滋肾育胎丸对多囊卵巢综合征大鼠模型子宫内膜胰岛素抵抗的影响

摘要

目的 观察滋肾育胎丸对多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠模型子宫内膜胰岛素抵抗的影响，以探讨其提高临床妊娠率的可能机制。 方法 将42只21日龄具有正常动情周期的雌性SD大鼠按照随机数字表法分为空白组12只和造模组30只。造模组采用去氢表雄酮（DHEA）联合绒促性素（HCG）建立PCOS大鼠模型，从造模第10天起连续阴道细胞涂片检查10 d，观察到上皮细胞呈持续角化4 d及以上判定PCOS模型成功。从造模成功的造模组中随机选择24只大鼠按随机数字表法分为模型组和滋肾育胎丸低、中、高剂量组，每组6只。低、中、高剂量组均按体质量10 mL/（kg·d）分别给予0.16、0.24、0.32 g/mL滋肾育胎丸混悬液灌胃，空白组和模型组给予同等剂量灭菌水灌胃，每日1次。干预21 d后采用酶联免疫吸附法检测5组大鼠血清空腹胰岛素（FINS）及脂联素（APN）水平，HE染色法观察5组大鼠子宫组织病理形态学变化，免疫组化法检测5组大鼠子宫内膜中葡萄糖转运体-4（GLUT-4）和胰岛素受体底物-1（IRS-1）、胰岛素受体底物-2（IRS-2）蛋白表达。 结果 与空白组比较，模型组血清FINS升高，APN降低，子宫内膜GLUT-4、IRS-1、IRS-2蛋白表达水平降低（P＜0.05）。与模型组比较，低、中剂量组血清APN升高，FINS降低，子宫内膜IRS-1、IRS-2和GLUT-4蛋白表达升高（P＜0.05）。HE染色观察到正常组大鼠子宫内膜较厚，由排列整齐的单层柱状上皮细胞和间质组成；模型组子宫腔上皮细胞高度增加，可见假复层；低、中剂量组子宫腔局部上皮细胞高度有所降低，未见假复层；高剂量组子宫腔上皮细胞排列不规则，可见假复层。 结论 滋肾育胎丸可以改善PCOS大鼠模型子宫内膜胰岛素抵抗状态，其机制可能与提升血清APN水平，增加子宫内膜GLUT4、IRS-1、IRS-2蛋白表达有关。

Graphical abstract

关键词

多囊卵巢综合征 / 滋肾育胎丸 / 子宫内膜 / GLUT-4 / IRS-1 / IRS-2

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄期女性最常见的内分泌紊乱疾病之一，胰岛素抵抗或高胰岛素血症是PCOS发生的重要病理因素^［1］。临床约有50%～70%PCOS患者存在胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）现象^［2］。研究表明PCOS患者的子宫内膜中存在局部IR^［3］，影响了PCOS的子宫内膜容受性，降低妊娠率，同时也增加了子宫内膜病变的风险^［4］。葡萄糖转运体-4（GLUT-4）是维持机体葡萄糖稳态的关键因素，胰岛素受体底物（IRS）是胰岛素信号转导通路中受体后信号传导的重要蛋白^［5］。滋肾育胎丸源自妇科泰斗罗元凯的经验方，其在寿胎丸的基础上加用健脾益气药物，具有补肾健脾、益气养血的功效，本课题组前期临床研究发现，在西药常规治疗PCOS不孕症中加用滋肾育胎丸可提高妊娠率、降低流产率^［6］。因此，本研究拟通过建立PCOS大鼠模型，观察滋肾育胎丸对PCOS大鼠模型子宫内膜相关蛋白表达的影响，以探讨滋肾育胎丸治疗PCOS的机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

42只21日龄SPF级SD雌性大鼠，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2020-0002，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。由福建中医药大学SPF级动物饲养室饲养，期间恒温恒湿，室温在18～22 ℃，空气湿度50%左右，12 h昼夜间断循环照明，自由摄食和饮水。本实验已通过福建中医药大学实验动物伦理委员会审查（审批号：FJTCM IACUC 2020373）。

1.2 实验药物

滋肾育胎丸（广州白云山中一药业有限公司，产品批号：B01040）。

1.3 试剂与仪器

去氢表雄酮（DHEA，上海麦克林生化科技有限公司，货号：B1375）；注射用绒促性素（HCG，马鞍山丰原制药有限公司，产品批号：210711-1）；注射用油剂（江西益普生药业有限公司，货号：S817900）；HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1120）；胰岛素ELISA检测试剂盒（批号：CEA448Ra）、脂联素ELISA检测试剂盒（批号：SEA605Ra）均购自武汉云克隆科技股份有限公司；GLUT-4抗体（批号：YT5523）、IRS-1抗体（批号：YT2410）均购自瑞英生物科技（福建）有限公司；IRS-2抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：20702-1-AP）；光学显微镜（日本Olympus公司，型号：BX43）；酶标仪（美国BioTek公司，型号：Epoch2）。

2 方　法

2.1 药液制备

滋肾育胎丸分别取51.2、76.8、102.4 g置入研钵研粉，研粉后加入320 mL蒸馏水，超声助溶，配制成0.16、0.24、0.32 g/mL混悬液，灭菌摇匀后，4 ℃冷藏备用。

2.2 动物造模及分组给药

采用随机数字表法将称重后大鼠分为空白组12只和造模组30只。造模组于颈背部每日分别按体质量0.6 mg/（kg·d）皮下注射溶于0.2 mL注射用油剂的DHEA和1.5 IU/d HCG注射液，空白组于颈背部每日皮下注射0.2 mL注射用油剂，共20 d^［7］。从造模第10天起每天进行阴道细胞涂片检查，共10 d，观察到上皮细胞持续角化4 d及以上判定PCOS模型成功。造模成功的24只大鼠按随机数字表法分为模型组、低、中、高剂量组各6只。低、中、高剂量组均按体质量10 mL/（kg·d）分别给予0.16、0.24、0.32 g/mL滋肾育胎丸混悬液灌胃，空白组和模型组给予同等剂量灭菌水灌胃，每日1次，连续21 d。造模及干预期间均普通饲料喂养。

2.3 标本采集

灌胃21 d后，5组大鼠禁食禁饮8 h，1%戊巴比妥麻醉后腹主动脉取血，全血经离心机3 500 r/min离心5 min分离出血清置，于-20 ℃保存。取血后取双侧卵巢和子宫，一侧子宫和卵巢置于4%多聚甲醛固定用于后期HE染色和免疫组化实验，另一侧置于-196 ℃液氮保存2～3 h后转-70 ℃冰箱保存留作后续实验。

2.4 大鼠血清脂联素（APN）、空腹胰岛素（FINS）水平检测

将实验所需试剂及血清放置室温，平衡30 min后进行操作；分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，将样品加于酶标板孔底部，晃动混匀；封板后置37 ℃温育30 min；揭掉封板膜，弃去液体，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干；除空白孔外每孔加入酶标试剂50 μL；重复温育和洗涤；加入显色剂显色；加终止液终止反应，15 min内测定每孔的吸光度。计算出血清APN和FINS水平。

2.5 大鼠子宫组织病理形态学变化观察

将采集固定好的子宫组织进行石蜡包埋，按4 µm厚度进行石蜡切片，切片后在恒温水内摊开展平，向水中斜插入载玻片，使切片附着于载玻片上，将贴好的组织切片置于60 ℃恒温箱内2 h；二甲苯脱蜡10 min，经梯度乙醇脱苯，最后经蒸馏水清洗后转入染液；苏木精染液染色1～2 min，盐酸乙醇分色片刻，充分水洗后显蓝；0.5％伊红染液染色2～3 min，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明后封片。光学显微镜下观察大鼠子宫组织病理形态学变化。

2.6 大鼠子宫内膜组织中GLUT-4、IRS-1、IRS-2蛋白表达检测

固定好的子宫组织以乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（厚度为5 µm）。取连续标本切片5张，严格按照购买的免疫组化试剂盒说明书进行操作。首先将石蜡切片脱蜡至水再进行抗原修复；之后进行内源性过氧化物酶阻断及山羊血清封闭30 min；接着加一抗过夜孵育、二抗孵育1.5 h，等待DAB（3，3'-二氨基联吡啶）显色。最后复染细胞核、脱水封片，光镜下拍照。光镜下呈棕褐色的细胞质为阳性表达。每张切片随机选择5个视野，使用Servicebio Case Viewer 2.3分析图像的阳性累积光密度DOI值和阳性面积（Area），分别计算GLUT-4、IRS-1、IRS-2蛋白的平均光密度（MOD），平均光密度值越大则蛋白表达水平越高。

MOD＝IOD/Area

2.7 统计学方法

实验数据采用SPSS 23.0软件进行处理分析，满足正态分布的计量资料以（\overline{x}±s）表示，方差齐时2组比较采用Student's t检验，方差不齐时采用Welch's t检验。多组比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t或Dunnett's T3法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 5组大鼠血清APN、FINS水平比较

见表1。

3.2 5组大鼠子宫组织病理形态学变化

正常组大鼠子宫内膜较厚，由排列整齐的单层柱状上皮细胞和间质组成，子宫腺体较多，腺腔规整。与正常组比较，模型组大鼠子宫腔上皮变厚，排列不规则，可见假复层，上皮细胞可见胞质空泡，子宫肌层厚度增厚。与模型组相比，滋肾育胎丸低、中剂量组大鼠子宫上皮细胞胞质未见空泡，腔上皮高度降低，未见假复层，子宫肌层厚度变薄；高剂量组子宫腔上皮细胞可见空泡，排列不规则，见假复层。见图1。

3.3 5组子宫内膜组织中GLUT-4、IRS-1、IRS-2蛋白表达

见表2和图2。

4 讨　论

传统医学中没有PCOS对应的病名，但是根据其临床表现，可参考对应月经病中的月经后期、月经量少、崩漏、闭经、不孕、癥瘕等疾病^［8］。多数中医学者认为PCOS的发病与肾、脾、肝关系密切，肾、脾、肝脏腑功能失调是PCOS主要病机，补肾健脾、疏肝解郁、理气化痰、活血化瘀是治疗PCOS的主要思路^［9］。“肾主生殖”学说认为PCOS的发生主要是由于肾-天癸-冲任-胞宫生殖轴功能失调导致，其中肾虚是根本^［8］。既往研究表明，滋肾育胎丸具有降低流产率、改善子宫内膜容受性的作用^［10-11］。我们前期采用滋肾育胎丸治疗PCOS患者，可以提高妊娠率、降低流产率，初步推测其作用机制可能与调节子宫内膜糖代谢有关。

在人和动物子宫内膜上有GLUT-1和GLUT-4表达，其中GLUT-4可增加葡萄糖的摄取，且为协调生殖功能的重要因子，参与调节子宫内膜的多种功能^［12］。GLUT-4表达降低会使细胞对葡萄糖的摄取和利用降低，出现糖代谢异常；IRS在IR中发挥重要作用。本实验结果显示：模型组子宫组织中GLUT-4、IRS-1、IRS-2蛋白表达降低，提示子宫组织存在细胞糖代谢能力障碍；滋肾育胎丸低、中剂量组大鼠子宫组织中GLUT-4、IRS-1、IRS-2蛋白表达增加，但高剂量组上述指标变化无统计学意义，提示滋肾育胎丸可能通过改善子宫组织中相关糖代谢蛋白受损状态，提高胰岛素的敏感性，改善PCOS子宫内膜容受性，但非剂量依赖性。其是否存在剂量相关性调节有待进一步研究。

APN是一种蛋白激素，有研究发现，APN对胰岛素有增敏作用，并与子宫内膜癌细胞的发生、发展呈负相关^［13］。APN水平下降与肥胖、胰岛素抵抗等疾病密切相关^［14］。PCOS普遍存在胰岛素抵抗，本实验结果显示：DHEA结合HCG建立的PCOS大鼠模型存在高FINS和低APN水平，以及胰岛素抵抗，予滋肾育胎丸低、中剂量灌胃治疗后血清APN升高、FINS降低，提示滋肾育胎丸可能通过提高APN水平来降低胰岛素从而改善胰岛素抵抗。

综上所述，滋肾育胎丸可以升高PCOS模型大鼠血清APN水平，促进子宫组织中IRS-1、IRS-2、GLUT-4蛋白表达水平上调，从而改善PCOS的治疗结局，但其是否通过APN调控相关蛋白的表达，有待进一步研究。

参考文献

[1] 谢幸，孔北华，段涛. 妇产科学［M］ . 9版. 北京：人民卫生出版社，2018：348-351.

[2] 林佳，蒋琪，石玉华. 多囊卵巢综合征诊断分型及临床意义［J］. 中国实用妇科与产科杂志，2019，35（3）：267-271.

[3] 李慕白，陈靖馨，马红丽，等. 多囊卵巢综合征子宫内膜胰岛素抵抗的研究进展［J］. 中国医药导报，2019，16（29）：49-52.

[4] WANG T， ZHANG J， HU M，et al. Differential expression patterns of glycolytic enzymes and mitochondria-dependent apoptosis in PCOS patients with endometrial hyperplasia，an early hallmark of endometrial cancer，In vivo and the impact of metformin in vitro ［J］. Int J Biol Sci，2019，15（3）：714-725．

[5] 齐家，孙赟，陈子江. 多囊卵巢综合征子宫内膜胰岛素抵抗的分子机制及生物学效应［J］. 中华生殖与避孕杂志，2018，38（6）：513-516.

[6] 许榕倩，刘芸，林舒. 滋肾育胎丸治疗肾阳虚型多囊卵巢综合征不孕症疗效观察［J］. 福建中医药，2021，52（11）：56-57.

[7] 中华中医药学会中药实验药理专业委员会. 多囊卵巢综合征动物模型制备规范（草案）［J］. 中华中医药杂志，2019，34（6）：2576-2579.

[8] 贾汝楠，刘玉兰. 多囊卵巢综合征中西医研究进展［J］. 世界中医药，2020，15（12）：1827-1835.

[9] 黄一鸣，康开彪，潘文，等 ．基于数据挖掘多囊卵巢综合征的中医辨证用药规律分析［J］. 新中医，2018，50（6）：61-64.

[10] 高琦，王春华，蔡霞. 滋肾育胎丸对促排卵小鼠着床期子宫内膜HOXA10及下游基因整合素β3表达的影响［J］. 生殖医学杂志，2015，24（7）：578-582.

[11] 高琦，田海清，王松峰，等. 滋肾育胎丸对促排卵小鼠不同着床期子宫内膜HOXA10及下游基因EMX2表达的调控作用［J］. 广州中医药大学学报，2017，34（4）：570-575.

[12] STROWITZKI T， CAPP E， VON Wolff M，et al. Expression of glucose transporter 1 in human endometrial and decidual tissu ［J］. Gynecol Endocrinol，2001，15（3）：219.

[13] 邝姮，黎小斌，骆赟韵. 多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的研究进展［J］. 广东医学，2014，35（15）：2461．

[14] 党洁梅，刘婵桢，张洁清. 脂联素、胰岛素抵抗与子宫内膜癌的发生发展［J］. 国际妇产科学杂志，2017，44（2），159-162.

基金资助

福建省卫生健康青年科研课题(2020QNA067)