF-κB是参与炎症反应的关键因素之一，可被多种DN炎症介质激活。在DN中，NLRP3前体蛋白的表达在NF-κB被激活后增加，随后在多种因素干预下激活NLRP3蛋白寡聚化，从而产生NLRP3炎症小体，在DN微环境中，炎症小体活化，最终导致炎症反应，促进肾纤维化^［16］。因此，通过抑制NF-κB/NLRP3或能够防治DN肾纤维化，改善肾功能。

目前，以五苓散干预糖尿病小鼠研究治疗DN肾纤维化的实验相对较少，诸多防治机制还未明确，对其深入研究具有一定科学意义。实验采用的db/db小鼠是由于基因突变引起的先天肥胖型2型糖尿病小鼠，目前广泛应用于DN研究^［17］。该小鼠在出生10 d即出现高胰岛素血症，8周时蛋白尿排泄增加，8～12周肾脏出现肾小球肥大、肾小球基底膜增厚、系膜基质增大等病理表现^［18］。

本实验研究结果表明，与正常组相比，模型组小鼠GSP、BUN、SCr、24 h-UTP、TG和TC含量显著升高（P＜0.05）；病理形态学可见肾小球体积增大，基底膜增厚，胶原纤维大量沉积；肾组织中NF-κB p65、NLRP3蛋白和mRNA表达升高（P＜0.05）。与模型组比较，五苓散干预后能够显著降低db/db小鼠GSP、BUN、SCr、24h-UTP、TG和TC含量（P＜0.05），肾脏病理形态得到改善，肾组织中NF-κB p65、NLRP3 mRNA相对表达水平和蛋白表达量均下降（P＜0.05）。因此，五苓散可能通过降低GSP、BUN、SCr、24h-UTP、TG、TC含量，抑制NF-κB/NLRP3炎症信号通路，减轻炎症反应，缓解DN肾纤维化。厄贝沙坦是一种选择性血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）受体拮抗剂，主要用于控制尿蛋白排泄，临床治疗指南中也推荐将ARB类药物用于治疗DN^［19-20］。本实验以厄贝沙坦作为阳性对照组来评估五苓散的治疗效果。

综上所述，五苓散可能通过抑制NF-κB/NLRP3信号通路，进而改善肾纤维化。DN发病机制复杂多样，五苓散除作用于NF-κB/NLRP3信号通路，还可能干预其他信号通路，共同起到防治DN肾纤维化的作用，这需要后期实验进一步验证，以期为临床运用五苓散治疗DN提供深入的科学依据。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81973827)

福建省自然科学基金项目(2021J01890)

福建省大学生创新创业训练计划项目(S202210393019)

福建省大学生创新创业训练计划项目(202210393012)