基于网络药理学探讨紫龙金片诱导结直肠癌细胞铁死亡的作用机理

摘要

目的 探讨紫龙金片诱导结直肠癌细胞铁死亡的作用机理。 方法 在TCMSP、SwissTargetPrediction数据库收集紫龙金片的活性成分及作用靶点，在GeneCards、OMIM数据库中收集 CRC 疾病靶点，通过在线工具Venny 2.1.0获取二者交集靶点。使用Cytoscape 3.9.1软件绘制“中药-活性成分-交集靶点”网络图，以内置插件CytoNCA筛选核心成分，使用STRING数据库绘制交集靶点的蛋白-蛋白互作网络（PPI）筛选出关键靶点，然后使用R软件对关键靶点进行GO功能、KEGG通路富集分析。通过铁死亡数据库FerrDb V2搜索铁死亡相关靶点，与筛选出的药物疾病的交集靶点取交集获得核心靶点，对核心靶点进行PPI作图，初步确定紫龙金片通过调控铁死亡治疗结直肠癌的作用靶点。采用Discovery Studio、PyMol和GROMACS 2020.6软件进行分子对接、分子动力学虚拟验证核心成分和核心靶点的结合能力。 结果 紫龙金片的核心成分有隐丹参酮、野蔷薇苷，GO功能富集分析显示紫龙金片主要通过影响细胞增殖和转录等来发挥功能，KEGG通路富集分析到PI3K/Akt、JAK/STAT等信号通路，核心靶点PPI分析确定STAT3为紫龙金片通过调控铁死亡治疗结直肠癌的作用靶点，分子对接、分子动力学结果提示核心成分隐丹参酮、野蔷薇苷与STAT3有较好的结合活性。 结论 紫龙金片可能通过调控STAT3诱导结直肠癌细胞铁死亡以治疗CRC。

Graphical abstract

关键词

紫龙金片 / 结直肠癌 / 网络药理学 / 分子对接 / 作用机制

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界上发病率较高的肿瘤之一^［1］，目前外科治疗仍是主要治疗手段，辅助放、化疗能减少复发和转移，但常伴随毒副反应。中医药因人施治，能够有效降低西药不良反应，增加治疗效果，在临床施治中有着独特优势^［2］。紫龙金片作为现代抗肿瘤名方，由北京大学临床肿瘤学院王代树教授主持研发，起初以膀胱癌等泌尿系统肿瘤为其立项目的，如今多用于非小细胞肺癌的临床治疗^［3］。作为国内外较早完成细胞分子学基础研究和临床研究的天然抗癌药物，有研究表明紫龙金片可以抑制结直肠癌肿瘤生长^［4］，但作用机制尚不完全清晰，且后期基础研究数量较少，研究深度不足，临床研究评价方式不尽相同^［3］。

由于结直肠癌生长过程中癌细胞会积累大量的铁，而铁死亡是一种以二价铁离子大量蓄积为特征的细胞程序性死亡方式，诱导肿瘤细胞铁死亡能够有效抑制肿瘤的生长，目前且已有多种铁死亡诱导剂应用于临床，一些中药活性成分也能通过脂质代谢、铁代谢、胱氨酸/谷氨酸转运体系统或谷胱甘肽过氧化酶4/谷胱甘肽等途径诱导肿瘤细胞铁死亡，调控肿瘤疾病的发展进程，通过激活铁死亡可以有效治疗CRC^［5］。中药复方具有多通路、多靶点和高疗效优势^［6］，考虑到结直肠癌和铁离子以及铁死亡的相关性，本课题组探究紫龙金片是否、以及以何种途径调控铁死亡来治疗结直肠癌。本文利用公共数据库和数据处理软件，使用网络药理学、分子对接等一系列工具分析紫龙金片的主要活性成分和治疗结直肠癌作用靶点，筛选效应通路，探究铁死亡在其中发挥作用的具体机制。

1 资料和方法

1.1 筛选紫龙金片活性成分及作用靶点

分别以“黄芪”“当归”“白英”“龙葵”“丹参”“半枝莲”“蛇莓”“郁金”为检索词，在TCMSP数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）^［7］中搜索其活性成分，设置口服生物利用度≥30%及类药性≥0.18，获得各个活性成分对应的作用靶点。使用UniProt数据库（https：//www.uniprot.org）检索“Human”得到所有已知人源基因并作为对照，对从TCMSP数据库获取的作用靶点进行基因名称规范化处理；部分药物的活性成分在TCMSP中未被检索到，则通过“中国知网”检索相关文献补充，再使用SwissTargetPredicition平台^［8］预测其作用靶点，物种名设为“Homo sapiens”，下载作用靶点Excel数据表，选择可能性＞0的作用靶点。最后将得到的所有活性成分以及作用靶点分别合并、去重后，得到紫龙金片活性成分与作用靶点。

1.2 获取CRC的疾病靶点

在GeneCards^［9］（https：//www.genecards.org/）、OMIM^［10］（https：//www.omim.org/）2个数据库中分别检索关键词“colorectal cancer”，将所得结果按照分数从高到低排序，以中位数原则进行筛选，将二者所得结果取并集并去重，得到CRC的疾病靶点。

1.3 筛选紫龙金片与CRC交集靶点

分别将获取的紫龙金片作用靶点和CRC疾病靶点依次导入在线工具Venny 2.1.0（http：//www.bioinformatics.com.cn/）中，以绘制韦恩图的方式体现紫龙金片作用靶点与CRC靶点的交集，导出紫龙金片治疗CRC的交集靶点。

1.4 构建“中药-活性成分-交集靶点”网络并筛选核心成分

将中药、活性成分以及作用靶点逐一对应，整理为Excel文件，导入Cytoscape 3.9.1软件^［11］中建立“中药-活性成分-交集靶点”网络。通过内置插件CytoNCA对活性成分进行筛选并根据度值排序，选择前10名活性成分作为紫龙金片治疗结直肠癌的核心成分。

1.5 构建蛋白-蛋白互作（PPI）网络图并筛选关键靶点

将交集靶点导入STRING数据库^［12］（https：//cn.string-db.org/），使用默认参数值，下载TSV格式文件，导入到Cytoscape 3.9.1软件进行优化作图。借助CytoNCA插件对结果进行拓扑学分析，筛选同时大于中介中心性、接近中心性及度值3个参数中位数的交集靶点，根据度值再次排序，选择前15名交集靶点作为关键靶点。

1.6 GO功能和KEGG通路富集分析

利用R软件运行“clusterProfiler”“enrichplot”“ggplot2”R语言包，对15个关键靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，导出全部条目的Excel表格，按P值进行排序后分别选择GO富集结果的前5名以及KEGG富集通路的前20名条目进行可视化绘图，设置横轴为基因数量，纵轴为P值。

1.7 铁死亡相关基因筛选

从FerrDb V2数据库获取铁死亡相关基因，并与紫龙金片治疗CRC的交集靶点取交集得到核心靶点，即为紫龙金片调控铁死亡治疗结直肠癌的作用靶点。

1.8 分子对接

选取紫龙金片核心成分和核心靶点进行分子对接，分别通过UniProt数据库和PubChem数据库获取核心成分和核心靶点三维结构，保存核心成分的sdf格式文件以及核心靶点的PDB文件。打开Discovery Studio 2019软件，先导入核心成分sdf文件，打开“Small Molecules”，点击“Prepare Ligands”按钮进行分子准备，然后使用“Full Minimization”进行优化，进行CHARMm力场、设Smart Minimizer算法，等待优化结束；导入核心靶点PDB文件，点击“Macromolecules”的“Automatic Preparation”按钮，选择“Prepare Protein”，计算CHARMm力场；随后定义活性中心，使用Dock Ligands （CDOCKER）半柔性模式进行分子对接。运行结束后保存结合能信息，按照绝对值大小排序，选择绝对值最大的对接结果信息制作表格，最后利用PyMOL软件再次绘图，使氨基酸位点、分子间作用力可视化。

1.9 分子动力学

利用GROMACS2020.6软件包、charmm36力场和TIP3P水模型进行模拟。加入相应钠离子取代水分子使总电荷呈中性，并把周期边界条件（PBC）应用于系统的3个方向。从Sobtop得到隐丹参酮、野蔷薇苷的力场参数。通过位置约束的MD模拟，以及通过NVT和NPT（粒子的数目、压力和温度恒定），使受体、配体和溶剂平衡，最后分析体系的均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）和原子位置的均方根波动（root-mean-square fluctuation，RMSF）。根据体系最终的平衡时间与RMSD大小，判断隐丹参酮、野蔷薇苷结合的稳定性，平衡时间越早、RMSD与RMSF越小则代表结合越稳定。

2 结　果

2.1 紫龙金片活性成分及作用靶点

使用TCMSP数据库和中国知网检索紫龙金片所含中药，整理后获得144个活性成分（其中有8个共有活性成分）；通过SwissTargetPredicition数据库进行预测、Uniprot数据库进行标准化处理后，共计得到698个作用靶点。

2.2 CRC疾病靶点

分别通过GeneCards、OMIM数据库检索、筛选后，共计得到1 225个CRC疾病靶点。

2.3 紫龙金片与CRC交集靶点

使用在线工具Venny 2.1.0绘制紫龙金片作用靶点与CRC疾病靶点的韦恩图，共获得149个交集靶点。

2.4 “中药-活性成分-交集靶点”网络构建与分析

将整理好的Excel文件导入Cytoscape 3.9.1软件中，绘制出含有272节点，972条边的“中药-活性成分-交集靶点”网络图，见图1。核心成分筛选结果见表1。

2.5 交集靶点蛋白互作（PPI）网络构建与分析

对紫龙金片治疗CRC交集靶点进行PPI分析后，取度值排序前15的关键靶点再次绘图。前15名关键靶点具体排名为肿瘤蛋白p53（TP53）、MYC原癌基因（MYC）、丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）、表皮生长因子受体（EGFR）、白蛋白（ALB）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、雌激素受体1（ESR1）、连环蛋白1（CTNNB1）、细胞周期素D1（CCND1）、HRas原癌基因（HRAS）、半胱天冬蛋白酶-3（CASP3）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、磷酸酯酶与张力蛋白同源物（PTEN）、JUN原癌基因（JUN）、酪氨酸激酶受体2（ERBB2），见图2和表2。

2.6 GO功能和KEGG通路富集分析

根据P值大小对GO分析得到的条目进行排序，分别选择前5名条目进行可视化处理，见图3。生物过程主要富集在miRNA代谢过程调控、上皮细胞增殖等；细胞组分主要富集在转录因子抑制复合物、常染色质、RNA聚合酶Ⅱ转录调节复合物等；分子功能主要富集在蛋白磷酸酶调节活性、DNA转录因子结合等。

同样根据P值对KEGG分析得到的通路进行排序，选择前20条通路绘制气泡图，提示主要富集在MAPK信号通路、甲状腺激素信号通路、PI3K-Akt信号通路、ErbB信号通路、FoxO信号通路、催乳素信号通路、JAK-STAT信号通路等，见图4。

2.7 紫龙金片治疗结直肠癌与铁死亡相关基因的交集

铁死亡是近年来研究热点，我们通过交集得到36个核心靶点，见图5。接下来对这36个核心靶点进行了PPI网络分析，根据度值大小进行排序后发现STAT3位列第一，见图6。结合KEGG和GO分析结果，推测STAT3可能为紫龙金片诱导铁死亡治疗结直肠癌的核心靶点，其对应成分为隐丹参酮、野蔷薇苷，且通过查阅文献发现隐丹参酮是STAT3的强效抑制剂^［13］。

2.8 分子对接结果

通过中国知网、Pubmed分别检索核心成分与JAK/STAT3通路的关系，有3个核心成分未检索到相关文献。蛇莓苷A、野蔷薇苷、芒柄花苷和对羟基苯甲酸为通过文献检索^［14］补充收集，其作用靶点经由SwissTargetPrediction平台根据已知蛋白结构计算获得。多数核心成分都已经研究证实与JAK/STAT3信号通路或其上下游密切相关。见表3和表4。

有研究表明，STAT3可通过调控PI3K/Akt信号通路抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移^［26］，已有文献证实野蔷薇苷在血管内皮细胞中可以影响PI3K/Akt通路，但在肿瘤细胞中仍有待验证。我们将STAT3分别与隐丹参酮、野蔷薇苷进行分子对接，一般来说，当结合能小于0，则蛋白质与配体可以自发地结合，结合能越低则发生结合的可能性越大^［27］。结果显示，隐丹参酮、野蔷薇苷与STAT3结合能分别为-26.834 kcal/mol和-32.442 kcal/mol（见表4），可知STAT3可与隐丹参酮、野蔷薇苷自发地结合，见图7。

2.9 分子动力学

使用分子动力学分别模拟隐丹参酮、野蔷薇苷与STAT3结合，整个模拟时长为100 000 ps，在15 000 ps左右，复合物已到达平衡，且RMSD数值在0.2～0.4 nm，代表复合物稳定较快且波动不多。整体的RMSF数值处于0.05～0.45 nm，相对较小。100 000 ps内回转半径值（radius of gyration，Rg）较低，氢键数量最大3个。表明隐丹参酮、野蔷薇苷能够与STAT3稳定结合。见图8。

3 讨　论

本研究首先通过网络药理学公共数据库筛选出紫龙金片的活性成分及作用靶点，将药物作用靶点与结直肠癌疾病靶点取交集，初步得到紫龙金片治疗结直肠癌的作用靶点，构建“中药-活性成分-交集靶点”复杂网络；然后使用PPI网络互作分析筛选出关键靶点，再进行GO分析和KEGG通路富集分析，提示主要富集在JAK/STAT等信号通路上；将交集靶点与铁死亡相关基因取交集后进行PPI分析，结果显示STAT3排序第一。因此，本研究推断紫龙金片可能通过调控STAT3介导铁死亡发挥治疗结直肠癌的作用。

JAK/STAT信号通路的组成包括配体-受体复合物、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT，与肿瘤密切相关，可通过影响下游效应分子的活化来调节细胞凋亡和增殖。其被视为细胞功能中的中心通讯节点之一，JAKs与细胞因子受体非共价结合，介导受体的酪氨酸磷酸化，并招募一个或多个STAT蛋白。酪氨酸磷酸化的STATs发生二聚化，然后通过核膜转运到细胞核内调节特定基因^［28］。异常激活的STAT3在肿瘤的生长和复发中起着重要的作用，在消化道中的基础表达水平也很高^［29］，与癌症患者的不良预后相关。STAT3主要作为转录因子参与肿瘤恶性转化，调节下游肿瘤相关基因表达，因此，本课题组猜想STAT3在结直肠癌中发挥重要作用，并有研究表明，JAK/STAT信号通路与结直肠癌关系密切。研究发现维生素D3可能通过调控JAK2/STAT3信号通路减轻炎症反应并影响上皮间质转化以抑制CRC^［30］，丹参酮联合大黄素通过JAK/STAT3信号通路抑制结直肠癌^［31］，重楼皂苷通过IL-6的分泌而抑制IL-6/STAT3信号通路的表达诱导结直肠癌细胞死亡^［32］。综上所述，提示JAK/STAT信号通路与CRC密切相关，抑制JAK/STAT途径有望治疗CRC。

在CRC肿瘤常规治疗中，传统化疗药物治疗有较强的副作用，且更容易产生耐药，而常规治疗耐药的癌细胞对铁死亡更敏感^［33-34］，因此铁死亡可能是缓解化疗耐药性的有效治疗策略。多种抑癌因子如p53、BAP1等可通过与铁死亡关键调节蛋白溶质载体家族7成员11（SLC7A11）结合，抑制其活性，下调半胱氨酸代谢通路，导致胞内胱氨酸水平降低，GSH生物合成耗竭，抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的表达，进而导致脂质过氧化物堆积，最终诱导肿瘤细胞铁死亡^［35］。STAT3与氧化反应及应激相关的铁死亡介导有关^［36-37］，可能是铁死亡的潜在调节因子。STAT3可通过直接下调铁死亡关键调节蛋白GPX4和SLC7A11表达，促进细胞内活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平的升高，导致肿瘤细胞铁死亡；此外，STAT3还可以调控铁代谢相关蛋白FTH1造成Fe²⁺增多来诱导铁死亡，即调控STAT3可以通过与脂质过氧化和铁代谢相关的多管齐下的机制触发铁死亡^［38］；除此之外，STAT3介导组织蛋白酶B（CTSB）的表达和释放，这是诱导自噬依赖性铁死亡所必需的^［39］，可见STAT3介导的铁死亡相关信号通路失调可能是CRC发生及进展的原因之一。已有许多研究发现诸多药物可通过靶向STAT3调控铁死亡，如葫芦素B通过靶向STAT3促进铁死亡抑制非小细胞肺癌的生长^［40］，百里酚调控STAT3-铁死亡负调节轴抑制SW480细胞的增殖^［41］，二甲酸单丁酯通过调控TNF/IL-6/STAT3信号通路诱导TM-3间质细胞铁死亡^［42］，染料木素磺酸钠（GSS）通过GPR30调控STAT3-Hepcidin信号减轻铁死亡^［43］，糖皮质激素诱导转录物1（GLCCI1）调控STAT3/SLC7A11信号通路抑制糖尿病小鼠视网膜神经节细胞铁死亡^［44］，可见STAT3和铁死亡密切相关。本研究通过分子对接发现，紫龙金片的有效成分隐丹参酮、野蔷薇苷与关键靶点STAT3结合良好，且分子动力学模拟已验证其稳定性。除此之外，隐丹参酮已被验证是STAT3的强效抑制剂。结合以上，本课题组考虑紫龙金片可能也通过JAK/STAT信号通路调控下游铁死亡相关信号通路来发挥治疗CRC的作用，但由于STAT3蛋白结构的多样性、并可促进、抑制癌症，其所发挥作用的具体方式、所作用的具体通路仍有待进一步深入研究。

本研究通过网络药理学筛选紫龙金片治疗结直肠癌的关键成分以及对应靶点，利用分子对接、分子动力学模拟化合物和靶蛋白的结合，预测紫龙金片影响铁死亡以治疗结直肠癌的机制作用，为紫龙金片的研究与临床应用进一步提供实验及科学依据。

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