中暑不同证型中医证候评分与血清差异蛋白的关联性分析及验证

摘要

目的 分析阳暑型和暑厥型中暑中医证候评分与血清差异蛋白的关联性并进行验证，以期为中暑的早期辨证提供实验依据。 方法 采用病例对照研究设计，选择2022年5月—2023年5月前往中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院就诊的阳暑型、暑厥型中暑患者与对照受试者，分别为阳暑型组6例、暑厥型组11例和对照组10例，3组先进行中医证候评分，再各取4例的外周血清进行蛋白组学分析并根据蛋白组学结果FC≥1.5或FC≤0.666 7，且P＜0.05找出组间显著性差异蛋白，最后采用酶联免疫吸附（ELISA）法进行验证，并进行相关性分析。 结果 与对照组比较，阳暑型组和暑厥型组中医证候评分均显著增高（P＜0.05），阳属型组和暑厥型组共鉴定出3 854个表达差异蛋白（P＜0.05），其中阳暑型组显著上调表达蛋白有96个、下调表达蛋白51个，暑厥型组显著上调表达蛋白58个、下调表达蛋白110个。共同差异蛋白分析显示，阳暑型组和暑厥型组中白细胞介素增强因子-2（ILF-2）含量显著增高（P＜0.05），磷脂酰肌醇-聚糖特异性磷脂酶D1（GPLD1）含量则显著降低（P＜0.05）。相关性分析提示GPLD1含量与中医证候评分呈负相关。 结论 阳暑型和暑厥型中暑患者外周血清存在ILF-2含量增高和GPLD1含量降低的2个共同差异蛋白，且GPLD1含量变化与中医证候评分呈负相关。

Graphical abstract

关键词

中暑 / 阳暑型 / 暑厥型 / 先兆中暑 / 热射病 / 中医证候评分 / 差异蛋白

中暑是指夏季在烈日或高温环境下劳动，因暑热侵袭，致邪热内郁，体温调节功能失常所发生的急性病变。中暑主要的证候分类包括阳暑型、阴暑型、暑厥型及暑风型。其中暑厥型对应西医中的热射病（heat stroke，HS），是一种由热损伤因素引起的严重致命性疾病，发病急，变化快，病死率极高，属于最严重的中暑类型^［1］。阳暑型中暑对应西医中的先兆中暑，阳暑型中暑可进一步进展为暑厥型中暑。暑厥型中暑约占中暑的8.6%～18.0%，但是其病死率却高达50%以上^［2］；如果能及时诊断和治疗，病死率可降至5%以下^［3］。故探索暑厥型中暑早期诊断方法对于指导患者及时治疗和提高其生存预后至关重要。目前，暑厥型中暑主要依靠病史和临床表现做出临床诊断，其病情监测主要依靠常规的实验室诊断指标，包括血常规、肝功能及肾功能指标、血液培养等，但这些实验室检测方法对于暑厥型中暑的诊断并不具有特异性。相比于临床常规检查，中医诊断方法通过望、闻、问、切四诊合参可以第一时间给予中医诊断评估，直接指导下一步的施救措施，为暑厥型中暑患者争取宝贵的早期治疗时间。

近年来有学者提出利用基因组学、蛋白质组学研究中医证候的设想，并提出“证候基因组学”“证候蛋白质组学”等概念，证候不一，基因表达谱也不同^［4］。因此，本研究拟通过蛋白组学筛选及中医证候评分探讨不同中暑类型的中医证候评分及血清差异蛋白，为临床早期快速诊断暑厥型中暑提供理论依据。

1 临床材料

1.1 诊断标准

1.1.1 西医诊断标准

参照《职业性中暑诊断标准》（GBZ41-2019）^［5］进行诊断。先兆中暑：① 在高温作业环境下工作5 h以上；② 体温正常或略有升高但低于38.0 ℃，头晕、头痛、乏力；③ 口渴、多汗；④ 心悸；⑤ 注意力不集中；⑥ 面色潮红、皮肤灼热，短时间休息后症状即可消失。以上①～③点同时满足，④～⑥满足其中1项即可诊断。热射病：① 在高温作业环境下工作5 h以上；② 体温明显增高，皮肤干热、无汗，体温高达40 ℃及以上，呼吸循环系统功能改变；③ 意识障碍，谵妄、昏迷等；④ 伴有全身性癫痫样发作；⑤ 横纹肌溶解；⑥ 多器官功能障碍综合征。以上①～③点同时满足，④～⑥满足其中1项即可诊断。

1.1.2 中医辨证标准

参照《中医病证诊断疗效标准》^［6］中阳暑证和暑厥证中暑的辨证标准。

1.2 纳入标准

1.2.1 阳暑型组纳入标准

① 男性；② 年龄20～40岁；③ 符合先兆中暑的诊断标准；④ 符合阳暑型的辨证标准；⑤ 近1 d有5 h以上高温环境接触史；⑥ 受试者知情同意并签署知情同意书。

1.2.2 暑厥型组纳入标准

① 男性；② 年龄20～40岁；③ 符合热射病的诊断标准；④ 符合阳暑型的辨证标准；⑤ 近1 d有5 h以上高温环境接触史；⑥ 受试者知情同意并签署知情同意书。

1.2.3 对照组纳入标准

① 男性；② 年龄20～40岁；③ 没有先兆中暑及热射病症状；④ 近1 d有5 h以上高温环境接触史；⑤ 受试者知情同意并签署知情同意书。

1.3 排除标准

① 近3个月参加其他药物临床试验；② 因皮肤或者汗腺功能障碍导致无法正常释放热量而中暑；③ 有精神病史。

1.4 一般资料

选择2022年5月—2023年5月在联勤保障部队第九〇〇医院就诊符合要求的受试者27例，其中阳暑型组6例，暑厥型组11例，对照组10例。3组年龄、所处高温环境时长比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。本试验已获得中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院伦理委员会审查批准。

2 方　法

2.1 中医证候评分

参照《中医病证诊断疗效标准》^［6］，将主症和次症按照有、无进行计分，其中主证满足1项计2分，次证满足1项计0.5分，所有症状积分之和即为中医证候评分。阳暑证的主症为：① 头晕；② 恶心呕吐；③ 多汗。次症为：① 面色潮红；② 口渴；③ 心烦胸闷；④ 神疲乏力；⑤ 头痛；⑥ 发热。暑厥证的主症为：① 昏倒不省人事；② 手足痉挛；③ 高热。次症为：① 烦躁不安；② 胸闷气促；③ 舌红，苔燥无津；④ 脉细促；⑤ 体若燔炭；⑥ 小便失禁。

2.2 外周血清蛋白组学检测

① 血清蛋白质的提取和分离：使用分析柱（IonOpticks，Australia，25 cm×75 μm，C₁₈填料1.6 μm）脱盐后，采用NanoElute UHPLC系统进行分离，并使用裂解缓冲液和高强度超声处理器（Scientz）从组织样品中提取蛋白质，对每个肽通道进行TMT标记。在具有纳米电喷雾离子源的Q Exactive^TM HF-X（Thermo Fisher Scientific）中分析分离的肽。使用MaxQuant搜索引擎（v.1.6.15.0）进行数据库搜索。② 蛋白组学分析：按照设备制造商推荐的组织样本处理程序仔细提取亲水性化合物和疏水性化合物。首先混合样品经色谱分离后先用timsTOF Pro质谱仪的DDA-PASEF模式进行质谱数据采集，采用Uniprot数据库进行蛋白质检索，Proteome Discoverer软件将每组得到的蛋白进行组内蛋白质及组间相同蛋白质差异性分析，设定差异倍数为1.5倍，且P＜0.05作为表达上调或下调的显著阈值，多肽和蛋白质的假发现率（FDR）设置为0.01，达到可信度＞99%。

2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）法验证共性差异性蛋白

根据“2.2”项的分析结果，采用ELISA法对得到的共性差异性蛋白进行验证。具体操作如下：收集3组受试者外周静脉血，在4 ℃、3 000 r/min下离心10 min。取上清后-80 ℃冻存，采用ELISA法检测血清共性差异性蛋白的含量。

2.4 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行数据统计分析。计量资料属正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐则采用LSD-t法，方差不齐则采用Games-Howell法。将阳暑型组、暑厥型组的受试者血清中磷酯酰肌醇-聚糖特异性磷脂酶D1（GPLD1）的蛋白表达量与中医证候评分分别进行斯皮尔曼相关性分析，并得出斯皮尔曼相关系数（r_s ）。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 3组中医证候评分比较

见表2。

3.2 血清差异表达蛋白筛选结果及独有、共有差异表达蛋白的分布

3.2.1 3组血清差异表达蛋白筛选结果及比较

3组共鉴定出3 854个差异蛋白（DEPs）（P＜0.05），使用热图聚类分析DEPs，见图1A。按照筛选条件为P＜0.05、倍数变化为＜0.83或＞1.2，从DEPs筛查的结果以火山图的形式呈现，见图1B、1C、1D。与对照组比较，阳暑型组显著上调表达蛋白96个、下调表达蛋白51个，暑厥型组显著上调表达蛋白58个、下调表达蛋白110个；与阳暑型组比较，暑厥型组上调表达蛋白41个、下调表达蛋白105个。见图1E。

3.2.2 3组独有和共有差异表达蛋白的分布情况

暑厥型组vs对照组、暑厥型组vs阳暑型组之间共有差异表达蛋白52个，见图2A。阳暑型组vs对照组与暑厥型组vs阳暑型组之间共有差异表达蛋白17个；暑厥型组vs对照组与阳暑型组vs对照组之间共有差异表达蛋白48个；暑厥型组vs对照组、暑厥型组vs阳暑型组及阳暑型组vs对照组共有差异蛋白有2个，分别为：白细胞介素增强因子-2（ILF-2）和GPLD1，见图2B。在阳暑型组受试者血清中ILF-2的表达量显著高于对照组受试者，且在暑厥型组受试者中进一步增高；然而在阳暑型组受试者血清中GPLD1的表达量显著低于对照组受试者，且在暑厥型组受试者中进一步下降，见图2B。

3.3 3组共有血清差异蛋白含量比较

见表3。

3.4 血清差异蛋白GPLD1与中医证候评分相关性分析结果

中医证候评分与GPLD1蛋白表达量呈现负相关。见图3。

4 讨　论

目前鉴别阳暑型中暑与暑厥型中暑没有快速且准确的诊断方法，通常是通过耗时较久的常规实验室检查，如血肌红蛋白、凝血功能、肌酸激酶等指标综合判断，较长的诊断时间会耽误热射病的黄金治疗窗口期，进一步影响其预后。而中医证候反映疾病发展演变过程中患者所处特定内、外环境的本质，它以相应的症、舌、脉、形、色、神表现出来，并且能够不同程度地揭示病因、病位、病性、邪正盛衰、病势等病机内容，可迅速且较为准确地指导临床诊疗。但目前中医证候理论和证候分类的科学基础仍然需要恰当的方法和途径以公认的科学数据来支持中医证候论，从而保证中医证候理论的可持续发展^［7］。因此，本课题选择暑症证候评分结合关键差异蛋白快速检查，有望解决暑厥型中暑与阳暑型中暑临床快速鉴别这一难题。

通过中医证候评分发现，阳暑型组相比于暑厥型组的主要区别在于其主证表现的差异，进一步通过蛋白组学分析发现其关键差异蛋白为ILF-2及GPLD1。GPLD1是一种110～120 kDa的N-糖基化两亲性蛋白，在哺乳动物血清中含量丰富，浓度约为5～10 μg/mL^［8］。GPLD1是糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的特异性酶，通过裂解膜相关的GPI分子来发挥其生物学功能。先前的研究表明，GPLD1可以促进神经元的分化并且参与神经突触的形成和功能调节^［9］。正常体温由下丘脑前部的体温调节中枢调控，并且随着体温升高，机体产生应激反应，交感神经兴奋促进血管舒张，增加皮肤和肢体的血流量，引发出汗，从而使身体降温，作为代偿反应，这一过程会减少大脑、心脏、肝脏和肾脏的血流量，促进血液流向皮肤和肌肉以维持血压稳定，并且伴随大量水分和盐分的流失，导致神经系统损害和多器官衰竭^［10］。并且针对热射病模型动物的研究发现，热射病会导致明显的中枢神经病理损伤，包括早期炎症反应以及神经元变性和凋亡^［11-12］。本研究发现，GPLD1作为中枢神经系统的重要调控蛋白，其在外周血清中表达量较高，易于检测，并且其会随着阳暑型中暑进展为暑厥型中暑而进一步降低，其表达水平的下降对于暑厥型中暑的损伤程度具有一定指导意义。并且针对所有受试者GPLD1蛋白的ELISA结果与中医证候评分进行斯皮尔曼相关性分析，结果表明中医证候评分与阳暑型中暑及暑厥型中暑受试者的GPLD1蛋白表达量呈现显著的负相关关系，为未来暑症中医证候评分结合临床血清快检识别暑厥型中暑提供了新的理论与思路。

ILF-2作为核因子45，是转录激活因子复合物的成员，该复合物对白细胞介素-2（IL-2）的表达至关重要，并与白细胞介素增强因子形成稳定的异二聚体，在炎症反应等多种生物过程中发挥作用^［13-14］。研究发现，长期暴露于高温环境下，机体会产生急性热应激反应，白细胞和内皮细胞的产生增加且过度活化，促进多种炎症相关细胞因子，如白细胞介素-1（IL-1）和白细胞介素-6（IL-6）等的产生和向体循环的转移^［15］。本研究结果表明，ILF-2可能是暑厥型中暑及阳暑型中暑的生物标志物，其表达水平的升高对阳暑型中暑进展为暑厥型中暑具有一定指导意义，拟在后续研究中扩大样本量并对结果进行验证为暑厥型中暑的临床快速诊断提供一种新思路。

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基金资助

军队中医药服务能力培育与提升专项计划(2021ZY034)

福建省科技计划对外合作项目(2023I0029)

福建省适配体精准检验临床医学研究中心(2021Y2017)