白藜芦醇通过下调LRP5/6表达抑制小鼠乳腺癌4T1细胞增殖

摘要

目的 通过体外实验研究白藜芦醇（RES）抑制小鼠乳腺癌4T1细胞增殖的作用机制。 方法 将处于对数生长期小鼠乳腺癌4T1细胞消化后接种于3.5 cm细胞皿中，分别加入0、2.5、5、10、20 μmol/L的RES干预72 h，使用倒置显微镜拍照观察法和台盼蓝计数法检测RES干预后细胞密度和活细胞浓度；Western blot检测低密度脂蛋白相关受体结合蛋白5（LRP5）、低密度脂蛋白相关受体结合蛋白6（LRP6）蛋白表达量。再将细胞分为对照组、RES组，分别加入0 μmol/L和前述所筛选的最佳干预浓度的RES干预72 h，Western blot检测β-连环蛋白（β-catenin）核蛋白表达量。接着将细胞分为siCtr组、siLRP5组、siLRP6组、siβ-catenin组，siCtr组给予正常培养，siLRP5组加入LRP5小干扰RNA（siRNA）沉默LRP5基因，siLRP6组加入LRP6 siRNA沉默LRP6基因，siβ- catenin组加入β-catenin siRNA沉默β-catenin基因，使用倒置显微镜拍照和台盼蓝计数检测上述4组细胞密度和活细胞浓度；Western blot检测LRP5、LRP6和β-catenin蛋白表达量。最后将细胞分为Vector组、Vector＋RES组、LRP5组、LRP5＋RES组、LRP6组、LRP6＋RES组、N端缺失的β-catenin突变体组（β-catenin ΔN组）、β-catenin ΔN＋RES组，Vector组给予正常培养，Vector＋RES组加入前述所筛选的最佳干预浓度的RES干预，LRP5组加入过表达LRP5质粒，LRP5＋RES组加入过表达LRP5质粒联合RES最佳干预浓度，LRP6组加入过表达LRP6质粒，LRP6＋RES组加入过表达LRP6质粒联合RES最佳干预浓度干预，β-catenin ΔN组加入过表达β-catenin ΔN质粒，β-catenin ΔN＋RES组加入过表达β-catenin ΔN质粒联合10 μmol/L的RES干预。使用倒置显微镜拍照和台盼蓝计数检测上述8组细胞密度和活细胞浓度；Western blot检测LRP5、LRP6和β-catenin蛋白表达量。 结果 与0 μmol/L RES组比较，10、20 μmol/L RES组细胞密度和活细胞浓度均降低（P＜0.05），对LRP5、LRP6蛋白表达下调显著（P＜0.05），故后续选用10 μmol/L浓度的RES进行干预。与对照组比较，RES组β-catenin核蛋白表达量下调（P＜0.05）；与siCtr组比较，siLRP5组、siLRP6组和siβ-catenin组细胞密度和活细胞浓度降低（P＜0.05）；与Vector组比较，Vector＋RES组细胞密度和活细胞浓度降低（P＜0.05）；与Vector＋RES组比较，LRP5＋RES组、LRP6＋RES组和β-catenin ΔN＋RES组细胞密度和活细胞浓度升高（P＜0.05）。 结论 白藜芦醇可阻止小鼠乳腺癌4T1细胞增殖，其机制与通过下调LRP5、LRP6表达抑制Wnt/β- catenin信号通路激活有关。

Graphical abstract

关键词

乳腺癌 / 白藜芦醇 / 4T1细胞 / LRP5/6 / Wnt/β-catenin信号通路

白藜芦醇（RES）是一种非黄酮类多酚有机化合物^［1］，化学名称为3，5，4'-三羟基反式二苯乙烯^［2］，分子式为C₁₄H₁₂O₃，呈白色针状晶体，难溶于水，能溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮等极性强的溶剂中^［3］。RES是植物在受到一些胁迫时产生的一种抗毒素，富含于葡萄皮和种子中，在食物中的来源主要包括：葡萄酒、浆果和花生^［4-5］，中药虎杖具有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰、清热解毒、活血通经等功效^［6］，是生产RES的重要原材料^［7］。研究表明，RES具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗癌、心血管保护、神经保护等生物学活性，临床上主要运用于糖尿病、肥胖、癌症、高血压、中风、心血管疾病的治疗^［8-9］，其抗癌作用已引起社会的广泛关注^［10］。

研究表明，肿瘤患者日益呈现年轻化趋势，因此亟待寻找有效治疗肿瘤的策略^［11］。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，现已取代肺癌成为全球第一大癌症^［12］。尽管目前在癌症研究方面取得了巨大进展，但乳腺癌仍然是人类健康的主要威胁^［13］。因此探寻调控乳腺癌发病机制的重要靶点是目前的研究热点。有研究报道，低密度脂蛋白相关受体结合蛋白5（LRP5）和低密度脂蛋白相关受体结合蛋白6（LRP6）以及其介导的Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路在维持导管干细胞活性和正常小鼠乳腺发育过程中发挥重要作用^［14］。有研究表明，Wnt配体通过直接结合LRP5/6而促使共转录因子β-连环蛋白（β- catenin）转位入核激活Wnt/β-catenin下游的多个癌基因以发挥其抗凋亡和促生存作用，最终Wnt/β-catenin信号通路的异常激活诱导了乳腺癌的发生和发展 ^［15］。由此可知，乳腺癌的发生、发展与LRP5、LRP6（LRP5/6）以及Wnt/β-catenin信号通路密切相关。有研究发现，在体外实验中RES能够以剂量和时间依赖的方式抑制乳腺癌细胞的增殖^［16］，但其抑制乳腺癌细胞增殖的具体分子机制尚不明确^［17］。基于此，本研究通过体外实验探究RES对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖的影响及作用机制，进一步为临床上RES预防和治疗乳腺癌疾病提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验细胞

小鼠乳腺癌4T1细胞株由美国韦恩州立大学F.Miller博士惠赠，-200 ℃液氮保存。

1.2 实验药物

RES购自美国MedChemExpress公司，产品货号：HY-16561，生产批号：58706，CAS号：501-36-0，药物分子量：228.24，纯度：99.94%。

1.3 实验试剂

LRP5（货号：5731）、LRP6（货号：3395）、β-catenin（货号：8480）、TATA结合蛋白（TBP）（货号：44059）均购自美国Cell Signaling Technology公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（货号：60004-1-Ig）、多肽蛋白标签（MYC-tag）（货号：16286-1-AP）抗体均购自美国Proteintech公司；山羊抗小鼠二抗（货号：L3032）和山羊抗兔二抗（货号：L3012）购自美国Signaling Antibody公司；改良的Eagle培养基（DMEM高糖培养基）（货号：KGM 12800N-500，江苏凯基生物技术股份有限公司）；胎牛血清（货号：S-FBS-SA-015，美国PAEK Serum公司）；0.4%台盼蓝染液（货号：C0040，北京索莱宝科技有限公司）；NP-40蛋白裂解液（货号：N8032，北京索莱宝科技有限公司）；细胞核蛋白提取试剂盒［货号：C500009-0050，生工生物工程（上海）股份有限公司］；超敏化学发光液（货号：BMU102-CN，Abbkine公司）。

1.4 实验仪器

倒置显微镜（德国Leica公司）；小型转膜槽转膜仪（美国Bio-Rad公司）；电泳仪（货号：powerpac HC，Bio-Rad公司）；高速冷冻离心机（货号：5418R，Eppendorf公司）；细胞计数仪（货号：IC1000，Countstart）；医用低温保存箱（货号：DW-86L726G，青岛海尔生物医疗股份有限公司）；ChemiDoc MP全能型成像系统（美国Bio-Rad公司）。

2 实验方法

2.1 RES药液制备

使用二甲亚砜（DMSO）配成浓度为200 mmol/L的混悬液，经震荡混匀充分溶解后，再使用DMSO稀释浓度至10 mmol/L，作为母液。分装后，-80 ℃冰箱储存。使用时，将分装管置于细胞房超净台上，自然融化后，使用DMSO现稀释成相应浓度用于实验。

2.2 细胞培养

将小鼠乳腺癌4T1细胞常规复苏培养于含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素双抗的高糖DMEM培养液中，并放置于含5%CO₂、37 ℃恒温培养箱中生长。待细胞汇合度达80%～90%时，用0.25%的胰蛋白酶消化处理，后续根据实验需要进行细胞传代、冻存或接种铺板等实验。

2.3 细胞分组、干预和观察指标

① 将对数生长期小鼠乳腺癌4T1细胞消化后接种于3.5 cm细胞皿中，分别加入0、2.5、5、10、20 μmol/L的RES干预72 h。使用倒置显微镜观察RES干预后细胞密度；进行台盼蓝计数法检测活细胞浓度，细胞消化离心后，加入培养基重悬细胞，并吹打均匀，吸取20 μL细胞悬液，加入等体积台盼蓝溶液混匀后，吸出20 μL混液加入细胞计数板中，用细胞计数仪进行检测；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测LRP5/6蛋白表达量，RES干预后，吸弃细胞培养基，将细胞皿置于冰上，加入NP-40蛋白裂解液提取细胞总蛋白，使用二喹啉甲酸（BCA）法检测蛋白浓度后，调整样本至同一浓度，100 ℃，7 min，蛋白变性，电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭后加入一抗，LRP5（1∶1 000）、LRP6（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗（山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗），室温孵育1～2 h，最后加入超敏型ECL发光液进行显影。② 将小鼠乳腺癌4T1细胞分为未沉默基因的正常培养组（siCtr组），沉默LRP5基因组（siLRP5组），沉默LRP6基因组（siLRP6组）。倒置显微镜拍照和台盼蓝计数法检测上述3组细胞密度和活细胞浓度，Western blot检测LRP5/6蛋白表达量。③ 将小鼠乳腺癌4T1细胞分为未过表达基因的正常培养组（Vector组），未过表达基因但加入RES（10 μmol/L）干预72 h组（Vector＋RES组），过表达LRP5基因组（LRP5组），过表达LRP5基因且加入RES（10 μmol/L）干预72 h组（LRP5＋RES组），过表达LRP6基因组（LRP6组），过表达LRP6基因且加入RES（10 μmol/L）干预72 h组（LRP6＋RES组）。显微镜拍照和台盼蓝计数法检测上述6组细胞密度和活细胞浓度，Western blot检测LRP5/6蛋白表达量。④ 将小鼠乳腺癌4T1细胞分为A、D。分别加入0、10 μmol/L的RES干预72 h。Western blot检测β-catenin核蛋白表达量，根据细胞核蛋白质提取试剂盒上说明书步骤进行细胞核蛋白的提取，Western blot法进行β- catenin（1∶1 000）、TBP（1∶1 000）抗体孵育和条带显影。⑤ 将小鼠乳腺癌4T1细胞分为未沉默基因的正常培养组（siCtr组），沉默β-catenin基因组（siβ- catenin组）。按“2.3”项下显微镜拍照和台盼蓝计数法检测上述2组细胞密度和活细胞浓度，Western blot检测β-catenin蛋白表达量。⑥ 将小鼠乳腺癌4T1细胞分为未过表达基因的正常培养组（Vector组），未过表达基因但加入RES（10 μmol/L）干预72 h组（Vector＋RES组），过表达N端缺失的β- catenin突变体（β-catenin ΔN）基因组（β-catenin ΔN组），过表达β-catenin ΔN基因且加入RES（10 μmol/L）干预72 h组（β-catenin ΔN＋RES组）。β-catenin 的N端发生磷酸化修饰进而被泛素化降解是Wnt/β-catenin信号通路处于静息状态或抑制状态的主要标志，因此通过过表达N端缺失的β- catenin突变体（β-catenin ΔN）是模拟Wnt/β-catenin信号过度激活的常规方法。显微镜拍照和台盼蓝计数法检测上述4组细胞密度和活细胞浓度、Western blot检测β-catenin蛋白表达量。

2.4 统计学方法

使用SPSS 22.0进行统计学分析。计量资料属正态分布以（\overline{x}±s）表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 细胞不同浓度RES干预后密度、活细胞浓度和LRP5/6蛋白表达量比较

选用10 μmol/L浓度的RES进行后续干预。见图1-4。

3.2 细胞沉默LRP5/6基因后密度、活细胞浓度和LRP5/6蛋白表达量比较

见图5-7。

3.3 细胞过表达LRP5/6基因后密度、活细胞浓度和LRP5/6蛋白表达量比较

见图8-10。

3.4 细胞RES干预后β-catenin核蛋白表达量比较

见图11-12。

3.5 细胞沉默β-catenin基因后密度、活细胞浓度和β-catenin蛋白表达量比较

见图13-15。

3.6 细胞过表达β-catenin基因后密度、活细胞浓度和β-catenin蛋白表达量比较

见图16-18。

4 讨　论

乳腺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，具有很高的致死率^［18］。有研究表明，Wnt信号通路参与乳腺癌的进展^［19］。同时，早期实验研究充分证实，Wnt/β-catenin信号的传递与多种癌症的发生和发展密切相关，因此寻找方法有效抑制Wnt/β-catenin信号通路可能为治疗各种癌症提供新的希望^［20］。RES是一种天然产物，它在开发新型的癌症治疗方法方面有很大的前景^［21］。有数据显示，RES可通过抑制细胞周期和诱导细胞凋亡阻止乳腺癌细胞的增殖，但其作用的具体分子机制尚不明确^［10］。本研究选用小鼠乳腺癌4T1细胞作为RES体外乳腺癌实验的细胞株，发现经RES干预后可呈剂量依赖性抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖（P＜0.05）。相关研究表明，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与乳腺癌疾病的发生和发展密切相关^［15］，LRP5/6是重要的Wnt共受体，因此本研究检测RES干预对小鼠乳腺癌4T1细胞中LRP5/6总蛋白及β-catenin核蛋白表达水平的影响。Western blot结果显示，RES可呈剂量依赖性下调小鼠乳腺癌4T1细胞中LRP5/6总蛋白的表达，同时RES还可显著抑制β-catenin的入核（P＜0.05），通过沉默和过表达LRP5/6及β- catenin基因的一系列实验进一步验证RES可通过下调LRP5/6并抑制Wnt/β-catenin信号通路阻止小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖，多个结果充分提示RES可特异性下调Wnt/β-catenin信号强度以发挥其抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的过度增殖的效应。

综上所述，本研究通过体外实验，验证了RES对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖抑制的作用，阐明RES通过下调LRP5/6表达并抑制Wnt/β-catenin信号通路阻止小鼠乳腺癌4T1细胞增殖的作用机制，为临床上RES预防和治疗乳腺癌疾病提供了实验依据。

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基金资助

福建中医药大学青年科研拔尖人才项目(XQB202201)

福建中医药大学高层次人才科研项目（X2021002-人才,X2021003-人才）