肾康灵胶囊的急性毒性和亚急性毒性实验研究

Experimental Study on the Acute and Subacute Toxicity of Shenkangling Capsule

摘要

目的 通过肾康灵胶囊对小鼠和大鼠进行急性和亚急性毒性研究，初步评价肾康灵胶囊的安全性，为其临床安全用药提供必要的毒理学依据。 方法 急性毒性实验选用8周龄的SPF级昆明种小鼠20只，采用最大耐受剂量法，即一次性灌胃127.6 g/kg肾康灵胶囊后，连续观察14 d，记录中毒表现、死亡情况、心、肝、肾、胃、十二指肠等器官组织病理变化。亚急性毒性实验选用8周龄的SPF级SD大鼠80只，雌雄各半，按性别分别随机分为低、中、高剂量组和对照组，低、中、高剂量组分别灌胃10.2、20.4、30.6 g/kg肾康灵混悬液，每天1次，连续灌胃30 d，分别于第0、7、14、21、28天观察记录4组大鼠的一般情况、进食量和体质量，大鼠处死后检测红细胞、血红蛋白、白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和血小板等血液指标，检测白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）和血糖（Glu）等血清生化指标，测定心、肝、肾、胃和十二指肠的脏器系数，并行HE染色观察组织形态学改变。 结果 ① 急性毒性实验中，未发现动物死亡，一般情况良好，心、肝、肾、胃、十二指肠等脏器未见明显异常，小鼠最大耐受给药量为127.6 g/kg。② 亚急性毒性实验中，4组大鼠的体质量、红细胞、血红蛋白、白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、ALB、ALT、AST、TC、BUN及心、胃、十二指肠的脏器系数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），部分组别的血小板、TP、TG、Cr、Glu、肝、肾的脏器系数差异有统计学意义（P＜0.05），但无剂量-反应关系；与对照组比较，高剂量组TBIL显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论 肾康灵胶囊在最大耐受剂量下单次给药对小鼠无毒副作用，低、中剂量用药30 d对大鼠没有明显毒性，但高剂量用药时可能对大鼠的胆红素代谢有一定影响。

Abstract

Objective To make a preliminary safety evaluation of shenkangling capsule, and provide the necessary toxicological basis for its clinical medication safety by conducting acute and subacute toxicity studies on mice and rats. Methods In the acute toxicity experiment, 20 8-week-old SPF Kunming strain mice were selected and administrated by the maximum tolerated dose method, i.e, 127.6 g/kg shenkangling capsule was given by gavage at one time, and the toxic manifestations, death status, histopathological changes of heart, liver, kidney, stomach, duodenum were recorded consecutively for 14 days. In the subacute toxicity experiment, 80 8-week-old SPF SD rats (half male and half female) were randomly divided into low dose, medium dose, high dose and control group, the low, medium, and high dose groups were gavaged with 10.2, 20.4, and 30.6 g/kg shenkangling suspension respectively, once a day, for 30 days. The general conditions, food intake, and body weight of the rats in the 4 groups were observed and recorded on days 0, 7, 14, 21, and 28. After the rats were sacrificed, the hematological indexes such as red blood cells, hemoglobin, white blood cells, neutrophils, lymphocytes, and platelets were detected, serum biochemical indexes including albumin (ALB), total protein (TP), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), total bilirubin (TBIL), triglycerides (TG), total cholesterol (TC), creatinine (Cr), blood urea nitrogen (BUN), and blood glucose (Glu) were detected. The organ coefficients of heart, liver, kidney, stomach and duodenum were measured, and the HE staining was performed to observe histomorphological changes. Results ① In the acute toxicity experiment, no animal death were observed, and the general conditions were good. No significant abnormalities were found in organs such as the heart, liver, kidney, stomach, and duodenum, and the maximum tolerated dose for mice was 127.6 g/kg. ② In the subacute toxicity experiment, there were no significant differences in body weight, red blood cells, hemoglobin, white blood cells, neutrophils, lymphocytes, ALB, ALT, AST, TC, BUN, and organ coefficients of the heart, stomach, and duodenum among the 4 groups (P>0.05). However, statistical differences were observed in platelets, TP, TG, Cr, Glu, and organ coefficients of the liver and kidney in some groups (P<0.05), but no dose-response relationship was observed. Compared with the control group, TBIL significantly increased in the high dose group, with a statistically significant difference (P<0.05). Conclusion A single administration of shenkangling capsule at the maximum tolerated dose had no toxic or side effects on mice. There was no significant toxicity on rats in the low and medium dose groups for 30 days intervention, but high dose group may have a certain impact on bilirubin metabolism in rats.

Graphical abstract

关键词

肾康灵胶囊 / 毒理学，急性毒性 / 亚急性毒性 / 安全性评价

Key words

shenkangling capsule / toxicology / acute toxicity / subacute toxicity / safety evaluation

肾康灵是由六味地黄丸加行气活血的中药组成，包含黄芪、生地黄、山茱萸、山药、太子参、茯苓、泽泻等14味中药材，有清热解毒、健脾益气之功效，主要用于治疗脾虚湿困，肾虚血瘀，具有滋补肾阴、温养肾阳、活血瘀化行气之功效^［1-3］。目前临床上常将其制成颗粒剂或冲剂，用于治疗急慢性肾炎、肾病综合征^［4-5］或小儿频发性肾病综合征^［6］。肾康灵胶囊是在我院院内制剂肾康灵颗粒（福建中医药大学附属人民医院，批准文号：闽药制字Z06106049）的基础上研发出来的新剂型^［7-8］，具有药效稳定、不含糖、便于携带、储存和使用等优点，特别适合糖尿病肾病患者使用。本研究旨在对肾康灵胶囊的毒理学安全性进行初步评价，为临床安全用药提供必要的毒理学依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

8周龄的SPF级昆明种小鼠20只，雌雄各半，体质量（20±2）g。8周龄的SPF级SD大鼠80只，雌雄各半，体质量（100±10）g，均购自斯贝福（北京）生物技术有限公司［动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010］。饲养于福建中医药大学动物实验中心［许可证号：SYXK（闽）2019-0007］，饲养条件为温度20～26 ℃，湿度40%～70%。所有实验动物在试验前均适应性喂养7 d。动物实验遵守并执行中华人民共和国实验动物管理条例和动物实验伦理学的有关规定。

1.2 实验药物及制备

实验药物为肾康灵胶囊，由我院制剂室提供，临用前用蒸馏水配成混悬液，配制成按生药量的最大浓度6.38 g/mL。

1.3 主要试剂

总胆红素（TBIL）试剂盒（货号：70182）、白蛋白（ALB）试剂盒（货号：70113）、总蛋白（TP）试剂盒（货号：70112）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（货号：70110）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（货号：70111）、总胆固醇（TC）试剂盒（货号：70101）、甘油三酯（TG）试剂盒（货号：70102）均购自山东博科生物产业有限公司；肌酐（Cr）比色法测试盒（货号：E-BC-K188-M）、尿素氮（BUN）比色法测试盒（货号：E-BC-K183-M）均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；苏木素染液（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZLI-9610）；Scott蓝化液（货号：G1865）、伊红染色液（货号：G1100）均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.4 主要仪器

血液分析仪（深圳市锦瑞生物科技股份有限公司）；血糖测试仪（瑞士Roche公司）；自动组织脱水机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；石蜡包埋机、切片机、摊片机均购自德国Leica公司；生物显微镜（日本Olympus Corporation公司）。

2 方　法

2.1 急性经口毒性试验

SPF级昆明种小鼠随机分为对照组和给药组，2组大鼠禁食不禁水4 h后进行实验。采用最大耐受剂量法^［9-10］，给药组按20 mL/kg一次性经口灌胃，对照组给予等体积蒸馏水，连续观察14 d，处死动物取心、肝、肾、胃、十二指肠等重要脏器，观察其大小、形态、颜色和质地等变化，并记录小鼠死亡情况。

2.2 亚急性毒性试验

将SPF级SD大鼠按性别分为雄性组和雌性组各40只，雄性组和雌性组分别随机分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组各10只，低、中、高剂量组分别灌胃10.2、20.4、30.6 g/kg肾康灵混悬液（相当于成人临床给药剂量的12、24、36倍），每天1次，连续灌胃30 d，对照组给予等体积蒸馏水灌胃。实验期间大鼠正常进食及饮水，分别于第0、7、14、21、28天观察大鼠的一般情况、进食量并记录体质量。实验结束后所有大鼠先统一禁食16 h，在完全麻醉（10%水合氯醛）的条件下进行颈椎脱臼处死，再行腹主动脉采血用于红细胞、血红蛋白、白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和血小板等血液指标及ALB、TP、ALT、AST、TBIL、TG、TC、Cr、BUN和Glu等血清生化指标检测。随即对大鼠进行解剖，摘取心、肝、肾、胃和十二指肠等主要器官进行称重，并计算脏器系数。再经4%的多聚甲醛固定后，用石蜡包埋组织，切片后进行苏木素-伊红（HE）染色，于光学显微镜观察组织病理学变化^［11］。

脏器系数＝脏器质量/体质量×100%

2.3 统计学方法

采用SPSS 26.0统计软件进行分析。计量资料符合正态分布采用（\overline{x}±s）表示，两两组内比较采用配对样本t检验，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用重复测量方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 急性经口毒性实验

SPF级昆明种小鼠经单次灌胃127.6 g/kg肾康灵胶囊内容物混悬液后精神状态良好，体毛光滑整洁，行动活跃，饮食饮水正常，未见明显中毒症状，连续观察14 d无动物死亡。与对照组比较，给药组的心、肝、肾、胃、十二指肠等主要脏器的大小、形态、颜色和质地未见异常改变。

3.2 亚急性毒性实验

3.2.1 4组大鼠一般情况

4组大鼠实验期间体毛颜色正常，精神状态良好，摄食量及食物利用率无明显变化，排便正常，高剂量组粪便略微黏稠，未见明显中毒症状，亦无死亡。

3.2.2 4组体质量变化比较

与对照组比较，第0、7、14、21、28天的低、中、高剂量组雄、雌大鼠体质量差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

3.2.3 4组大鼠血液指标变化比较

与对照组比较，低、中、高剂量组雌、雄鼠除血小板计数外，其余各项血液指标差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3.2.4 4组血清生化指标水平比较

见表3。

3.2.5 4组主要脏器系数变化比较

见表4。

3.2.6 4组主要脏器形态组织学变化

与对照组比较，低、中、高剂量组的心、肝、肾、胃和十二指肠等重要脏器的外观结构和组织形态无明显异常，无出血、肿胀、变色、结节、溃疡或其他可见的病理变化，各脏器组织的细胞结构完整，未见炎症浸润、细胞坏死、纤维化或其他异常病理改变，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

4 讨　论

肾康灵是福建中医药大学附属人民医院郑健主任运用20余年的临床验方，于2007年核准为院内制剂（肾康灵颗粒）批量生产。该方由六味地黄丸加行气活血中药组成，具有清热解毒、健脾益气、行气活血的功效，主要用于治疗急慢性肾炎和肾病综合征。肾康灵在临床上显示出良好的效果，尤其是与激素配合治疗小儿难治性肾病时，疗效优于单纯使用激素^［4］。与颗粒剂相较，肾康灵胶囊能够在保留药效的同时，具有携带方便、不吸潮、服用方便等优势^［12］。目前对肾康灵的临床疗效研究较多，但方中中药成分复杂，缺少对其安全性及不良反应的研究。急性毒性实验和亚急性毒性实验通过单次或多次给药，分别在14、30 d内连续观察动物的毒性反应和死亡情况，可以初步定性和定量评估药物的毒性强度，为其临床使用的安全性提供重要参考依据。

肾康灵胶囊对小鼠的急性毒性实验，采用最大耐受剂量法，一次性经口灌胃肾康灵胶囊，连续观察14 d，发现小鼠的一般情况良好，未发现动物死亡，肾康灵胶囊的最大耐受剂量＞127.6 g/kg，相当于成人临床给药剂量的104倍，属于实际无毒级。大鼠30 d亚急性毒性实验中，大鼠在给予低、中、高不同剂量的肾康灵胶囊后，体质量和心、肝、肾、胃、十二指肠等重要脏器的组织形态和脏器系数未见明显差异，尽管低剂量组雄鼠的肝/体比值，中剂量雄鼠的肝/体比值和肾/体比值有波动，但因无剂量-反应关系，因此认为其无生物学意义。个别组别大鼠的血小板计数、TP、TG、Cr和Glu指标上差异有统计学意义（P＜0.05），但这些指标的波动仍在正常范围内，且未表现出明确的剂量-反应关系，因此这些变化被认为无生物学意义。与对照组比较，高剂量组雄鼠的TBIL显著升高，且有剂量-反应关系，提示高剂量肾康灵胶囊可能对雄性大鼠的胆红素代谢有一定影响。高剂量组雄性大鼠的总胆红素出现异常升高，但TP、ALT和AST指标未显示明显异常，这表明胆红素升高的原因可能是非肝源性的或者轻微肝功能异常^［13］，需要进一步的研究来全面评估肾康灵胶囊对肝胆功能的影响。后续本课题组将进行大鼠慢性毒性试验研究，重点关注大鼠的肝胆代谢情况，以便更深入地了解肾康灵胶囊在肝胆功能方面的潜在影响。

综上，肾康灵胶囊在小鼠急性毒性实验和大鼠30 d亚急性毒性实验中呈现出较低的毒性水平，未观察到明显的毒性反应和器官损伤，但需要关注大剂量用药可能对肝胆功能存在影响。本研究结果为肾康灵胶囊的动物安全性提供了初步评价，为其在临床的安全应用提供依据。

参考文献

[1] 郑健，艾斯，林青，等. 中药肾康灵干预阿霉素肾病大鼠血蛋白质质谱表达的实验研究［J］. 中国中西医结合肾病杂志，2010，11（12）：1048-1053，1137.

[2] 艾斯，郑健，林青，等. 肾康灵调控系膜细胞炎性反应因子的机制研究［J］. 世界中医药，2015，10（2）：236-242.

[3] 艾斯，庄翔莉，颜水平，等. 肾康灵对慢性肾脏病小鼠肾损伤和自噬水平的影响［J］. 中国中医药信息杂志，2022，29（1）：80-84.

[4] 郑健，艾斯，林青，等. 基于CXCL16-MAPK信号通路的肾康灵干预儿童原发性肾病综合征的机制研究［J］. 中国科技成果，2019，20（10）：13-14.

[5] 张智. 肾康灵对肾虚血瘀型慢性肾脏病2-4期患者血TGF-β1和BMP-7的影响［J］. 吉林中医药，2020，40（10）：1319-1322.

[6] 范雪琪. 中药肾康灵干预小儿原发性肾病综合征（单纯型）对血清IL-17、TGF-β1、NF-κB的影响［D］. 福州：福建中医药大学，2022：7-17.

[7] 吴学辉，肖钦，肖淋，等. 正交试验优选肾康灵胶囊中小檗碱的提取工艺［J］. 海峡药学，2016，28（11）：29-32.

[8] 程心玲，肖淋，肖钦. 优选肾康灵胶囊的壳聚糖絮凝法澄清工艺［J］. 海峡药学，2015，27（12）：20-22.

[9] 杜肖，王建农，韩林，等. 安特逍胶囊对啮齿动物的急性及长期毒理学研究［J］. 中国药师，2019，22（2）：327-332.

[10] 蔡拓，姜楠，吴军，等. 金花茶花朵水溶性提取物毒理学安全性评价［J］. 毒理学杂志，2023，37（1）：62-65，69.

[11] 刘佳，李强，郭莉，等. 地黄提取物的急性毒性和亚慢性毒性试验研究［J］. 中国畜牧兽医，2017，44（11）：3372-3378.

[12] 郑小娟，肖淋，洪海棉，等. 肾康灵胶囊的质量检查和定性分析［J］. 海峡药学，2023，35（5）：57-59.

[13] 李飞，陆伦根. 肝功能异常的评估及临床意义［J］. 临床肝胆病杂志，2015，31（9）：1543-1546.

基金资助

福建省科技厅引导性课题(2021Y0033)