白芍总苷对肥大细胞脱颗粒的影响

Effects of Total Glucosides of Paeony on Degranulation of Mast Cells

摘要

目的 研究白芍总苷（TGP）对肥大细胞（MCs）脱颗粒的影响。 方法 将对数生长期的小鼠肥大细胞瘤细胞P815（下称P815细胞）分成12组，分别采用0、25、50、100、200、400 µg/mL TGP溶液干预24 h和48 h，以筛选药物的安全干预浓度和时间。取对数生长期P815细胞分为对照组、模型组和低、中、高剂量组，低、中、高剂量组分别加入2 mL浓度为25、50、100 µg/mL TGP溶液干预24 h，对照组及模型组加入与上述TGP溶液等体积的完全培养基孵育，随后除对照组外，其他各组加入浓度为20 μg/mL的致敏剂C48/80刺激1 h诱导P815细胞脱颗粒。采用甲苯胺蓝染色观察5组细胞形态变化；ELISA法检测5组细胞中β-氨基己糖苷酶和组胺水平，荧光探针法检测细胞内钙离子相对荧光强度，转录组学测序分析模型组与对照组、模型组与中剂量组的差异表达基因，并对差异表达基因进行KEGG通路富集分析。 结果 与对照组比较，模型组细胞体积变大，形态不完整，边缘模糊，周围散在颗粒，细胞质淡染，细胞中β-氨基己糖苷酶和组胺水平显著增加，细胞内钙离子荧光强度明显增强（P＜0.05）；与模型组比较，中、高剂量组均可改善细胞脱颗粒形态变化，降低组胺和β-氨基己糖苷酶水平以及细胞内钙离子相对荧光强度（P＜0.05），而低剂量组上述指标变化不明显（P＞0.05），中剂量组与高剂量组比较，β-氨基己糖苷酶和组胺水平以及钙离子的荧光强度差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组与对照组以及模型组与中剂量组的差异表达基因主要富集在MAPK、JAK-STAT、IL-17、TNF、NF-κB信号通路。 结论 TGP可有效抑制C48/80诱导的P815细胞脱颗粒，改善细胞形态变化，抑制β-氨基己糖苷酶、组胺以及钙离子的释放，MAPK、JAK-STAT、IL-17、TNF、NF-κB信号通路可能是TGP抗过敏反应的关键靶通路。

Abstract

Objective To investigate the impact of Total Glucosides of Paeony (TGP) on the degranulation of mast cells (MCs). Methods P815 mastocytoma cells were divided into 12 groups and treated with TGP solution at concentrations of 0, 25, 50, 100, 200, and 400 µg/mL for 24 h and 48 h to screen for safe intervention conditions. P815 cells in the logarithmic growth phase were divided into control group, model group, and TGP low-, medium-, and high-dose groups. The low-, medium-, and high-dose groups were incubated with 2 mL TGP solutions at 25, 50, and 100 µg/mL for 24 h, respectively, while the control and model groups were incubated with complete culture-medium of the same volume as the above TGP solutions. Subsequently, except for the control group, other groups of P815 cells were stimulated with 20 μg/mL of the sensitizer compound 48/80 for 1 h to induce degranulation. Toluidine blue staining was used to observe cell morphological changes; ELISA was used to detect the levels of β-hexosaminidase and histamine; and a fluorescent probe method was used to detect the fluorescence intensity of calcium ions. Transcriptomics was used to screen for differentially expressed genes between the model group and the control group, as well as between the model group and the medium-dose group. Besides that, those genes were also used for KEGG pathway analysis. Results Compared with the control group, the cell volumes of the model group increased with incomplete morphology, and blurred edges, scattered granules, pale cytoplasm, and levels of histamine and β-hexosaminidase significantly increased, as well as a enhancement in intracellular calcium ion fluorescence intensity (P<0.05). Compared with the model group, both the medium- and high-dose groups could improve cellular morphology of degranulation, reduce levels of histamine and β-hexosaminidase, and decrease fluorescence intensity of calcium ions (P<0.05), while the low-dose group showed no significant changes (P>0.05). There was no significant difference in β-hexosaminidase, histamine, and calcium ion fluorescence intensity between the medium- and high-dose groups (P>0.05). The differentially expressed genes between the model and control groups, as well as between the model and medium-dose groups, were mainly enriched in the MAPK, JAK-STAT, IL-17, TNF, and NF-κB signaling pathways. Conclusion TGP can effectively inhibit compound 48/80-induced degranulation of P815 cells, improve cellular morphology, inhibit the release of β-hexosaminidase, histamine, and calcium ions, and the MAPK, JAK-STAT, IL-17, TNF, and NF-κB signaling pathways may be key targets for TGP's anti-allergic effect.

Graphical abstract

关键词

白芍总苷 / 肥大细胞 / 脱颗粒 / 过敏 / 转录组学

Key words

Total Glucosides of Paeony / mast cells / degranulation / allergy / transcriptomics / calcium ion

近年来，过敏性疾病的发病率在全球范围内呈现上升趋势，主要表现为机体局部的过敏反应，如皮肤、消化道或呼吸道过敏反应，也可出现全身性过敏反应^［1］，发病机制主要涉及免疫细胞，包括肥大细胞（mast cells，MCs）和嗜碱性粒细胞的活化和脱颗粒。其中，MCs作为主要效应细胞，过度激活会产生一系列炎症和过敏反应，因此，抑制MCs脱颗粒和炎症介质的释放是防治过敏性疾病的重要途径。目前有学者认为过敏性疾病的主要病机是肝阴不足、肝阳升发太过^［2］。白芍味苦、酸、性微寒，具有养血敛阴、柔肝缓急止痛、养阴平肝的功效^［3］，在治疗过敏性疾病的用药频次上位居前茅^［4］。白芍总苷（total glucosides of paeony，TGP）是由白芍根茎部位提取的一种生物活性物质^［5］，具有调节免疫、抗氧化和抗炎等多种作用^［6-7］，可以减轻荨麻疹、哮喘、湿疹、特应性皮炎等疾病的症状^［8-10］，但作用机制尚未阐明。本研究拟通过建立MCs的脱颗粒模型以模拟体外过敏反应，探讨TGP抑制MCs脱颗粒的机制，为临床使用TGP治疗过敏反应提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验细胞

小鼠肥大细胞瘤细胞P815（货号：iCell-m045，以下简称P815细胞）购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。

1.2 药物和试剂

白芍总苷胶囊（宁波立华制药有限公司，产品批号：221110）；RPMI-1640培养基（批号：MA0215）、磷酸盐缓冲液（PBS，批号：MA0020）、胎牛血清（FBS，批号：SA101.02）均购自美国Life Technologies公司；CCK8试剂盒（大连美仑生物技术有限公司，批号：MA0218）；48/80（美国GlpBio公司，批号：GC43305）；组胺ELISA试剂盒（批号：ZC-39061）、β-氨基己糖苷酶ELISA试剂盒（批号：ZC-37876）均购自上海茁彩生物科技有限公司；Fluo-3AM（批号：GC33437）、甲苯胺蓝（批号：GD21594）均购自美国GlpBio公司。

1.3 实验仪器

超净工作台（苏州净化设备有限公司，型号：SW-CJ-1FD）；荧光显微镜（型号：DMI4000 B）、倒置显微镜系统（型号：DMIL）均购自德国Leica公司；CO₂恒温培养箱（德国Heraeus公司，型号：3111）；全自动细胞计数仪（美国Countstar公司，型号：IC1000）；多功能酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司，型号：Multiskan FC）。

2 方　法

2.1 细胞培养

P815细胞采用RPMI-1640完全培养基、含10%优质胎牛血清和1%三抗（青霉素、链霉素和两性霉素B溶液），置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱培养，当P815细胞呈半悬浮生长，细胞密度达70%～80%时，用移液器吹打使细胞脱离培养瓶，按照1∶3传代，常规培养2 d后，取对数生长期P815细胞进行实验。

2.2 药物制备及浓度筛选

取300 mg TGP粉末加入RPMI-1640培养基3 mL溶解，超声震荡12 h后采用0.22 μm微孔滤器过滤，得到1 mg/mL TGP母液，储存于-20 ℃冰箱备用。后续实验中，使用配制好的RPMI-1640培养基将TGP母液稀释至浓度为0、25、50、100、200、400 µg/mL TGP溶液。

2.3 CCK8法检测不同浓度TGP干预24 h和48 h对细胞存活率的影响

取对数生长期P815细胞分成12组，以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱孵育24 h后，将“2.2”项下制备的TGP母液稀释至液度为0、25、50、100、200、400 µg/mL，并且以换液的形式加入96孔板中分别孵育24 h和48 h后，每孔加入含有10%CCK8溶液的培养基100 μL，于细胞培养箱中继续培养1.5 h，轻微振荡后置于自动酶标仪中，设置检测波长为450 nm，测定OD值并计算细胞存活率。

细胞存活率＝（实验组OD值－空白组OD值）/（对照组OD值－空白组OD值）×100%

（注：实验组为TGP溶液处理的P815细胞＋CCK8试剂；对照组为不加TGP溶液的P815细胞＋CCK8试剂；空白组为不加细胞的空白培养基＋CCK8试剂）

根据CCK8实验结果可知：25、50、100 µg/mL TGP溶液干预24 h和25 µg/mL TGP溶液干预48 h对P815细胞存活率无明显影响（P＞0.05），200、400 µg/mL TGP溶液干预24 h以及50、100、200、400 µg/mL TGP溶液干预48 h细胞存活率显著下降（P＜0.05），见图1，故选择25、50、100 µg/mL TGP溶液干预24 h进行后续实验。

2.4 甲苯胺蓝染色观察5组细胞脱颗粒的形态变化

取对数生长期P815细胞，以每孔1×10⁶/个接种在6孔板中。设立对照组、模型组和低、中、高剂量组，每组设3个复孔。低、中、高剂量组分别加入25、50、100 µg/mL TGP溶液孵育24 h，对照组及模型组加入与上述TGP溶液2 mL等体积的完全培养基孵育；随后除对照组外，其他各组加入20 μg/mL致敏剂C48/80刺激1 h诱导P815细胞脱颗粒。将各组P815细胞从培养板中收集，分置在不同的离心管里，离心，弃去上清，分别加入100 μL PBS重悬，用PAP笔在高压后的载玻片上画上一圈，使液体不外流，取20 μL细胞悬液滴在载玻片圈内；待细胞贴壁后，滴加4%多聚甲醛固定20 min以保持其结构完整性；进行3次PBS浸洗以去除多余的多聚甲醛，加入1%甲苯胺蓝染色40 min；蒸馏水洗涤3次以去除多余染色液，采用95%乙醇进行快速分化和脱色，梯度乙醇脱水，二甲苯进行透明化处理；最后，使用中性树胶封片，于显微镜下观察细胞形态并拍片。

2.5 ELISA法检测5组细胞中组胺及β-氨基己糖苷酶水平

按照“2.4”项下方法对P815细胞进行分组和干预，完成干预后，收集5组P815细胞并置于冷冻离心机中以3 000 r/min离心20 min，取上清，严格按照组胺及β-氨基己糖苷酶试剂盒说明进行检测，在450 nm波长处测定OD值，并计算组胺和β-氨基己糖苷酶水平。

2.6 荧光探针法检测5组细胞内钙离子的荧光强度

Fluo-3AM是一种钙离子荧光探针，能与细胞内游离钙离子特异性结合并产生荧光。按照“2.4”项下方法对P815细胞进行分组和干预，完成干预后，将5组P815细胞从培养板中收集，分置在不同的离心管里，离心，弃去上清，加入PBS重悬制成细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁶个/mL。取30 μL细胞悬液于已烘干灭菌的载玻片上，铺匀；载玻片四周用PAP笔画圈封住，多聚甲醛固定细胞20 min后弃上清，用PBS清洗细胞3次；每个切片加入稀释好的Fluo-3AM工作液1 mL，保证完全覆盖细胞，孵育40 min以确保Fluo-3AM在细胞内完全酯化；随后吸去染料工作液，用PBS洗2～3次，每次5 min。利用倒置荧光显微镜下的成像系统，采集5组细胞内钙离子荧光成像，使用Image J软件检测并计算钙离子相对荧光强度。

2.7 转录组学测序分析

根据TGP对P815细胞存活率的影响及其抑制P815细胞脱颗粒的有效剂量，为尽可能排除药物潜在毒副作用，本研究选用具有药效的最低剂量组，即TGP中剂量组的样本进行转录组学检测，以期探究TGP的药效关键靶信号通路。设对照组、模型组、TGP中剂量组，每组设3个复孔。按照“2.4”项下方法对上述3组进行药物干预，干预完成后将各组细胞从培养板中收集，分置在不同的离心管里，离心，弃去上清、重悬，调整细胞密度为1×10⁶/mL，装入提前预冷的RNase-free冻存管中，液氮速冻0.5 h，放入自封袋，-80 ℃冰箱保存。借助测序平台（上海因美纳有限公司，型号：Novaseq 6000），按照测序试剂盒（上海因美纳有限公司，型号：Truseq^TM RNA sample prep Kit）说明书进行文库构建。基于表达量定量结果，使用差异分析软件DESeq2进行组间差异基因分析，设定阈值为：∣log₂FC∣≥1且P值＜0.05，获得对照组vs模型组以及中剂量组vs模型组差异表达基因，并对上述差异表达基因进行KEGG通路富集分析。

2.8 统计学方法

实验数据采用Graphpad Prism 10.1.2软件进行统计分析。计量资料符合正态的以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 5组细胞脱颗粒形态变化比较

甲苯胺蓝染色结果显示：对照组P815细胞呈圆形，细胞质呈现蓝紫色；模型组P815细胞体积变大，形态不完整，边缘模糊，周围散在颗粒，细胞质淡染；低剂量组形态发生变化的P815细胞数量较模型组有所下降，而中、高剂量组P815细胞形态得到明显改善。见图2。

3.2 5组β-氨基己糖苷酶和组胺水平比较

与对照组比较，模型组β-氨基己糖苷酶、组胺水平明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，中、高剂量组的β-氨基己糖苷酶、组胺水平明显降低（P＜0.05），低剂量组上述指标比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

3.3 5组钙离子相对荧光强度比较

与对照组比较，模型组钙离子相对荧光强度明显增强（P＜0.05）；与模型组比较，中、高剂量组钙离子荧光强度均明显减弱（P＜0.05），低剂量组钙离子相对荧光强度差异无统计学意义（P＞0.05）；中、高剂量组钙离子相对荧光强度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

3.4 转录组学分析结果

与对照组比较，模型组共筛选出187个显著性差异表达基因，其中96个上调，91个下调；与模型组比较，TGP中剂量组筛选出351个著性差异表达基因，182个上调，169个下调，见图5。将上述差异表达基因进行KEEG富集分析，结果显示：白介素-17（IL-17）信号通路、丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路、Janus激酶-信号转导和转录激活因子（JAK-STAT）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路和核因子κB（NF-κB）信号通路为对照组vs模型组以及中剂量组vs模型组的差异表达基因富集到的相同通路，见图6。

4 讨　论

过敏性疾病是一类由免疫系统异常反应引起的疾病，其特点是对特定外界物质产生异常或过度的免疫反应。近年来，中国过敏性疾病的患病率急剧上升，大大影响了人们的生活质量^［11］。当前抑制过敏反应的药物主要包括抗组胺药、白三烯受体拮抗剂、糖皮质激素等，这些药物虽然能够有效缓解过敏症状，但长期服用易引起各种不良反应。TGP是从白芍根中提取的有效活性成分，在治疗过敏性疾病、自身免疫性疾病方面，能明显缓解临床症状，缩短病程^［9］，但目前TGP抑制过敏反应的机制尚未完全阐明。

MCs作为过敏反应的主要效应细胞，通过脱颗粒释放多种生物活性物质参与免疫和过敏反应^［12］。P815细胞是一种早期、稳定、敏感的MCs脱颗粒体外检测模型，被广泛应用于过敏性疾病的基础研究^［13］。MCs活化和释放颗粒依赖于细胞内钙离子通道^［14］，而致敏剂C48/80可以诱导细胞内钙离子浓度增加并促进离子通道的开放^［15］。MCs脱颗粒后形态变化是过敏反应的重要表现之一，通过甲苯胺蓝染色实验可以较直观地观察实验细胞形态的变化。组胺是MCs脱颗粒释放的关键介质之一，在诱导过敏性血管舒张和血管通透性改变中发挥重要作用^［16］。β-氨基己糖苷酶是一种类胰蛋白酶，是MCs脱颗粒的重要标志之一^［17］。控制组胺和β-氨基己糖苷酶的释放被认为是过敏反应改善的重要指标。本研究结果显示：TGP在一定浓度范围内可以改善致敏剂C48/80诱导的P815细胞脱颗粒形态变化，抑制细胞中组胺和β-氨基己糖苷酶的释放，同时抑制细胞内钙离子的增加，改善P815细胞活化脱颗粒的现象。

为进一步阐述TGP抑制P815细胞脱颗粒的机制，本课题组进行转录组学测序分析TGP干预前后P185细胞中的差异基因表达情况，并通过KEGG通路富集分析，探寻TGP干预的关键靶通路、靶基因。根据差异基因的KEGG富集结果和交集通路分析，发现TGP抑制MCs的药效作用通路主要是：IL-17、MAPK、JAK-STAT、TNF和NF-κB信号通路。以往的研究表明MCs脱颗粒过程是受到多种信号通路的调控，在MCs脱颗粒的过敏反应中，NF-κB的活化可以促使过敏反应过程中MCs释放组胺、蛋白酶、TNF-α等炎症介质^［18］，TNF-α又可激活NF-κB，参与转录炎症反应^［19］，抑制MAPK、NF-κB和AP-1通路的激活，从而抑制MCs脱颗粒^［20］。XU等^［21］研究发现：人参皂苷G-Rh2抑制MCs诱导的过敏反应，可能通过AKT-Nrf2/NF-κB和p38 MAPK-Nrf2/NF-κB信号通路介导。上述结果与本研究中TGP抑制MCs脱颗粒的关键靶向信号通路相互印证，证明TGP可以通过IL-17、MAPK、JAK-STAT、TNF和NF-κB等信号通路，进行多途径、多靶点地抑制MCs脱颗粒，从而发挥抗炎和抗过敏效果。

综上所述，本研究进一步肯定了TGP在治疗过敏性疾病中的潜力，揭示了多途径和多靶点的TGP抗过敏的药效作用机制，并明确了其关键靶信号途径，为开发新的抗过敏治疗方案提供切实有效的单体备选药物及实验依据。

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基金资助

福建中医药大学2022年校管临床专项课题(XB2022030)