柴胡皂苷D抑制肝星状细胞活化及PSME3表达的实验研究

摘要

目的 观察柴胡皂苷D对人肝星状细胞LX-2活化及蛋白酶体激活子亚基3（PSME3）mRNA和蛋白表达的影响，探讨柴胡皂苷D治疗肝纤维化的可能作用机制。 方法 将生长期良好的LX-2细胞分为正常组、模型组和柴胡皂苷D组，空白组不加药物，模型组以10 ng/mL转化生长因子-β1（TGF-β1）处理，柴胡皂苷D组以1 μmol/L柴胡皂苷D＋10 ng/mL TGF-β1联合处理24 h，采用CCK8检测各组细胞活力，qPCR和Western blot检测纤维化指标α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、1型胶原蛋白（COL1A1）和PSME3 mRNA相对表达水平和蛋白表达量。 结果 与正常组比较，模型组细胞增殖活力显著增加（P＜0.05），α-SMA、COL1A1和PSME3的mRNA表达水平和蛋白表达量均显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，柴胡皂苷D组细胞增殖活力下降（P＜0.05），α-SMA、COL1A1和PSME3 mRNA表达水平和蛋白表达量均显著下降（P＜0.05）。 结论 柴胡皂苷D对LX-2细胞活化有抑制作用，其机制可能与抑制PSME3 mRNA表达水平和蛋白表达量有关。

Graphical abstract

关键词

肝纤维化 / 肝星状细胞 / 活化 / 柴胡皂苷D / 蛋白酶体激活子亚基3

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是各种因素导致肝损伤后，细胞外基质弥漫性过度沉积和分布异常的自身修复反应，是各种慢性肝病向肝硬化发展的关键步骤^［1］。肝纤维化在世界范围内普遍存在，其主要原因是病毒性肝炎、胆汁淤积、酒精性和非酒精性脂肪性肝病以及自身免疫性肝脏疾病导致的慢性肝损伤^［2］。肝纤维化会降低肝脏的整体功能——肝血流受阻，抑制肝再生，影响肝脏解毒、储存能量和清除感染的能力，如果治疗不当，会发展为肝硬化，最终增加患肝癌的概率^［3］。已有临床证据表明肝纤维化可发生逆转，但缺少有效的肝纤维化逆转方法及药物^［4］。

柴胡在治疗肝脏相关疾病方面有着很好的临床疗效^［5］。研究表明其活性成分柴胡皂苷D（SSD）可通过抑制炎症介质和抗脂质过氧化，进而减轻肝细胞损伤和缓解肝纤维化^［6］。此外，柴胡皂苷D可抑制肝星状细胞增殖和活化^［7］，但目前柴胡皂苷D抗肝纤维化的分子药理机制还不十分清楚^［8］。蛋白酶体激活子亚基3（PSME3）是新发现的蛋白酶体激活子复合体的亚基，其参与多种蛋白质降解过程，与转化生长因子-β1（TGF-β1）的合成与分泌密切关联。故本研究以TGF-β1诱导人肝星状细胞LX-2制备肝纤维化细胞模型，检测柴胡皂苷D干预后LX-2细胞增殖活力和活化及PSME3 mRNA和蛋白表达差异，探究其治疗肝纤维化的可能分子机制。

1 实验材料

1.1 实验细胞与药物

人肝星状细胞LX-2（货号：IM-H044）购自厦门逸漠生物科技有限公司；柴胡皂苷D（货号：B20150）购自上海源叶生物科技有限公司；TGF-β1（货号：10715209）购自美国Peprotech公司。

1.2 实验试剂

BCA蛋白定量试剂盒（货号：WB6501）、快速转膜液（货号：WB4600）、快速封闭液（货号：P30500）、一抗二抗通用抗体稀释液（货号：WB500D）均购自苏州新赛美生物科技有限公司；2×SYBR Green qPCR Mix（货号：AH0101）、SPARKscript Ⅱ RT Plus Kit（货号：AG0304）、RNA提取试剂盒（货号：AC0205）均购自山东思科捷生物技术有限公司；PMSF（货号：ST506）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（货号：P0015）、SDS-PAGE电泳液（Tris-Gly，Powder）（货号：P0014B）、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H＋L）（货号：A0208）均购自上海碧云天生物技术股份有限公司；细胞快速冻存液（货号：AC05L033）购自上海李记生物科技有限公司；血清（货号：F8318）购自美国Sigma公司；裂解液（货号：PC101）购自上海雅酶生物医药科技有限公司；DMEM高糖培养基（货号：SH30262.01）购自美国HyClone公司。

1.3 实验仪器

电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号：725-35）；转膜仪（北京六一生物科技有限公司，型号：725-35）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号：5417R）；水平离心机（上海安亭科学仪器厂，型号：Anke，TDL80-2B）；恒温烘箱（上海一恒科学仪器有限公司，型号：GHP-9050）；RNA逆转录仪（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：A37834）；组织研磨仪（武汉塞维尔生物科技有限公司，型号：KZ-Ⅲ-FP）；实时荧光定量PCR仪（德国Leica公司，型号：7500 Fast Real-Time）。

2 实验方法

2.1 细胞培养及分组处理

LX-2细胞培养所用培养液为89% DMEM＋10%胎牛血清＋1%双抗（青霉素/链霉素），培养条件为37 ℃、5% CO₂。将生长期良好的LX-2细胞分为正常组、模型组和柴胡皂苷D组。正常组用基础培养基培养，模型组以10 ng/mL TGF-β1处理，柴胡皂苷D组以1 μmol/L柴胡皂苷D＋10 ng/mL TGF-β1联合处理24 h后，收集LX-2细胞，用于α-SMA、COL1A1、PSME3指标检测。

2.2 CCK8检测细胞活力

将LX-2细胞稀释至所需密度2.0×10³个/孔，每孔100 μL接种于96孔培养板，轻轻晃动使细胞铺散均匀，置于37 ℃，5% CO₂恒温培养箱培养24 h。分别在转染0、24、48、72 h后，取出细胞培养板，每孔中加入10 μL CCK8试剂使其进行显色反应，轻轻晃动培养板混合均匀，置于37 ℃培养箱内，1 h后使用酶标仪测定各孔细胞在波长450 nm处的吸光度值（即OD值），0 h用于确定细胞实际的起始密度，以作为生长相对零点。计算各组OD值的平均值和标准差，并绘制折线图。

2.3 qPCR检测COL1A1、α-SMA和PSME3 mRNA表达水平

首先提取LX-2细胞mRNA并检测样品RNA纯度是否达标（OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值在1.8～2.0之间）。之后将mRNA逆转录为cDNA，得到的cDNA产物可立即用于qPCR反应。配制qPCR反应液，设置PCR反应程序。PCR循环（三步法）：① 预变性94 ℃，3 min；② 变性94 ℃，20 s；③ 退火60 ℃，20 s；④ 延伸72 ℃，30 s。其中②③④循环40次，确认扩增曲线和融解曲线，采用2^-ΔΔCt法分析mRNA表达量；ΔCt＝Ct（目的基因）－Ct（内参基因β-actin），每组实验设置3个复孔，重复实验3次，分析mRNA相对表达量。引物序列见表1。

2.4 Western blot检测α-SMA、COL1A1和PSME3的蛋白表达量

提取LX-2细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，放于100 ℃金属浴中加热10 min使蛋白样品完全变性。取30 μg蛋白样品加入10% SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后转膜；将转印的PVDF膜放在快速封闭液，室温下摇床封闭20 min。将膜放入已经稀释好的一抗GAPDH（1∶1 000）、α- SMA（1∶2 000）、COL1A1（1∶1 000）、PSME3（1∶1 000），4 ℃过夜。第2天，TBST冲洗3次，每次10 min；然后将膜置于HRP标记的二抗（1∶5 000）中，室温摇床上放置1 h。TBST冲洗3次，以凝胶成像仪成像显影。使用ImageJ图像分析软件进行结果分析。

2.5 统计学方法

采用SPSS 25.0统计软件对数据进行处理和分析。符合正态分布的计量资料以（\overline{x}±s）表示，两两组内比较采用配对样本t检验，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用重复测量方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 不同时间及不同TGF-β1浓度对细胞活化的影响

分别用5、10 ng/mL TGF-β1干预LX-2细胞24、48 h，qPCR检测显示纤维化指标α-SMA和COL1A1 mRNA表达水平，结果见图1。其中10 ng/mL TGF-β1干预24 h后，LX-2细胞α-SMA、COL1A1 mRNA表达水平上调最明显（P＜0.05），故选用10 ng/mL TGF-β1干预24 h进行后续实验。

3.2 3组细胞增殖活力比较

见图2。

3.3 3组细胞α-SMA、COL1A1和PSME3蛋白表达量比较

见图3-4。

3.4 3组细胞α-SMA、COL1A1和PSME3 mRNA相对表达水平比较

见图5。

4 讨　论

在各种因素导致肝损伤后，人肝星状细胞由静息状态转为活化状态，参与肝组织的自身修复。但由于细胞外基质弥漫性过度沉积和分布异常，往往会演化为肝纤维化，进而转化为肝肿瘤。因此，如何预防肝纤维化的发生及防止其进一步发展，是临床研究的热点。

柴胡皂苷D是中药柴胡的活性成分之一^［9］，可通过胱天蛋白酶-3依赖性/非依赖性途径和线粒体途径抑制肝星状细胞增殖，延缓哺乳动物肝纤维化的形成^［10］。柴胡皂苷D还可通过调节雌激素受体β/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体途径，降低纤维化标志物（COL1A1和α-SMA）表达水平减轻CCl₄诱导的肝纤维化^［11］；以及通过诱导自噬体形成，抑制肝星状细胞增殖^［12］；调节人G蛋白偶联雌激素受体1/自噬途径，减轻肝纤维化^［13］。目前研究发现，柴胡皂苷D可以降低纤维化相关基因的转录水平，抑制肝星状细胞活化和增殖^［14-16］。柴胡皂苷D还能够通过调节TGF-β/Smads信号通路，在抗肺纤维化，逆转肾近曲小管上皮细胞和抗心肌纤维化中发挥重要作用^［17-19］。

PSME3又称REGc、REGγ或PA28c，是蛋白酶体激活子复合体的一个亚基，在20S蛋白酶体激活和多种蛋白质降解过程中起着关键作用。研究显示，沉默PSME3能下调细胞周期蛋白B1（CDKB1）和细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）导致细胞周期停滞^［20］。研究已揭示PSME3在生理和病理状态下具有调节有丝分裂、免疫反应等重要功能，可以通过泛素非依赖和ATP非依赖途径降解多种蛋白，从而影响细胞周期^［21］。PSME3作为一种致癌基因，可以促进肿瘤细胞的增殖和转移。近年来，PSME3的异常过度表达已在多种癌症中被发现，包括胰腺癌、乳色素瘤、非小细胞肺癌、多发性骨髓瘤等^［22］。已有研究发现，PSME3可以促进细胞周期抑制剂p21的分解，从而刺激细胞增殖。此外，它还调节肿瘤的生物学功能，例如肿瘤血管的生成、肿瘤细胞的衰老和凋亡以及脂质和能量代谢^［23］。PSME3可通过降解激活蛋白-1（AP-1）调节胰腺癌细胞中TGF-β1的分泌，并促进胰腺星状细胞的增殖，调节胰腺纤维化^［24］。PSME3的下调会减少TGF-β1的分泌，TGF-β1有促进肝纤维化的作用，因此调控PSME3可能会影响TGF-β1进而影响肝星状细胞活化及肝纤维化。

本研究结果提示TGF-β1干预LX-2细胞，可以促进LX-2细胞的增殖活力和活化，而柴胡皂苷D处理能抑制LX-2细胞的增殖活力和活化。PSME3在模型组中表达明显增加，而在柴胡皂苷D组表达下调；表明PSME3可能影响LX-2细胞活化，同时柴胡皂苷D可以下调PSME3表达。综上所述，柴胡皂苷D可以抑制肝星状细胞的活化，可能与下调PSME3的表达水平有关。目前本研究针对柴胡皂苷D抑制LX-2细胞活化仅进行初步探讨，所涉及的分子药理机制有待后续深入研究。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2022J01845)

福建省大学生创新创业训练项目(202310393009)