凉血解毒化瘀方预防慢性肝损伤小鼠向急性肝衰竭转化及其对TLR4的调控作用

Preventive Effect of Liangxue-Jiedu Decoction on the Transformation From Chronic Liver Injury to Acute Liver Failure in Mice and Its Regulation on TLR4

摘要

目的 探讨凉血解毒化瘀方对慢性肝损伤小鼠向急性肝衰竭转化的预防效果及其对Toll样受体4（TLR4）的调控作用。 方法 取6周龄SPF级雄性BALB/c小鼠60只，采用随机数字表法分为正常组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组12只。除正常组外，其余4组按体质量5 mL/kg腹腔注射20%四氯化碳（CCl₄）以构建慢性肝损伤小鼠模型，正常组腹腔注射等剂量生理盐水，2次/周，连续8周。经组织病理学与血清生化分析证实慢性肝损伤造模成功后，低、中、高剂量组按体质量10 mL/（kg·d）分别灌胃0.75、1.50、3.00 g/mL凉血解毒化瘀方药液，正常组、模型组灌胃等剂量生理盐水，连续灌胃28 d后，模型组与各剂量组分别按体质量5 mL/kg一次性腹腔注射2 μg/mL脂多糖（LPS）和0.2 g/mL D-氨基半乳糖（D-GalN）以诱导慢性肝损伤小鼠向急性肝衰竭转化，正常组腹腔注射等剂量生理盐水。3 d后采用生化分析法检测5组小鼠血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）含量，HE染色观察5组小鼠肝组织病理形态变化，qPCR检测5组小鼠肝组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、Toll样受体4（TLR4）mRNA转录水平，采用免疫荧光染色检测5组小鼠肝组织TLR4蛋白表达水平。 结果 与正常组比较，模型组血清ALT、AST、TBIL含量显著提高（P＜0.05），HE染色结果显示肝组织出现肝细胞坏死，伴随大量纤维化改变及炎症细胞浸润，肝组织TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4 mRNA转录水平升高（P＜0.05），肝组织TLR4蛋白表达水平增高。与模型组比较，各剂量组血清ALT、AST、TBIL含量降低（P＜0.05），HE染色结果显示肝细胞坏死、纤维化，炎症细胞浸润程度减少，肝组织TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4 mRNA转录水平降低（P＜0.05），肝组织TLR4蛋白表达量减少。与低剂量组比较，中、高剂量组血清ALT、AST水平降低更明显（P＜0.05），HE染色结果显示肝细胞坏死、纤维化，炎症细胞浸润程度更轻，肝组织TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4 mRNA转录水平降低更明显（P＜0.05），肝组织TLR4蛋白表达水平减少更明显。 结论 凉血解毒化瘀方可用于预防慢性肝损伤小鼠向急性肝衰竭转化，并具有抗炎作用，其机制可能通过抑制TLR4高表达而实现的。

Abstract

Objective The effect and the TLR4 regulation of Liangxue-Jiedu decoction (LXJD) on preventing mice form chronic-hepatic injury to acute liver failure. Methods A total of sixty SPF male BALB/c mice aged 6 weeks were divided into normal group, model group, LXJD groups of low-dose, medium-dose and high-dose by random number table method, with 12 mice in each group. Apart from the normal group, all mice were intraperitoneally injected with 5 mL/kg 20% carbon tetrachloride (CCl4) twice a week for eight weeks, and the mice in the normal group were administrated with the same dose of normal saline. After the successful models of chronic liver injury were confirmed by histopathology and serum biochemical analysis, the low, middle, and high dose groups were given intragastric administration of 0.75,1.50 and 3.00 g/mL LXJD according to body mass 10 mL/ (kg·d) respectively. The normal and model groups were given the same dose of normal saline. After continuous intragastric administration for 28 days, the model group and each dose group were intraperitoneally injected with 2 μg/mL lipopolysaccharide (LPS) and 0.2 g/mL D-amino galactose (D-GalN) at a dose of 5 mL/kg to induce the transformation from chronic liver injury to acute liver failure. While the normal mice were given an equal volume of normal saline. Three days later, serum and liver tissue samples were collected for the following evaluation. Biochemical analysis was performed to measure the serum levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and total bilirubin (TBIL) in all groups. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to evaluate the histopathological changes of liver tissue in all groups. Quantitative PCR (qPCR) was used to detect the mRNA levels of TNF-α, IL-6, IL-1β, and TLR4 in liver tissues from all groups. Immunofluorescence staining was used to analyze the protein expression of TLR4 in liver tissues from all groups. Results Compared with the normal group, the model group showed a significant increase in serum ALT, AST, and TBIL content (P<0.05), as well as the typical hepatocyte necrosis, fibrotic changes and inflammation in liver tissues; the mRNA level of TNF-α, IL-6, IL-1β, and TLR4 in liver tissues was also significantly increased (P<0.05) in the model group. In addition, the TLR4 protein expression were markedly increased in the liver tissues of model group. Compared with the model group, the serum content of ALT, AST, and TBIL was significantly decreased in LXJD groups (P<0.05); a slight hepatocyte necrosis, fibrosis, and inflammation were observed in the LXJD groups; the level of TNF-α, IL-6, IL-1β, and TLR4 mRNA were significantly decreased (P<0.05), and the protein expression level of TLR4 was also down-regulated in the LXJD groups. Compared with the low-dose group, the serum levels of ALT and AST were significantly decreased in the medium-dose or high-dose group (P<0.05); the low hepatocyte necrosis, fibrosis, and inflammation, as well as the decreased mRNA level of TNF-α, IL-6, IL-1β, and TLR4 (P<0.05), and the decreased TLR4 protein expression were all observed in the medium-dose or high-dose group. Conclusion LXJD can be effectively used to prevent the transformation of chronic liver injury mice into acute liver failure, and has anti-inflammatory function, which may be through the down regulation of TLR4 expression.

Graphical abstract

关键词

慢性肝损伤 / 急性肝衰竭 / 凉血解毒化瘀方 / 炎症反应 / TLR4

Key words

chronic liver injury / acute liver failure / Liangxue-Jiedu decoction / inflammation / TLR4

慢加急性肝衰竭（ACLF）是一种在慢性乙型肝炎或肝硬化基础上，短时间内出现急性肝功能异常的临床症候群^［1］，其症状包括黄疸、肝性脑病、出血倾向、肝肾综合征，并常伴随其他器官功能衰竭等多种并发症^［2］。ACLF属于中医“黄疸”范畴，其治疗方法从治黄三法“利其小便、以汗解之、当下之”，逐步衍生成“从血、毒、痰论治”的新疗法，并系统归纳了ACLF的病机在于“湿、热、瘀、毒、虚”，病性多虚实夹杂，且传变迅速^［3-5］。

凉血解毒化瘀方是解放军第五医院李筠教授将其长期从事中医药防治肝病临床研究结合临床实践总结出来的经验方^［6-8］，具有凉血解毒、祛湿化瘀的功效，可改善ACLF患者肝功能和预后^［8-9］。Toll样受体4（TLR4）参与机体炎症反应，与ACLF的发生、发展密切相关^［10-11］。本团队通过构建小鼠慢性肝损伤模型，探讨凉血解毒化瘀方对慢性肝损伤小鼠转化为急性肝衰竭的预防作用及其对TLR4的调控作用。

1 实验材料

1.1 实验动物

6周龄SPF级BALB/c小鼠60只，体质量（20±2）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004。饲养于福建医科大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2022-0003。实验方案经福建医科大学孟超肝胆医院实验动物伦理委员会批准（审批号：MCHH-AEC-2022-06）。

1.2 实验药品

凉血解毒化瘀方由赤芍、茵陈、白花蛇舌草、丹参、炒白术、茜草、豨莶草、白及、栀子组成，由北京康仁堂药业有限公司浓缩制备成颗粒剂。实验前用生理盐水分别溶解成0.75、1.50、3.00 g/mL凉血解毒化瘀方药液，密封后置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 实验试剂

四氯化碳（CCl₄，国药集团化学试剂有限公司，货号：10006464）；4%多聚甲醛（货号：P0099）、脂多糖（LPS，货号：S1732）、D-氨基半乳糖（D-GalN，货号：ST1213）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，货号：C1002）、TLR4（货号：AF8187）均购自上海碧云天生物技术有限公司；丙氨酸转氨酶（AST）检测试剂盒（货号：C010-2-1）、天冬氨酸转氨酶（ALT）检测试剂盒（货号：C009-2-1）、总胆红素（TBIL）检测试剂盒（货号：C019-1-1）均购自南京建成生物工程研究所；RNA提取试剂盒（货号：19221ES50）、逆转录试剂盒（货号：11141ES10）均购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；Alexa Fluor™546的荧光二抗（美国Thermo Fisher公司，货号：A20183）。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、TLR4、糖酵解酶磷酸化酶（GAPDH）的引物合成依托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4 实验仪器

荧光定量PCR仪（美国Thermo Fisher公司，型号：ABI7500）；台式水平离心机（美国Thermo Fisher公司，型号：STR16R）；18.2M Ωcm^-1电阻率去离子制水机（美国Millipore公司，型号：MILLI-Q）；微量分光光度计（美国Thermo Fisher公司，型号：NanoDrop 1000）；多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司，型号：M5e）；激光扫描共聚焦显微镜（德国Zeiss公司，型号：LSM780）。

2 方　法

2.1 分组、造模与给药

60只6周龄SPF级雄性BALB/c小鼠适应性饲养1周后，按随机数字表法分成正常组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组12只。参考文献［12］建立CCl₄诱导慢性肝损伤小鼠模型，并通过LPS和D-GalN联合诱导慢性肝损伤向急性肝衰竭转化。模型组与各剂量组按体质量5 mL/kg腹腔注射20% CCl₄以构建慢性肝损伤小鼠模型，正常组腹腔注射等剂量生理盐水，2次/周，连续8周。经组织病理学与血清生化分析证实慢性肝损伤造模成功后，按成人（按体质量70 kg计算）等效剂量2倍、4倍、8倍分别作为低、中、高剂量组给药，即按体质量10 mL/（kg·d）分别灌胃0.75、1.50、3.00 g/mL凉血解毒化瘀方药液，正常组与模型组灌胃等剂量生理盐水，连续28 d；干预结束的第2天，为了进一步诱导急性肝衰竭模型，模型组与各剂量组分别按体质量5 mL/kg一次性腹腔注射2 μg/mL LPS和0.2 g/mL D-GalN，正常组腹腔注射等剂量生理盐水，3 d后收集样本进行相关指标检测。

2.2 取材及样本采集

末次给药3 d后，称取小鼠体质量，按体质量10 mL/kg腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，通过眼眶静脉取血；颈椎脱臼处死后剖取小鼠肝组织，生理盐水洗去血液，取左肝5 mm×5 mm×5 mm肝组织置于4%多聚甲醛固定液中固定；其余肝组织放入冻存管中，并迅速投入液氮中，后转移至-80 ℃冰箱保存备用。

2.3 观察指标

2.3.1 生化分析检测血清ALT、AST、TBIL含量

将全血室温静置1 h，在冷冻离心机以3 500 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液，严格按照ALT、AST、TBIL试剂盒说明书的实验步骤分别进行对照孔、测试孔加样，孵育，显色。反应结束后用多功能酶标仪分别记录510 nm和450 nm处波长，计算血清ALT、AST、TBIL含量。

2.3.2 HE染色观察肝组织病理形态变化

肝组织经4%多聚甲醛固定24 h后，进行75%、95%、100%酒精梯度脱水、二甲苯透明化处理、浸蜡、包埋；采用石蜡切片机将蜡块切成5 μm的石蜡切片，再使用苏木素和伊红进行染色，通过光学显微镜观察肝组织病理形态学变化。

2.3.3 qPCR检测IL-6、TNF-α、IL-1β、TLR4 mRNA引物转录水平

严格按照RNA提取试剂盒说明书的实验步骤提取肝组织的总RNA，经核酸定量后，进行反转录合成cDNA，然后添加引物（引物序列见表1）、反应液等进行qPCR检测。变性、退火、延伸的反应条件分别为95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，70 ℃、30 s，共40个反应循环。以GAPDH为内参，采用2^-∆∆Ct公式计算目的基因的相对表达量。

2.4 免疫荧光染色检测TLR4蛋白表达水平

肝组织从-80 ℃冰箱取出后，迅速置于冰冻切片机的样本台，用滤纸吸去多余的水分后，进行OTC包埋剂包埋，行10 μm冰冻切片；经4%多聚甲醛室温固定20 min后，采用5%BSA封闭，添加TLR4抗体（兔抗小鼠，1∶50） 4 ℃过夜；经PBS洗涤3次后，添加Alexa Fluor™ 546的荧光二抗（山羊抗兔，1∶1 000），室温下反应1 h，DAPI复染核5 min后采用激光扫描共聚焦显微镜拍照观察。

2.5 统计学方法

采用SPSS 24.0软件进行统计学处理。计量资料符合正态分布的以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。2组比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 5组血清肝功能指标比较

见表2。

3.2 5组肝组织病理形态学比较

与正常组比较，模型组光学显微镜下见肝组织出现肝细胞坏死、伴随大量纤维化改变及炎症细胞浸润；与模型组比较，各剂量组肝细胞坏死、纤维化以及炎症细胞浸润程度减少。与低剂量组比较，中、高剂量组肝细胞坏死、纤维化以及炎症细胞浸润程度更轻。见图1。

3.3 5组肝组织IL-6、TNF-α、IL-1β、TLR4 mRNA转录水平比较

见表3。

3.4 5组肝组织TLR4的蛋白表达水平比较

与正常组比较，模型组TLR4蛋白表达水平明显增高；与模型组比较，各剂量组的TLR4蛋白水平均明显减少。见图2。

4 讨　论

有研究表明：炎症反应、免疫反应参与ACLF整个疾病进程，是导致慢性肝损伤、急性肝衰竭的重要因素^［13］，中药复方可通过多种活性成分参与免疫调节、抑制炎症反应。本课题组前期参与并开展了以凉血解毒化瘀方为主的中医药治疗ACLF的临床研究，并获国家科技重大专项立项，证实了凉血解毒化瘀法治疗ACLF的疗效及安全性^［9］；同时通过动态监测ACLF患者血清中白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、IL-6、白细胞介素-10（IL-10）、干扰素-γ（IFN-γ）、TNF-α水平，证实了ACLF与体内炎症水平的关系，说明上述指标的检测对ACLF的发病及诊断具有临床指导意义^［14］。本研究进一步发现凉血解毒化瘀方可预防慢性肝损伤小鼠转化为急性肝衰竭，并通过抑制肝组织IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA转录水平发挥抗炎作用。

中药复方具有多靶点的特性且相关文献已报道了凉血解毒化瘀方中部分单味药的抗炎作用。有研究表明：赤芍可通过调控AMPK、MAPK、NF-κB、STAT6和HO-1信号通路抑制炎症因子分泌，发挥抗炎作用^［15］；茵陈可通过抑制NF-κB激活，发挥抗炎作用^［16］；栀子苷具有减轻肝损伤、抑制炎症反应、抗氧化等功能^［17］，并能降低D-氨基半乳糖和脂多糖诱导的肝衰竭小鼠死亡率^［18］；丹参酮ⅡA可通过抑制NF-κB信号通路和p38/MAPK信号通路从而抑制巨噬细胞炎症因子的分泌^［19］；白术中的白术内酯类和白术多糖成分具有抗炎活性，可通过调控NF-κB、ERK1/2和p38信号通路抑制巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-6^［20-21］。因此，凉血解毒化瘀方可能是通过多组分、多靶点来发挥抗炎作用。

Toll样受体是人体免疫细胞识别病原微生物的主要受体，在先天免疫和获得性免疫中均发挥重要作用^［10］。TLR4是Toll样受体中的一种，主要在单核细胞、巨噬细胞中表达，在肝脏激活型的kuffer细胞也有表达^［11］。有研究表明TLR4高表达与ACLF不良预后密切相关^［22］，TLR4抑制剂可减少肝细胞损伤，并抑制细胞炎症反应^［11］，说明TLR4是调控ACLF疾病进展的重要因子。前期研究表明：TLR4可通过提高TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子分泌，促进ACLF肝组织的炎症反应^{［11，23］}。本研究结果显示：凉血解毒化瘀方可抑制TLR4 mRNA转录、降低TLR4蛋白表达水平，并抑制肝组织TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA转录水平，提示凉血解毒化瘀方可能通过调控TLR4表达来抑制肝组织炎症反应，减缓ACLF的疾病进展。

综上所述，凉血解毒化瘀方可降低慢性肝损伤小鼠肝组织TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA转录水平，降低TLR4 mRNA转录及蛋白水平，从而抑制炎症反应，减少肝细胞坏死，延缓其向急性肝衰竭转化。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2023J011465)