茶素柠檬合剂抑制耳廓痤疮模型大鼠炎症反应的作用研究

Mechanism of Tea-Lemon Mixture Inhibiting the Inflammatory Response of Auricular Acne Model Rats

摘要

目的 研究茶素柠檬合剂对耳廓痤疮模型大鼠炎症反应的作用及机制。 方法 采用随机数字表法将32只雄性SD大鼠分为正常组8只和造模组24只。造模组左耳廓皮内注射痤疮丙酸杆菌液50 μL，腹腔注射痤疮丙酸杆菌液1 mL建立大鼠耳廓痤疮模型，当痤疮模型判定分级≥1级，则判定为造模成功。造模成功后将造模组采用随机数字表法分为对照组、模型组和给药组，每组8只。在大鼠左耳廓正反两面，对照组外涂0.1%维A酸乳膏0.2 mL，给药组外涂茶素柠檬合剂0.5 mL，正常组和模型组外涂生理盐水，1次/d，连续14 d。末次给药2 h后抽取腹主动脉血和切取1/4左耳廓组织，采用HE染色法观察左耳廓痤疮组织病理形态学改变，采用游标卡尺测定干预前后左耳肿胀度；采用ELISA和Western blot分别测定血清和左耳廓痤疮组织中白细胞介素-1α（IL-1α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量和蛋白表达水平。 结果 与正常组比较，模型组左耳廓组织出现明显炎症细胞浸润，左耳肿胀度，血清和左耳廓痤疮组织中IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α含量和蛋白表达水平均明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，对照组和给药组左耳廓组织炎症细胞浸润均有不同程度的改善，左耳肿胀度，血清和左耳廓痤疮组织中IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α含量和蛋白表达水平均明显减少（P＜0.05）。对照组和给药组上述指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论 茶素柠檬合剂可降低血清和左耳廓痤疮组织中炎症因子IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α含量和蛋白表达水平，降低耳部肿胀，从而减轻痤疮炎症反应，发挥治疗痤疮的作用。

Abstract

Objective To observe the effect of tea-lemon mixture on the inflammatory response of auricle acne model rats. Methods Thirty-two male SD rats were divided into normal group (n=8) and model-making group (n=24) by random number table method. The rats of model-making group were injected with 50 μL of propionibacterium acnes solution intradermally in the left auricle and 1 mL of the same solution intraperitoneally to establish the auricular acne model rats. When the acne model was graded ≥1, the model was considered successful. After that, the rats of model-making group were divided into model group, control group and drug administration group by random number table method, with 8 rats in each group. In the control group, 0.2 mL of 0.1% retinoic acid cream was applied externally to the front and back of the left auricle of the rats, while 0.5 mL of teicoplanin lemon compound was applied to the rats in the drug administration group, and saline was applied to rats of the normal and model groups, once a day for 14 days. Two hours after the last administration, blood was drawn from the abdominal aorta and 1/4 of the left auricle tissue was cut off. HE staining was used to observe the pathological morphological changes of the left auricle acne tissue. Vernier caliper was used to measure the swelling of the left ear before and after intervention. ELISA and Western blot were used to determine the serum content and relative protein expressions of interleukin-1α (IL-1α), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in serum and left auricle acne tissue, respectively. Results Compared with the normal group, the model group showed obvious inflammatory cell infiltration in the left auricle tissue, and the left ear was swelling, the serum IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α content and protein relative expression in the left auricle tissue significantly increased (P<0.05); compared with the model group, the control and drug administation groups showed different degrees of improvement in the inflammatory cell infiltration in the left auricle tissue, and the left ear swelling, the serum IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α content and protein relative expression in the left auricle tissue reduced (P<0.05). There was no significant difference in the above indexes between the control group and the drug administation group (P>0.05). Conclusion Tea-lemon mixture can reduce the content and protein relative expression of inflammatory factors, like IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α in serum and left auricle acne tissue, reduce ear swelling, alleviating acne inflammatory response and playing a role in treating acne.

Graphical abstract

关键词

痤疮 / 茶素柠檬合剂 / 炎症因子 / 耳部肿胀度

Key words

acne / tea-lemon mixture / inflammatory factors / ear swelling

痤疮是皮肤科常见的毛囊皮脂腺慢性炎症性疾病，好发于青少年，患者皮肤表面多出现结节、炎性丘疹、白头粉刺甚至脓疱等^［1-2］。由于痤疮病程迁延，极易反复发作，治疗不当可产生瘢痕增生、色素沉着等症状，不仅影响受损部位皮肤的正常代谢，还给患者造成了极大的心理压力。因此，积极有效的治疗对痤疮患者的身心健康意义重大。

中药外治法是治疗痤疮的重要方法，因此遴选一种安全有效的中药外用制剂治疗痤疮尤为重要。茶素柠檬合剂是笔者多年治疗痤疮的临床经验方，由茶枯、柠檬、橄榄叶、姜黄、苦参、乳香、皂角刺、枇杷叶等中药配伍成方，并采用微生物酿造发酵技术研发出的喷剂制剂，临床外用治疗痤疮，疗效较好。但其作用机制目前尚未阐明，故本研究通过观察茶素柠檬合剂对痤疮丙酸杆菌所致大鼠耳廓痤疮模型的治疗作用，并初步探讨其可能的作用机制，为其临床进一步推广应用提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠32只，体质量（180±20）g，购自上海斯莱克有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004。由福建中医药大学SPF级实验动物中心饲养，动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007，每笼随机饲养5只，室内保持恒湿恒温（温度控制在21～25 ℃，湿度控制在40%～60%），提供24 h自由饮水饮食。本实验已通过福建中医药大学动物实验伦理委员会审批（审批号：FJTCMIACUC2023149），并严格遵守国家实验动物卫生指导使用原则。

1.2 实验药物与试剂

茶素柠檬合剂（福建益和康生物科技有限公司，批号：230518）；0.1%维A酸乳膏（山东良福制药有限公司，批号：H37023768）；痤疮丙酸杆菌液（北京北纳生物科技有限公司，批号：BNCC362517）；大鼠白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA试剂盒（批号：ZC-36391-96T）、大鼠白细胞介素-1α（IL-1α）ELISA试剂盒（批号：ZC-36337-96T）、大鼠白细胞介素-6（IL-6）ELISA试剂盒（批号：ZC-36404-96T）、大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（批号：ZC-37624-96T）均购自上海茁彩生物科技有限公司；SDS-PAGE配胶试剂盒（批号：P0012A）、RIPA裂解液（批号：P0013）均购自上海碧云天生物技术有限公司；特超敏化学发光液（大连美仑生物技术有限公司，批号：ma0186）；IL-1β一抗（批号：ab283818）、IL-6一抗（批号：ab259341）、TNF-α一抗（批号：ab205587）均购自美国Abcam公司；IL-1α一抗（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：16765-1-AP）；HRP标记山羊抗鼠二抗（批号：7076P2）、HRP标记山羊抗兔二抗（批号：7074s）均购自美国Cell Signal Technology公司；PVDF膜（美国Millipore公司，批号：ISEQ00010）。

1.3 实验仪器

电子天平（德国Sartorius公司，型号：BSA223S-CW）；多功能酶标仪（瑞士TECAN公司，型号：Infinite 200PRO）；荧光倒置显微镜（德国Leica公司，型号：DMi8）；石蜡切片机（美国Thermo Fisher公司，型号：HM 325）；化学发光成像系统（美国Bio Rad公司，型号：ChemiDoc XRS+）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号：Centrifuge5418）。

2 实验方法

2.1 耳廓痤疮大鼠模型的制备

采用随机数字表法将32只雄性SD大鼠分为正常组8只和造模组24只。造模组参照文献［3］制备耳廓痤疮大鼠模型：每只大鼠按照体质量1 mL/kg腹腔注射3%戊巴比妥钠进行麻醉，麻醉后在左耳廓皮内注射6×10⁷ cfu/mL痤疮丙酸杆菌液50 μL，1次/d，连续注射3 d；第3天开始每只大鼠再腹腔注射6×10⁷ cfu/mL痤疮丙酸杆菌液1 mL，1次/d，连续7 d。正常组同一时间左耳廓皮内注射无菌生理盐水50 μL和腹腔注射无菌生理盐水1 mL。造模后当痤疮模型判定分级≥1级，则判定为造模成功^［4］。造模组24只大鼠均造模成功。

2.2 实验分组及给药

造模成功大鼠采用随机数字表法分为模型组、对照组和给药组，每组8只。对照组在大鼠左耳廓正反两面外涂0.1%维A酸乳膏0.2 mL，给药组对外涂茶素柠檬合剂0.5 mL，正常组和模型组外涂生理盐水，1次/d，连续14 d。

2.3 样本采集

于末次给药2 h后，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉采血5 mL，室温条件静置1 h，3 000 r/min离心15 min，分离血清。取1/4耳廓组织置于4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水、石蜡包埋后用于HE染色；剩余耳廓组织置入液氮后转移至-80 ℃冰箱保存备用。

2.4 观察指标

2.4.1 左耳廓痤疮组织病理形态学观察

将左耳廓组织石蜡包埋块制成4 μm切片，常规二甲苯脱蜡，经梯度乙醇脱蜡复水，行HE染色，采用荧光倒置显微镜于200倍镜下观察耳廓痤疮组织病理形态学变化并采集图像。

2.4.2 耳肿胀度检测

干预前后使用游标卡尺测量左耳廓最大厚度，计算耳廓肿胀度，计算公式：

耳廓肿胀度＝（干预后厚度－干预前厚度）/干预前厚度

2.4.3 血清IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α含量检测

取得的血清严格按照ELISA试剂盒说明书，采用多功能酶标仪测定大鼠血清IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

2.4.4 左耳廓组织IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平检测

每组随机选取5只大鼠，取左耳廓组织约100 mg，液氮研磨至粉末状，以1∶10加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的高效组织裂解液，提取总蛋白。采用Western blot检测上述指标蛋白水平。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，加入SDS上样缓冲液制成蛋白样品。取变性后蛋白样品行SDS-PAGE凝胶电泳，后电转至PVDF膜上。剪取相应条带，5%脱脂牛奶封闭70 min，TBST洗涤。加入一抗（β-actin稀释比为1∶5 000，IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α稀释比均为1∶1 000）4 ℃过夜孵育，TBST充分洗涤后，二抗（HRP标记山羊抗鼠二抗、HRP标记山羊抗兔二抗稀释比均为1∶3 000）室温孵育70 min，TBST充分洗涤，特超敏ECL显色，并于ChemiDoc XRS+化学发光成像系统上成像并采集图像，用Image Lab 6.0软件分析条带灰度值，以β-actin作为内参，计算目的蛋白的相对表达水平。

目的蛋白表达水平＝目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值

并参照正常组对所得目的蛋白表达水平的值进行归一化处理。

2.5 统计学方法

实验数据采用SPSS 29.0软件进行分析。计量资料属正态分布以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较，方差齐者采用LSD-t检测，方差不齐者采用Games-Howell检测。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 4组左耳廓组织病理形态学比较

HE结果显示：正常组大鼠左耳廓组织真皮层与表皮、皮下组织界限清晰，未见炎症细胞浸润；模型组大鼠左耳廓组织真皮与表皮、皮下组织界限变模糊，表皮增厚伴角化过度，真皮层出现大量炎症细胞浸润，毛细血管明显扩张；对照组和给药组干预后耳廓组织结构得以明显改善，表皮角化及厚度有不同程度减轻，炎症细胞明显减少。见图1。

3.2 4组大鼠耳廓肿胀度比较

与正常组比较，模型组耳廓肿胀度均显著增厚（P＜0.05）；与模型组比较，对照组和给药组大鼠耳廓肿胀度均明显降低（P＜0.05）；与对照组比较，给药组耳廓肿胀度差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

3.3 4组大鼠血清IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较

与正常组比较，模型组血清IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α含量均显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，对照组和给药组血清上述指标均明显降低（P＜0.05）；与对照组比较，给药组血清上述指标差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3.4 4组大鼠左耳廓组织中IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平比较

与正常组比较，模型组大鼠耳廓组织中IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平均明显增多（P＜0.05）；与模型组比较，对照组和给药组大鼠耳廓组织中上述指标均明显下降（P＜0.05）；与对照组比较，给药组耳廓组织中上述指标差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3和图2。

4 讨　论

中医学认为，痤疮主要由风、湿、热、痰、瘀等外邪所致^［5］。茶素柠檬合剂具有清热燥湿、消肿排脓、活血化瘀之功效，临床外用治疗痤疮疗效较好。合剂中的茶枯是压榨野山茶油后留下的天然粉渣，含有丰富的茶皂素，茶皂素是一种天然非离子型表面活性剂，具有抗炎抑菌活性和乳化、分散、发泡、湿润等功能^［6-7］。此外，合剂中的柠檬、橄榄叶、姜黄、苦参、乳香、皂角刺、枇杷叶等药物均有一定抗炎抑菌活性^［8-12］。本实验结果显示：茶素柠檬合剂治疗耳廓痤疮模型大鼠14 d后，可明显改善模型大鼠左耳廓皮肤表皮角化及厚度，减少炎症细胞浸润，减轻模型大鼠耳廓肿胀度（P＜0.05），提示茶素柠檬合剂对痤疮具有较好的治疗作用。

炎症反应贯穿于痤疮发病过程的始终。痤疮丙酸杆菌是最主要的致病菌，可刺激人外周血单核细胞和巨噬细胞产生IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎细胞因子，与表皮、毛囊和皮脂腺内相应受体结合，调节炎症的级联反应，促使角质形成细胞的过度增殖和异常分化，并能趋化激活中性粒细胞，增强溶酶体酶活性，提高吞噬能力，增强局部炎症^［13-17］。因此，抑制炎症反应可能是治疗痤疮、减轻炎性损伤的重要方法。本实验结果显示：茶素柠檬合剂治疗后可显著降低耳痤疮模型大鼠血清中IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α含量（P＜0.05）以及左耳廓组织中上述指标的蛋白表达水平（P＜0.05），以缓解痤疮丙酸杆菌诱导的炎症反应状态。

综上，茶素柠檬合剂可通过降低炎症介质的表达水平，达到减轻痤疮炎症级联反应的目的，目前本研究尚处于初步阶段，鉴于炎症反应是痤疮发病的重要机制，今后将对其炎症受体及相关信号通路进行深入研究。

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基金资助

福建省科技厅引导性项目(2021Y0034)