藿砂口服液对感染后肠易激综合征脾虚夹湿证大鼠的作用

摘要

目的 探讨藿砂口服液对感染后肠易激综合征（PI-IBS）脾虚夹湿证大鼠的作用。 方法 将45只SPF级Wistar雄性大鼠采用随机数字表法分为对照组10只、模型组10只和病证组25只，实验第1天模型组采用三硝基苯磺酸（TNBS）灌肠1次建立PI-IBS模型，病证组在模型组基础上置于高湿环境以建立脾虚夹湿证PI-IBS模型，对照组不做任何处理，3组均采用12 h昼夜交替照明，水料自由饮用，持续28 d。实验第29天进行模型评价，并采用随机数字表法从3组中各抽选5只大鼠观察结肠组织病理形态。与正常组比较，模型组大鼠出现体质量下降，24 h进食量减少，粪便含水率、内脏疼痛评分升高，糖水偏好率下降，结肠组织苏木精-伊红（HE）染色显示出现炎症细胞浸润，提示PI-IBS造模成功；与模型组比较，病证组大鼠出现神态萎靡、毛发枯槁、蜷缩聚堆，进食量减少，体质量下降，提示脾虚夹湿证PI-IBS造模成功。造模成功后将病证组20只采用随机数字表法分成阴性组及藿砂口服液低、中、高剂量组各5只，低、中、高剂量组分别按照体质量予1.35、2.7、5.4 mL/kg藿砂口服液2.0 mL灌胃，对照组、模型组和阴性组均予生理盐水2.0 mL灌胃，6组均为1次/d，干预14 d。实验第42天给药后比较6组大鼠一般状态、24 h进食量、体质量、粪便含水率、内脏疼痛评分和糖水偏好率，HE染色观察结肠组织病理形态，ELISA检测结肠组织中白介素-17（IL-17）、白介素-21（IL-21）与白介素-22（IL-22）含量，Western blot检测结肠组织中紧密连接蛋白-1（Claudin-1）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）与闭合蛋白（OCLN）表达量。 结果 与对照组比较，模型组24 h进食量、体质量、糖水偏好率均降低（P＜0.05），粪便含水率、内脏疼痛评分均升高（P＜0.05）；结肠组织HE染色可见炎症细胞浸润、间质水肿；结肠组织中IL-17、IL-21含量均升高（P＜0.05）；结肠组织中E-cadherin、OCLN、Claudin-1蛋白表达量均降低（P＜0.05）。与模型组比较，阴性组体质量、24 h进食量均降低（P＜0.05）；IL-17、IL-21含量均升高（P＜0.05）。与阴性组比较，高剂量组24 h进食量、体质量、糖水偏好率均升高（P＜0.05），粪便含水率、内脏疼痛评分均降低（P＜0.05），结肠组织HE染色显示炎症浸润减少、间质水肿减轻；结肠组织中IL-17、IL-21含量降低（P＜0.05）、IL-22含量升高（P＜0.05）；结肠组织中Claudin-1、E-cadherin与OCLN蛋白表达量升高（P＜0.05）。中剂量组仅有E-cadherin蛋白表达量升高（P＜0.05），IL-17、IL-21含量降低（P＜0.05），IL-22含量升高（P＜0.05），其他指标变化不明显。低剂量组上述指标较阴性组差异均无统计学意义（P＞0.05）。 结论 藿砂口服液可以增加脾虚夹湿证PI-IBS大鼠24 h进食量、体质量，升高糖水偏好率，同时降低粪便含水率、内脏疼痛评分，减轻结肠炎症反应，从而修复结肠黏膜屏障功能。

Graphical abstract

关键词

感染后肠易激综合征 / 脾虚夹湿证 / 藿砂口服液

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一种功能障碍性胃肠道疾病，以反复腹痛、腹胀、排便习惯和（或）性状改变等为主要特征^［1-2］。流行病学调查显示，IBS的全球患病率约为10%，其中东南亚地区总患病率为12.6%，临床以腹泻型肠易激综合征（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D）最为常见^［3］。目前认为IBS-D的发病机制涉及肠道低度炎症反应、内脏高敏感、脑-肠轴、肠道菌群及胃肠动力异常等有关^［4］。感染后肠易激综合征（post-infective irritable bowel syndrome，PI-IBS）是早期胃肠道感染恢复后出现持续性腹痛、腹泻等症状的一种常见的IBS疾病类型，属于IBS-D的范畴^［5］，在中医属于“泄泻”“腹痛”等范畴，涉及肝、脾（胃）、肾三脏，病机以湿邪为中心，脾胃虚弱、肝失疏泄、脾肾阳虚为病机关键。藿砂口服液是我院院内制剂，临床长期用于治疗脾虚夹湿证PI-IBS患者，疗效显著。前期研究证实该方对急、慢性腹泻均有疗效^［6-8］，但具体作用机制尚未明确。本研究通过观察藿砂口服液对脾虚夹湿证PI-IBS大鼠的治疗作用，探讨其调节结肠低度炎症反应及修复结肠黏膜屏障的作用机制，为进一步推广提供新的依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

6～8周龄SPF级雄性Wistar大鼠45只，体质量180～200 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号码：SCXK（沪）2022-0004；饲养于福建中医药大学SPF级动物房内，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2020-0002。动物房温度（24±2）℃，相对湿度50%～70%，12 h昼夜交替照明，水料自由饮用。本实验经福建中医药大学动物伦理委员会批准（审批号：FJTCM IACUC 2023080），并严格遵守国家实验动物卫生指导使用原则。

1.2 药品与试剂

藿砂口服液（福建中医药大学附属人民医院院内制剂，批准文号：闽药制字Z06106047，批号：230102）。戊巴比妥钠（货号：P3761），三硝基苯磺酸（TNBS，货号：P2297-10ML）均购自美国Sigma公司；白介素-17（IL-17）试剂盒（货号：CSB-E07451r）、白介素-21（IL-21）试剂盒（货号：CSB-E11843r）、白介素-22（IL-22）试剂盒（货号：CSB-E14918r）均购自武汉华美生物有限公司；Claudin-1抗体（货号：YT0942）、E-cadherin抗体（货号：YM0207）、OCLN抗体（货号：YN2865）均购自美国Immunoway公司；β-actin抗体（货号：ab8226）、Rabbit IgG（H＋L）（货号：ab172730）均购自美国Abcam公司；苏木精-伊红（HE）染液（货号：0812A22）购自北京雷根生物技术有限公司。

1.3 实验仪器

组织包埋机（武汉俊杰电子有限公司，型号：JB-L5）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016型）；光学显微镜（日本尼康公司，型号：ECLIPSEE100型）；电泳仪（型号：Mini PROTRAN）、转印仪（型号：Trans-blot）均购自美国Bio-Rad公司。

2 实验方法

2.1 造模与分组

45只SPF级Wistar雄性大鼠采用随机数字表法分为对照组10只、模型组10只、病证组25只。按照文献［9-10］，采用TNBS（1 mol/L）、无水乙醇与生理盐水配制TNBS灌肠液（比例为51∶150∶299）。3组大鼠禁食不禁水24 h后，按体质量0.25 mL/100 g腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉。模型组、病证组予TNBS灌肠液0.5 mL灌肠，对照组予生理盐水0.5 mL灌肠；将3组大鼠倒立3～5 min后置于保温垫，待大鼠清醒后，病证组大鼠置于相对湿度（95±5）%，室温（24±2）℃高湿环境中，对照组、模型组大鼠置于相对湿度50%～70%，室温（24±2）℃环境中。3组均采用12 h昼夜交替照明，水料自由饮用，持续28 d。实验第29天进行模型评价，并采用随机数字表法从3组中各抽选5只大鼠观察结肠组织病理形态。造模成功后将病证组20只采用随机数字表法分成阴性组及藿砂口服液低、中、高剂量组各5只。

2.2 药物干预

实验第29天开始，低、中、高剂量组按体质量分别予1.35、2.7、5.4 mL/kg藿砂口服液2.0 mL灌胃，对照组、模型组和阴性组均予生理盐水2.0 mL灌胃，6组均每天1次，干预14 d。药物干预期间病证组大鼠均置于相对湿度（95±5）%，室温（24±2）℃高湿环境中，对照组、模型组大鼠均置于相对湿度50%～70%，室温（24±2）℃环境中，采用12 h昼夜交替照明，水料自由饮用直至第42天。

2.3 粪便含水率

实验第42天给药后收集6组大鼠粪便并称重得到粪便湿重，之后放入60 ℃烘箱内烘干4 h后称重得到粪便干重，计算粪便含水率，公式：

粪便含水率＝（湿重－干重）/湿重×100%

2.4 内脏疼痛评分

参照腹壁撤退反射实验方法^［10］，大鼠禁食不禁水12 h后，提尾30 s以促进排空大便；将导尿管经肛门插入至距肛门6 cm，等待20 min后向导尿管囊内快速注气，当压力达到40 mm Hg（1 mm Hg≈0.133 kPa）时维持20 s，放气，再重复注气2次，每次间隔5 min。观察6组大鼠行为反应并按照以下标准评分：0分，无明显行为变化；1分，身体不动或仅有简单的头部运动；2分，腹部肌肉开始收缩；3分，下腹壁抬离测试平面或明显收缩变平；4分，腹壁拱起或伴身体、骨盆躬起。每只大鼠均评分3次，取平均值。

2.5 糖水偏好率

参照糖水消耗实验方法^［10］，在实验第39、40天进行糖水适应性训练：第39天放入2瓶装有1%蔗糖溶液的水瓶，第40天将其中1瓶1%蔗糖溶液换成蒸馏水溶液，12 h后调换水瓶位置。实验第41天，6组大鼠均禁食禁水24 h；实验第42天让每只大鼠自由饮用1瓶1%蔗糖溶液和1瓶蒸馏水溶液，测量并记录6 h大鼠饮用量，计算糖水偏好率。

糖水偏好率＝蔗糖水饮用量/（蒸馏水饮用量＋蔗糖水饮用量）×100%

2.6 24 h进食量

每只大鼠给予同等质量饲料，24 h后称量剩余饲料的质量，计算24 h进食量。

24 h进食量＝给予饲料质量－剩余饲料质量

2.7 处死与取材

上述指标检测完成后，6组均按照体质量0.25 mL/100 g腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉后，脱颈处死大鼠，截取大鼠近端结肠组织分为3段，其中1段置于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色观察结肠组织病理形态，另外2段置于-80 ℃冰箱保存，分别用于ELISA检测IL-17、IL-21及IL-22含量，同时应用Western blot检测E-cadherin、OCLN及Claudin-1蛋白的相对表达量。

2.8 HE染色观察结肠组织病理形态

取出置于4%多聚甲醛中固定的结肠组织，石蜡包埋、切片、脱蜡、HE染色、封片，采用电子显微镜观察组织病理形态并拍照。

2.9 ELISA检测6组结肠组织IL-17、IL-21及IL-22含量

严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测各组大鼠结肠组织中IL-17、IL-21及IL-22含量。

2.10 Western blot检测6组结肠组织中E-cadherin、OCLN及Claudin-1蛋白的表达量

提取结肠组织蛋白，根据BCA蛋白定量试剂盒说明书测定蛋白浓度。其后进行蛋白变性、电泳、转膜、封闭、E-cadherin、OCLN及Claudin-1一抗孵育（1∶1 000稀释）、二抗孵育（1∶5 000稀释）。使用ECL发光液按1∶1混合后，滴加到PVDF膜上反应1 min，将膜置于化学发光凝胶成像仪暗室中，使用GIS机箱控制软件V2.0进行曝光扫描，ImageJ软件读取条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白β-actin条带灰度值的比值作为目的蛋白的表达量。

2.11 统计学方法

采用SPSS 27.0软件进行数据处理，计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 PI-IBS大鼠模型构建情况

与对照组比较，模型组出现体质量下降，进食量减少，粪便含水率增加，内脏疼痛评分升高，糖水偏好率下降，结肠组织HE染色出现炎症细胞浸润、间质水肿，提示PI-IBS造模成功，见表1和图1。与模型组比较，病证组大鼠神态萎靡，毛发枯槁，蜷缩聚堆，进食量减少，体质量下降，提示脾虚夹湿证PI-IBS造模成功^［10］。

3.2 6组体质量、24 h进食量、粪便含水率、内脏疼痛评分、糖水偏好率比较

见表2。

3.3 6组结肠组织病理形态比较

藿砂口服液各剂量组结肠黏膜组织炎症细胞浸润较阴性组明显减少，间质水肿明显改善。见图2。

3.4 6组结肠组织IL-17、IL-21及IL-22含量比较

见表3。

3.5 6组结肠组织中E-cadherin、OCLN及Claudin-1蛋白表达量比较

见图3及表4。

4 讨　论

IBS是一种临床常见的功能性肠病，主要表现为慢性或复发性腹痛、大便性状和排便习惯异常^［11］，该病在我国的患病率逐年升高^［12］，缺乏有效治疗手段。藿砂口服液是福建中医药大学附属人民医院的院内制剂，源自严守正等几位名老中医专家共同研发的经验方，由广藿香、砂仁、陈皮、苍术、厚朴等组成，具有化湿和胃、健脾止泻功用，从上世纪50年代沿用至今，久经临床验证，用于治疗脾虚夹湿证IBS-D疗效显著，但其疗效机制暂未阐明。目前普遍认为，IBS的发病机制与肠道炎症反应相关，直接或间接导致肠道屏障功能缺陷，肠黏膜屏障受损进而激活免疫反应，最终表现为肠组织长时间处于炎症状态^［13］。肠黏膜屏障一旦受损，可能会引起炎症、感染，甚至加剧其他疾病的发展，修复肠黏膜屏障有助于肠黏膜愈合及实现组织学缓解^［14］。因此，促进肠黏膜屏障的修复成为IBS更理想的治疗目标^［15］。

IBS动物模型因症状相似度高、模型稳定而被国际上广泛采用，其中TNBS造模方法符合内脏高敏感及肠道炎症的特征。本研究通过TNBS灌肠结合高湿环境的造模方法，建立脾虚夹湿证PI-IBS的病证结合模型。与传统的PI-IBS模型进行比较，结果表明：病证结合模型，不仅能反映PI-IBS的疾病特征，也能在一定程度上模拟脾虚夹湿的证候和症状特点。疾病方面，通过观察造模后大鼠一般情况、体质量、24 h进食量、粪便含水率、内脏疼痛评分、糖水偏好率及结肠组织病理形态对PI-IBS疾病特征进行评价。结果表明：造模后，与对照组比较，模型组大鼠出现体质量、24 h进食量、糖水偏好率下降，粪便含水率、内脏疼痛评分升高，结肠组织HE染色出现不同程度的炎症细胞浸润，并可见间质水肿，提示大鼠出现PI-IBS的疾病特征。证候方面，与模型组比较，病证组大鼠出现神态萎靡、毛发枯槁、蜷缩聚堆，体质量、24 h进食量下降，提示在高湿环境中造模的PI-IBS大鼠与脾虚夹湿证候的特点相吻合^［16-17］。药物治疗后，与阴性组对比，高剂量组24 h进食量、体质量、糖水偏好率升高，粪便含水率、内脏疼痛评分降低，结肠组织HE染色炎症细胞浸润减少、间质水肿减轻，提示藿砂口服液可改善脾虚夹湿证PI-IBS大鼠证候及症状，减轻结肠黏膜炎症，修复结肠黏膜屏障损伤。

肠上皮细胞内的紧密连接蛋白（Claudins）是保持肠道黏膜完整性的关键，其中闭锁蛋白（OCLN）、Claudin-1与钙黏蛋白（E-cadherin）均是紧密连接相关蛋白中的重要蛋白，在正常上皮组织的修复中起着关键作用。既往研究提示紧密连接关键蛋白Occludin、Claudin-1的低表达可能是黏膜损伤的关键因素^{［15，18］}；E-cadherin则与肠道黏膜的选择透过性密切相关^［19］。细胞因子是肠道炎症调控的关键信号，其中IL-17作为机体的效应因子，能够诱导机体炎症反应，并调控中性粒细胞的增殖；IL-21是调节机体免疫应答的关键细胞因子，除了调节T细胞和B细胞的增殖外，还与NK细胞的成熟和增殖密切相关；IL-22由多种免疫细胞产生，能够维持和修复肠道屏障完整性和调节免疫反应^［20-22］。本研究结果发现：与对照组比较，HE染色显示模型组结肠组织出现炎症细胞浸润、间质水肿；结肠组织中E-cadherin、OCLN、Claudin-1蛋白表达量均降低；结肠组织中IL-17、IL-21含量均升高，提示模型组大鼠肠道黏膜屏障功能受损。与阴性组比较，高剂量组结肠组织HE染色炎症细胞浸润减少、间质水肿减轻；结肠组织中IL-17、IL-21含量降低、IL-22含量升高；结肠组织中Claudin-1、E-cadherin与OCLN蛋白表达量升高，中、低剂量组的上述指标变化不明显，提示高剂量的藿砂口服液可减轻结肠黏膜炎症，修复结肠屏障功能。

综上，藿砂口服液可增加大鼠24 h进食量、体质量，升高糖水偏好率，降低粪便含水率、内脏疼痛评分，减轻结肠炎症反应，从而修复结肠黏膜屏障功能。

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基金资助

福建省自然科学基金面上项目(2021J01899)

福建省教育厅中青年教师教育科研课题(JAT200192)

福建中医药大学附属人民医院基础提升计划专项研究课题(JCZX202319)