银线莲药材质量标准研究

摘要

目的 初步建立银线莲药材质量标准。 方法 以银线莲及其5种混淆品为研究对象，通过植物形态鉴定、药材性状鉴定及组织构造及粉末特征的显微鉴定进行定性鉴别，通过测定水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量进行药材质量判定，建立HPLC-ELSD法进行有效成分goodyeroside A含量测定。 结果 银线莲及其5种混淆品在植物形态、药材性状及显微特征均存在一定差异，可作为鉴定银线莲的主要特征。银线莲的水分含量为9.67%～14.66%，总灰分含量为6.24%～11.99%，酸不溶性灰分含量为1.49%～3.94%，浸出物含量为20.38%～44.70%。使用HPLC-ELSD法测定银线莲中goodyeroside A含量为3.33%～18.21%，19批银线莲样品中有17批样品的含量在5.00%以上，而5种混淆品的含量均在5.00%以下。 结论 建立的质量分析方法可用于银线莲的质量评价，参照《广东省中药材标准：第3册》标准，以平均值的120%设限，初步拟定本品水分不超过14.14%，总灰分不超过9.65%，酸不溶性灰分不超过3.46%；以平均值的80%设限，初步拟定本品浸出物不少于29.80%，银线莲干燥品goodyeroside A含量不低于5.00%。本研究所鉴定出的银线莲性状、显微鉴别特征以及初步拟定的水分、灰分、浸出物、goodyeroside A含量限度可为其药材质量标准制定提供实验依据。

Graphical abstract

关键词

银线莲 / 畲药 / 生药鉴别 / 质量标准

银线莲来源于兰科Orchidaceae斑叶兰属Goodyera植物，该属在全世界约40种，主要分布于北温带，我国有29种，全国均有产地，以西南部和南部为多^［1］。斑叶兰属药用植物以全草入药，具有清热解毒、润肺化痰、祛风除湿、消肿止痛等功效^［2］。《福建药物志》记载斑叶兰（大斑叶兰）G.schlechtendaliana为银线莲的来源植物^［3］，银线莲可用于高热、支气管炎、喉痛、出血、糖尿病、小儿急惊风、关节痛、疔、疮、痈、毒蛇咬伤等，具有极高的药用价值^［4-6］。银线莲亦为畲族常用药材^［7］，《中国畲族医药学》^［8］、《中国畲药植物图鉴》^［9］记载其畲族名为无脑百合、土名小青，福建畲医称其为银线莲^［10］，可治疗急慢性支气管炎、咳嗽咳痰等疾病^［11］。

目前中药材市场上银线莲来源复杂，出现近缘物种混用和同名异物的现象，在一定程度上影响了银线莲的药材质量，故建立银线莲药材质量标准是十分必要的。《浙江省中草药加工炮制标准》^［12］收载了“斑叶兰”（来源于大斑叶兰G. schlechtendaliana），对其来源、炮制、性味、功效作出规定。《安徽省中药饮片炮制规范（2019级）》^［13］收载了“斑叶兰”（来源于大斑叶兰G. schlechtendaliana、小斑叶兰G. repens），对其来源、炮制、性状、性味与归经、功能与主治、用法与用量、注意、处方应用及贮藏作出规定。上述标准中的大斑叶兰饮片与银线莲属同药材不同饮片名，可以看出，目前银线莲的中药材标准还有待进一步完善。鉴于上述情况，本研究从银线莲的植物形态、药材性状、组织构造、粉末显微特征的鉴定以及水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、有效成分含量等方面进行深入研究，并与其混淆品进行比较，旨在为银线莲的品种鉴别、品质评价及质量标准的制定提供科学依据。

1 材　料

1.1 实验样品

本研究共收集6种植物样品，分别从浙江、贵州、福建、广州、安徽、四川、云南不同产地选取24批实验样品。除19批银线莲外，还收集了5种混淆品，其中包括4种银线莲同属近缘种：绿花斑叶兰G. viridiflora、绒叶斑叶兰G. velutina、多叶斑叶兰G. foliosa、高斑叶兰G. procera。还有1种是在闽西、闽南地区与银线莲同名异物的鸭跖草科植物铺地锦竹草Callisia repens。实验样品均由福建中医药大学药学院黄泽豪教授鉴定，凭证标本存放于福建中医药大学药学院中药鉴定实验室。

1.2 仪器与试剂

体视显微镜（德国Leica公司，型号：M205 C）；生物显微镜（厦门麦克奥迪实业集团公司，型号：Motic M150）；箱式电阻炉（上海实验电炉厂，型号：SX2-4-10）；万分之一电子天平（德国SARTORIOUS公司，型号：BSA224S）；十万分之一电子天平（美国OHAUS公司，型号：AR224CN）；超纯水仪（美国Millipore公司，型号：Milli-Q）；高效液相色谱仪（美国Agilent公司，型号：Agilent 1260）；ELSD蒸发光散射检测器（美国Grace公司，型号：Alltech 3300）；全自动液体样品处理工作站（厦门睿科集团股份有限公司，型号：Auto Prep 200）。

水为超纯水；盐酸（分析纯，产品批号：12701101）、乙醇（分析纯，产品批号：12800201）均购自深圳西陇科学股份有限公司；甲醇（色谱纯，产品批号：106035）、乙腈（色谱纯，产品批号：100030）均购自德国Merck公司；甲酸（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，产品批号：F1112038）；goodyeroside A对照品（宝鸡市辰光生物科技有限公司，纯度：98.00%，产品批号：HS22302B1）。

2 方法与结果

2.1 植物形态特征鉴定

对银线莲及其5种混淆品的新鲜样品分别进行形态特征观察，利用体视显微镜进行植物学解剖观察。

银线莲、绿花斑叶兰、多叶斑叶兰、绒叶斑叶兰、高斑叶兰均为草本植物，根及根茎的特征基本一致，花序皆为总状花序，但花的形态特征有所区别，在花茎、子房、苞片、萼片等不同部位有毛茸分布；铺地锦竹草为小型蔓生植物，枝蔓肉质柔软。银线莲及其5种混淆品的植物形态特征区别见表1。

2.2 药材性状鉴定

将6种植物样品的鲜品晒干或使用烘箱烘干，干燥品不作处理。观察不同批次样品的外观性状特征，包括形状、大小、色泽、质地、表面特征等，并用相机拍照记录，利用游标卡尺与直尺测量6种样品的茎直径与叶、叶柄长度。

银线莲的药材性状为：整体多皱缩，呈棕褐色或绿褐色；茎细，直径0.7～2.5 mm，有纵皱纹；根茎弯曲，节上生根，根表面被灰白色根毛；叶互生，多皱缩，完整品展开后呈卵形或卵状披针形，叶长2.0～7.0 cm，叶宽0.9～3.0 cm，前端急尖，基部较圆钝，上表面暗绿色或深褐色，可见白色不规则的网状脉纹或点状斑纹，下表面暗绿色或深褐色，可见主脉凸起，叶柄长2.0～12.0 mm，基部扩大成抱茎的鞘；花、果多掉落。其余5种混淆品可从整体性状及叶的颜色、大小及脉纹等方面与银线莲有差别，见图1。

2.3 组织构造及粉末特征的显微鉴定

选取6种新鲜植物样品的适当部位，通过徒手制片法、盐酸-间苯三酚染色法、石蜡切片法制作6种植物样品根、茎、叶（过中脉）的横切片，通过徒手撕片法制作叶上、下表皮临时装片。通过粉末制片法将上述6种植物样品制作成粉末临时装片，将制作好的装片置于生物显微镜下观察，并进行测量及记录。

2.3.1 银线莲根的横切面显微组织构造特征

表皮为一列类长方形的细胞，部分细胞向外突出形成根毛；中柱较小，皮层宽广，皮层细胞类圆形，有的含有草酸钙针晶；内皮层细胞排列较整齐，可见凯氏点与凯氏带；木质部与韧皮部呈辐射状相间排列。见图2。

2.3.2 银线莲茎的横切面显微组织构造特征

表皮细胞呈类方形或类椭圆形，排列紧密，最外层被颗粒状纹理的角质层；中柱较小，皮层宽广，薄壁细胞类圆形，有的含有草酸钙针晶；内皮层细胞排列整齐，可见凯氏点与凯氏带，外韧型维管束散生。见图3。

2.3.3 银线莲叶（过中脉）的横切面显微组织构造特征

上表皮在中脉位置下凹，由一列细胞组成，类方形或类圆形，最外层被颗粒状纹理角质层；叶肉薄壁细胞类圆形，有的含有草酸钙针晶；下表皮细胞一列，较上表皮细胞小，最外层被颗粒状纹理角质层。见图4。

绿花斑叶兰的上、下表皮细胞在主脉处较小；绒叶斑叶兰、多叶斑叶兰、高斑叶兰的维管束木质部导管呈倒“V”字型排列；铺地锦竹草叶肉薄壁细胞含有草酸钙针晶，叶缘有短锥形非腺毛。

2.3.4 银线莲叶表皮特征

银线莲的上表皮细胞呈多角形，垂周壁平直，呈连珠状增厚；下表皮细胞形状较不规则，微有角质层皱纹，垂周壁稍弯曲；气孔较多，以不定式气孔为主，保卫细胞2个，肾形，护卫细胞2～4个。

5种斑叶兰属植物的叶表皮特征较为相似，而铺地锦竹草的气孔多为平列四胞型，且上、下表皮皆可见棒状非腺毛。

2.3.5 银线莲粉末显微特征

根毛多见，呈破碎状；草酸钙针晶以成束或散在多见，可见完整或破碎的叶表皮细胞以及气孔，导管多见；带花茎及花的样品粉末中可见腺毛及花粉团块，腺毛腺头具1～4个细胞，腺柄具4～8个细胞；花粉团块黄色，卵形或椭圆形。大多数批次的样品并未带花与花茎，在一般药材粉末中，腺毛（银线莲的腺毛生长于花茎及花）与花粉团块较少见，甚至没有。见图5。

吴海清等^［14］对金线莲及银线莲进行解剖发现：银线莲中含有草酸钙柱晶，但本次研究中却并未发现柱晶，可能是因为针晶断裂后两端呈平截状，形似柱晶导致。银线莲及其混淆品的根、茎、叶的显微组织构造特征以及粉末显微特征见表2。

2.4 水分、灰分、浸出物测定

按照2020版《中华人民共和国药典：四部》^［15］中“0832烘干法”对19批银线莲样品进行水分测定；依据“2302灰分测定法”进行总灰分及酸不溶性灰分测定；照“2201”项下的热浸法进行浸出物测定，以稀乙醇作为溶剂。结果显示：银线莲的水分含量为9.67%～14.66%，平均11.78%；总灰分含量为6.24%～11.99%，平均8.04%；酸不溶性灰分含量为1.49%～3.94%，平均2.88%；浸出物含量为20.38%～44.70%，平均37.25%。参照《广东省中药材标准：第3册》标准，以平均值的120%设限^［16］，初步拟定本品水分不超过14.14%，总灰分不得过9.65%，酸不溶性灰分不得过3.46%。以平均值的80%设限^［16］，初步拟定本品浸出物不少于29.80%。

银线莲为全草入药，其根上有根毛，极易附着泥土、砂石等杂质，测定时需要确保药材的洁净度，以免影响结果的准确性。

2.5 goodyeroside A含量测定

2.5.1 色谱条件

色谱柱为HPLC氨基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈∶0.1%甲酸水（92∶8），流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL，柱温为30 ℃，雾化室温度为70℃，载气为高纯度氮气，氮气流速为1.5 L/min，增益值为4。

2.5.2 供试品溶液制备

精密称定银线莲药材粉末（过四号筛）0.15 g，置于具塞三角瓶中，精密加入40%甲醇50 mL，称定重量，以250 W、50 kHz超声处理30 min；冷却后再次称定重量，用40%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置；取上清液于离心机以12 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

2.5.3 对照品储备液制备

精密称定goodyeroside A对照品适量，加入40%甲醇进行超声溶解后转移到量瓶定容，制备得质量浓度为1.66 mg/mL对照品储备液。

2.5.4 方法学考察

2.5.4.1 线性关系

取“2.5.3”项下对照品储备液，采用40%甲醇溶剂稀释得到质量浓度为1.660 0、0.664 0、0.332 0、0.166 0、0.083 0、0.041 5、0.016 6 mg/mL对照品溶液，按照“2.5.1”项下色谱条件分别进样，记录各个对照品溶液的对应色谱峰面积。以样品浓度的对数（log C）为横坐标，以峰面积的对数（log A）为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程为Y＝1.369 2X＋4.177 3，r＝0.999 4。结果表明成分在浓度0.016 6～1.660 0 mg/mL范围内线性关系良好。

2.5.4.2 精密度

取同一份对照品溶液，连续进样6次，测得峰面积RSD值为0.60%，提示仪器精密度符合要求。

2.5.4.3 稳定性

取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进行进样测定，并记录色谱峰的峰面积，RSD为0.70%，表明银线莲供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.4.4 重复性

取同一批次的银线莲样品6份，精密称定，依法制备供试品溶液，每份样品分别进样，记录峰面积并计算goodyeroside A含量，平均含量为7.35%，RSD为0.20%，提示该方法的操作重复性符合分析要求。

2.5.4.5 系统适用性及专属性试验

分别取goodye- roside A对照品、银线莲供试品和空白溶剂样品溶液，在“2.5.1”项色谱条件下进样，结果显示：goodye-roside A的保留时间为6.95 min，理论板数按goodye-roside A峰计算应不低于3 580，在goodyeroside A的出峰位置上，空白溶剂样品无吸收峰，提示该色谱分析方法具有良好的专属性。见图6。

2.5.4.6 加样回收率

取第4批次的银线莲样品，平行称取6份，每份0.075 g，精密称定；加入与样品中goodyeroside A含量相当的对照品溶液，依“2.5.2”项下方法制备供试品溶液并进样测定含量，计算goodyeroside A的回收率与RSD，见表3。结果显示回收率为97.31%～100.11%，RSD为1.20%，表明该方法加样回收率良好。

2.5.5 样品含量测定与分析

按“2.5.2”项下方法制备不同批次供试品溶液，再按“2.5.1”项下色谱条件进样测定并记录峰面积。根据标准曲线计算含量，得到goodyeroside A含量测定结果，见表4。表中显示：银线莲中goodyeroside A含量为3.33%～18.21%，平均含量为10.62%；混淆品中绿花斑叶兰中含量为1.09%，多叶斑叶兰中含量为2.17%，高斑叶兰中含量为4.78%，绒叶斑叶兰中含量为4.89%，铺地锦竹草中未检出。19批银线莲样品中有17批goodyeroside A含量均在5.00%以上，而5种混淆品goodyeroside A含量均在5.00%以下，初步拟定银线莲干燥品goodyeroside A含量不得低于5.00%。

3 讨　论

在实地考察中，发现银线莲药材存在混淆品（包括同属近缘物种以及同名异物种），故本研究将这5种混淆品与银线莲一同进行鉴定研究，旨在确定银线莲的鉴别特征及其与混淆品的区别点，为制定银线莲的药材质量标准提供依据。

通过植物形态鉴定研究，对样品的整体及局部特征如根、茎、叶、花等部位进行详细的观察、描述及记录，确定了银线莲及其混淆品的形态特征区别。通过药材性状特征研究，发现从叶的大小、颜色、脉纹等特征就可以对这几种药材进行大致区分。显微鉴定结果显示，5种斑叶兰属植物的显微特征有一定的相似性，但在根维管束木质部束数量、叶横切面构造、针晶长度、导管类型等方面存在差异；而铺地锦竹草的显微特征与银线莲差异较大。

据文献报道，银线莲的成分主要有黄酮类、酚酸类、内酯类等^［17］，其中goodyeroside A为主要有效成分^［18］，具有保肝、抗炎等活性^［19-20］，故银线莲goodyeroside A含量进行测定。根据银线莲水分、灰分、浸出物、goodyeroside A含量检测结果以及《广东省中药材标准：第3册》^［16］的药品标准，初步拟定银线莲水分不超过14.14%，总灰分不超过9.65%，酸不溶性灰分不超过3.46%，浸出物不少于29.80%，干燥品goodyeroside A含量不低于5.00%。

银线莲为福建、浙江地区畲族常用药材^［9-10］，但目前其质量标准尚未完善，质量监管缺乏依据，难以实现药材质量的标准化，故应尽快完善其质量标准体系，严格监管药材质量，这对其临床疗效和安全性都有非常重要的意义。本研究分别从银线莲植物形态、药材性状、显微特征以及其水分、灰分、浸出物含量测定等方面对银线莲及其5种混淆品进行比较研究，确定银线莲的主要鉴别特征，建立含量测定方法，拟定水分、总灰分、酸不溶性灰分以及goodyeroside A含量的限度，可为银线莲的药材鉴别、品质评价及质量标准制定提供实验依据。

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基金资助

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福厦泉国家自主创新示范区福建特色道地药材生产关键技术协同创新平台项目(2023-P-005)