基于液相色谱-质谱联用技术探讨电针对高脂血症大鼠胆汁酸代谢的影响

摘要

目的 探讨电针对高脂血症大鼠胆汁酸代谢的影响。 方法 将30只6周龄雄性清洁级SD大鼠采用数字随机表法分为对照组10只、高脂组20只，分别予普通饲料和高脂饲料喂养，连续10周。测定血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）值以验证高脂血症建模成功。随后将高脂组采用随机数字表法分为模型组和电针组各10只，电针组每日电针15 min，取单侧足三里、内庭穴，每日1次，对照组和模型组每日束缚固定15 min，连续30 d。电针前后眼眶静脉采血，全自动生化分析仪法检测TG、TC、LDL-C、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及血清总胆汁酸（TBA）水平。电针疗程结束后处死大鼠，取肝脏组织样品，运用液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术检测各组代谢物含量。采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、变量权重值（VIP）评分对模型组vs对照组，电针组vs模型组进行差异分析；将差异分析得到的代谢物并集，进行层级聚类分析，通过子聚类趋势变化，分析得到模型组vs对照组和模型组vs电针组变化趋势相反的子聚类代谢物，以验证电针治疗效应。创建子聚类代谢物并集，利用KEGG数据库对该并集进行通路富集分析，以确定受影响的代谢通路。 结果 与模型组比较，电针组干预后血清TG和TBA值均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，电针组中有61个代谢物明显上调，101个代谢物明显下调，其中包括牛磺酸上调和甘胆酸均下调（P＜0.05）；筛选出的4个子聚类代谢物创建并集，主要富集在初级胆汁酸生物合成、次级胆汁酸生物合成、胆固醇代谢等代谢通路，其中初级胆汁酸生物合成（P＝0.00）和次级胆汁酸生物合成（P＝0.00）显著富集。 结论 高脂饮食诱发的大鼠血脂异常与胆汁酸途径有关，电针足三里、内庭可能经由该途径起降脂作用。

Graphical abstract

关键词

高脂血症 / 足三里 / 电针 / 胆汁酸代谢 / 液相色谱-质谱

高脂血症是心脑血管疾病发病的高危因素之一，动脉粥样硬化性为主的心血管疾病（如缺血性心脏病和缺血性脑卒中等）是我国城乡居民第1位死亡原因，占死因构成的40%以上。流行病学、遗传学及临床干预研究均提供了充分证据，上述疾病的致病性危险因素为血脂异常^［1］。对高脂血症发病机制及治疗方法内在机制的研究，成为科研工作者面临的严峻任务。血脂异常属中医学“痰湿”“积聚”^［2］，总属本虚标实，本虚主要指肝、脾、肾三脏虚损，标实指痰浊、瘀血，临床以痰瘀互结多见。针刺足三里穴可起到健脾化湿泻热的作用，除胃肠积热，增进传导运化。

前期实验已验证电针降脂有效，拟推进更深层次的效应机制研究^［3-5］。代谢组学作为强大科研工具，通过高通量筛查技术全方位且系统性检测组织样品中的代谢物，展现不同状态下的体内代谢变化，为针灸等中医疗法的效果评价开拓了全新视角^［6-7］。本研究运用液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）联用技术对大鼠肝脏样本进行数据采集，再运用代谢组学数据库KEGG查找对比分析，探索电针对高脂血症大鼠肝脏代谢谱的影响，结合电针效应，探讨可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

清洁级健康SD大鼠30只，雄性，6周龄，体质量（150±10） g，购自杭州医学院，动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002，饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2020-0002。实验室恒温、恒湿，温度（22±1）℃、湿度50%，全天通风，大鼠每日光照12 h，正常饲养。本实验已通过福建省中医药科学院动物伦理委员会审批（审批号：FJATCM-IAE C 2022009）。

1.2 实验试剂

高脂饲料（北京华阜康生物科技股份有限公司）；甘油三酯（TG）测定试剂盒（深圳雷杜生命科技公司，货号：20210923）；总胆固醇（TC）测定试剂盒（深圳雷杜生命科技公司，货号：20210913）；高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测定试剂盒（深圳雷杜生命科技公司，货号：20211019）；低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测定试剂盒（深圳雷杜生命科技公司，货号：20211020）；TBA测定试剂盒（深圳雷杜生命科技公司，货号：20210908）。

1.3 实验仪器

华佗牌SDZ-Ⅱ型电子针疗仪和0.25 mm×13 mm针灸针（苏州医疗用品有限公司）；DW-86L626超低温冰箱（青岛海尔股份有限公司）；ALLEGRA 64R型高速冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司）；Chemray 800型全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科技公司）；New Classic MS电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；控温超声波清洗机-10L（宁波新芝生物科技股份有限公司）；多样品冷冻研磨仪（上海万柏生物科技有限公司）；台式快速离心浓缩干燥器（太仓市华美生化仪器厂）；氮气吹扫仪（上海净信实业发展有限公司）；UHPLC液相色谱系统和质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

2 实验方法

2.1 动物造模与分组

采用高脂饮食饲喂法造模高脂血症模型，所有大鼠适应性喂养1周后，随机数字表法分为对照组10只和高脂组20只。对照组予普通饮料，高脂组给予高脂饲料喂养10周。眼眶静脉采血，测定血清TG、TC、LCL-C值以验证高脂血症建模成功。造模结束后，将高脂组大鼠按照随机数字表法分为电针组和模型组各10只。电针组后续采用电针干预。电针组和模型组在整个电针干预期继续给予高脂饲料喂养。

2.2 干预方法

高脂血症大鼠造模成功后，将电针组大鼠置入大鼠固定器中进行固定，对大鼠穴位进行定位，穴位选定为足三里与内庭配伍，定位方法参照文献［8］。常规消毒，毫针直刺穴位，行平补平泻手法，1 min后接通电针仪，电针参数：疏密波，频率2/10 Hz，强度1～2 mA。刺激强度以针柄微微颤动为宜，电针15 min，每日1次，双下肢交替，连续30 d。每日电针同时将对照组和模型组大鼠也置入大鼠固定器中，束缚固定15 min。

2.3 取材

电针前后从大鼠的眼眶静脉丛中采血。所有SD大鼠在抽血前禁食24 h以上。所采集的血液在室温静置分层后，上清液用离心机4 000 r/min分离，在1.5 mL EP管中离心10 min。将上清液储存在低温冰箱。依据大鼠体质量计算用药比例0.5 mL/100 g，取20%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉放血处死。剪开腹腔，切取大小约0.5 cm³的肝脏组织样品，迅速置入1.5 mL EP管中，转移到-80 ℃低温冰箱暂存。

2.4 观察指标

2.4.1 血脂及胆汁酸测定

取出血清，加样上机于全自动生化分析仪进行检测。检测指标为TG、TC、HDL-C、LCL-C及TBA值，分别采用对应的测定试剂盒。

2.4.2 肝脏组织样品LC-MS联用技术测定

肝脏组织样品委托上海美吉生物医药科技有限公司检测。① 样品处理：精确称取50 mg样品至2 mL离心管中，加入1颗直径6 mm的研磨珠；加入400 μL提取液［甲醇∶水＝4∶1（V∶V），含0.02 mg/mL的内标（L-2-氯苯丙氨酸）］；冷冻组织研磨仪-10 ℃研磨6 min，频率50k Hz；低温超声仪提取5 ℃ 30 min，频率40 kHz；将样品静置于-20 ℃低温冰箱30 min；低温离心机4 ℃离心15 min，转速13 000×g；移取上清液至带内插管的进样小瓶中进行LC-MS测定；另外，每个样本分别移取20 μL上清液，混合后作为质控样本。② LC-MS测定：采用UHPLC液相色谱系统和质谱仪。色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm；Waters，Milford，USA）；流动相A为95%水＋5%乙腈（含0.1%甲酸），流动相B为47.5%乙腈＋47.5%异丙醇＋5%水（含0.1%甲酸），进样量为2 μL，柱温为40 ℃。质谱条件：样品经电喷雾电离，分别采用正、负离子扫描模式采集质谱信号。③ 质控样本（quality control，QC）由所有样本的提取液等体积混合制备而成，每个QC的体积与LC-MS测定样本相同，用相同的方法处理和检测，在仪器分析的过程中，每5～15个分析样本中插入1个QC样本，以考察整个检测过程的稳定性。

2.4.3 预处理数据

将LC-MS测定得到的原始数据导入代谢组学处理软件Progenesis QI进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐等，最终得到含保留时间、质荷比和峰强度等信息的数据矩阵。其后采用该软件进行特征峰搜库鉴定，将质谱信息与代谢数据库进行匹配，质谱质量误差设置为＜10 ppm，同时根据二级质谱匹配得分鉴定代谢物。主要数据库为http：//www.hmdb.ca/、https：//metlin.scripps.edu/等主流公共数据库以及美吉公司自建的数据库。

2.4.4 云平台分析

上述预处理后的数据上传至美吉生物云平台（https：//cloud.majorbio.com）分析。对模型组vs对照组，电针组vs模型组进行代谢物差异分析，正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）对数据的可靠性进行初步判定，通过200次置换检验对OPLS-DA模型进行验证，确保未发生过拟合。基于OPLS-DA模型得到的变量权重值（VIP）和Student's T检验P值来确定差异代谢物，筛选标准为VIP＞1且P＜0.05。将差异分析得到的代谢物并集，进行层级聚类分析，通过子聚类趋势变化，分析得到模型组vs对照组和模型组vs电针组变化趋势相反的子聚类代谢物，以验证电针治疗效应。创建子聚类代谢物并集，利用KEGG数据库对该并集进行通路富集分析，以确定受影响的代谢通路。KEGG通路富集分析中，P＜0.05为此通路存在显著富集情况。

2.5 统计学方法

数据处理使用SPSS 23.0软件进行统计学处理。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，2组间比较采用配对样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 3组电针前后血脂和TBA比较

经过30 d电针干预后，与模型组比较，电针组TG和TBA水平降低更为明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

3.2 LC-MS非靶向代谢组学数据结果

3.2.1 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）分析

构建模型组vs对照组、电针组vs模型组的差异代谢物OPLS-DA模型，可见置换验证的R²与Q²均小于模型的原始值，且模型的R²均＞0.5，说明构建的OPLS-DA模型稳定。在模型未过拟合的基础上，可以看出模型组与对照组、电针组的肝脏代谢轮廓皆存在一定的差异。见图1-4。

3.2.2 差异统计和火山图

与对照组比较，模型组大鼠有99个代谢物上调表达，147个代谢物下调表达；其中包括牛磺酸下调和甘胆酸上调；与模型组比较，电针组大鼠有61个代谢物上调表达，101个代谢物下调表达，其中包括牛磺酸上调和甘胆酸下调。见图5-6。

3.2.3 变量权重值（VIP）评分比较

根据OPLS-DA模型的加权系数，使用VIP评分对肝脏代谢产物在电针组和模型组的鉴别贡献进行排序。可见多种代谢物在3组间差异具有显著性，包括甘胆酸和牛磺酸，见图7。

3.2.4 代谢物聚类分析

对上述所有差异分析代谢物进行层级聚类分析，通过子聚类趋势变化，分析得到模型组vs对照组和模型组vs电针组变化趋势相反的子聚类代谢物有4个。见图8-9。

3.2.5 KEGG通路富集分析

对筛选出的4个子聚类代谢物创建并集进行通路富集分析，对P值在前20的通路进行气泡图形式展示。结果表明，上述代谢物并集主要富集在初级胆汁酸生物合成、次级胆汁酸生物合成、胆固醇代谢等代谢通路，其中初级胆汁酸生物合成（P＝0.000 085 03）和次级胆汁酸生物合成（P＝0.002 076）显著富集，这与胆汁酸途径密切相关。见图10。

4 讨　论

中医学中无“高脂血症”这一病名，根据其症状表现可将其归属于“痰湿”“积聚”范畴。高脂血症被视为膏脂代谢失常的病症，常由于过食肥甘厚味，从而肝、脾、肾脏腑功能紊乱，使痰浊留滞于血脉，最终脉道壅塞，瘀血由生，故其病机为可概括为气滞血瘀、痰瘀互结^［9］。针刺疗法疗效确切且毒副作用小，可以通过调节机体的气机，推动血液及津液的运行，祛除痰浊和瘀血。脾主运化，中医治疗高脂血症时大多采取健脾利湿化痰的治则，即以脾、胃二经为主取穴。足三里为胃经合穴，健脾和胃，运化水湿，内庭为胃经之荥穴，二者合用胃气调和，消纳之机得以畅利。课题组既往研究已证实上述二穴配伍治疗确实有效降脂，因此继续选用此二穴推进电针降脂机制研究。

高脂血症主要症状是脂类代谢异常。众所周知，脂类代谢与胆汁酸密不可分，胆汁酸（bile acids，BAs）作为促进营养吸收的洗涤剂和调节营养代谢的激素，是生理活动的关键调节因子。BAs可作为信号分子，激活多种组织中的多个核和膜受体介导的信号途径，调节葡萄糖，脂质稳态，炎症和能量消耗^［10］。调节BA合成和组成以调节BA信号传导是代谢性疾病治疗的潜在策略。对高脂血症的治疗机制研究从胆汁酸相关途径入手具有明确依据。

研究表明，通过激活胆汁酸的重要感受器，可引起胆汁酸库的变化，进而可能引起血脂代谢失衡^［11-13］。例如，BAs激活法尼醇X受体和其他核受体可以限制肝脏产生脂肪的能力，通过抑制TG的产生和促进TG的消除以及脂肪酸的氧化分解来降低LDL-C和TG的水平^［14］。本研究显示高脂血症大鼠经过电针治疗后，血清TG和总胆汁酸水平降低，血清HDL-C差值升高，LC-MS非靶向代谢组学显示电针组与模型组两者间的肝脏代谢轮廓发生了较为明显的变化，多种胆汁酸代谢产物差异有统计学意义。进一步对与对照组具有相反趋势的差异代谢物进行KEGG通路富集分析，结果显示电针干预对初级和次级胆汁酸代谢途径都有显著影响，说明电针降脂很可能经由胆汁酸代谢途径环节起作用。

本次实验中具有明显差异的胆汁酸代谢物包括甘胆酸和牛磺酸，这2种差异代谢物可能作为电针改善高脂血症的潜在生物标志物。有研究者证实补充牛磺酸可以起到调节高脂饮食小鼠的糖脂代谢水平的作用^［15］。另一研究亦显示给予牛磺酸对脂肪变性肝细胞的糖脂代谢可起改善作用^［16］。ZHOU等^［17］研究表明，通过调节代谢产物如甘胆酸、牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸以及涉及的胆汁酸代谢途径和胆固醇代谢途径，可使高脂血症小鼠肝脏中的胆汁酸代谢产物正常，从而缓解高脂血症。上述研究与我们的实验结果相似，即高脂血症大鼠经电针后，血脂代谢明显改善，牛磺酸表达上调，甘胆酸表达下调，可见胆汁酸代谢途径深度参与了电针降脂的一系列体内过程。

综上所述，本研究采用常规的血清生化分析方法和LC-MS检测平台的非靶向代谢组学技术来评价电针治疗高脂血症大鼠胆汁酸代谢的差异，从组学的角度分析了胆汁酸在大鼠肝脏中的代谢反应，为了解电针降脂机制提供了重要的理论依据。鉴于胆汁酸池是宿主肝细胞生物合成和胃肠道微生物群代谢的协同结果，在电针作用机制的探讨中，肠道微生物群参与胆汁酸的代谢及其在肠肝循环中的角色，将成为本课题组进一步的研究方向。

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基金资助

福建省属公益类科研院所基本科研专项项目(2021R 1003001)

福建省自然科学基金项目(2021J01909)

国家自然科学基金项目(81603543)