共载多柔比星与吲哚菁绿还原响应型混合胶束的制备研究

摘要

目的 优化透明质酸修饰的共载多柔比星（DOX）与吲哚菁绿（ICG）的还原响应型混合胶束（H/DP-D/I）的制备工艺。 方法 以粒径、多分散系数（PDI）、包封率和载药量为评价指标，考察薄膜水合法、透析法、直接溶解法3种载药方法对H/DP-D/I胶束载药效果的影响，采用单因素实验法分析DOX和ICG的2种不同加药方式、载体材料还原敏感型透明质酸-熊果酸聚合物（HSU）与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG）3种不同的质量比和DOX最佳投药量，以确定最佳制备工艺；再以冻干制剂外观、冻干前后粒径、复溶性及复溶后DOX和ICG含量变化为指标，从葡萄糖、乳糖、甘露醇中筛选最佳冻干保护剂及其浓度。 结果 比较3种载药方法所制H/DP-D/I胶束的粒径、PDI、包封率和载药量，确定透析法为最佳载药方法；透析法最佳制备工艺为：DOX和ICG采用先混合后滴加的加药方式，载体材料HSU和DSPE-PEG最佳质量比为1∶1，DOX最佳投药量为2.5 mg；当1.0%乳糖作为冻干保护剂时，冻干制剂外观平整、质地细腻、复溶性好，冻干前后粒径、复溶后DOX和ICG含量变化最小，故选择1.0%乳糖作为最佳冻干保护剂。 结论 采用本研究优化的H/DP-D/I胶束制备工艺制备出粒径均一、高包封率和高载药量的H/DP-D/I胶束，并初步筛选出1.0%乳糖作为最佳冻干保护剂。

Graphical abstract

关键词

还原响应型混合胶束 / 多柔比星 / 吲哚菁绿 / 透明质酸 / 制备工艺

聚合物胶束是指两亲性物质在水性介质中自发形成的纳米粒子，其疏水基团交联成胶束内核，可通过疏水作用与难溶性药物如紫杉醇、多柔比星等结合^［1-2］，提高药物分子在体内的水溶性和稳定性^［3］。聚合物胶束的亲水基团作为外壳，此结构能延长药物在血液中的循环时间，从而利于药物靶向于肿瘤组织^［4-5］。此外，为了解决单一化疗药物在抗肿瘤方面存在耐药、毒副作用等不足，将光热剂与抗癌药物同时共载，发现联合抗癌疗效显著^［6-7］。本研究以还原敏感型透明质酸-熊果酸聚合物（HSU）与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG）为载体，化疗药物多柔比星（DOX）和光热剂吲哚菁绿（ICG）作为治疗剂，构建透明质酸修饰的共载DOX与ICG的还原响应型混合胶束（HSU/DSPE-PEG-DOX/ICG，H/DP-D/I），此胶束在肿瘤微环境中特异性响应，化疗与光疗联合抗癌，有望提高药物对肿瘤的抑制效果，并降低其毒副作用。本研究中以粒径、多分散系数（PDI）、包封率和载药量为评价指标，选择适宜的载药方法，并采用单因素方法优化载药处方，以期得到粒径较小、分布均匀、高包封率和高载药量的H/DP-D/I胶束。

1 仪器与材料

1.1 仪器

磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司，型号：85-1A）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：JY92-2D）；冷冻干燥机（德国Christ公司，型号：ALPHA1-2LD plus）；低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司，型号：SC-04）；紫外-可见分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司，型号：UV-9600）；激光粒度仪（美国PSS公司，型号：NICOMPTM 380ZLS）；十万分之一电子天平（美国METTER-TOLEDO仪器有限公司，型号：MS105DU）。

1.2 材料

HSU（自制）；DSPE-PEG（上海芃圣生物科技有限公司，批号：G06079）；ICG（北京百灵威科技有限公司，批号：L930V13，纯度90%）；DOX（北京华奉联博化学材料有限公司，批号：HF190916）；DOX对照品（北京华奉联博化学材料有限公司，批号：HF180202，纯度＞99%）；三乙胺（上海麦克林生化科技股份有限公司，批号：C12432887）；二甲基亚砜（DMSO，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：G1830058）；甲醇（批号：20210114）、葡萄糖（批号：C1816106）、乳糖（批号：J1713044）、甘露醇（批号：F264A）均购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方　法

2.1 紫外-可见分光光度法测定DOX与ICG含量

2.1.1 紫外光谱扫描

精密称取适量DOX对照品于DMSO中，加入三乙胺（DOX与三乙胺摩尔质量比为1∶3），搅拌过夜即得DOX对照品溶液。精密称取适量ICG对照品和HSU/DSPE-PEG，分别溶于超纯水中，得到ICG对照品溶液和HSU/DSPE-PEG溶液。将上述制得的3种溶液分别用甲醇稀释3倍，在200～800 nm波长范围内进行紫外扫描，确定DOX和ICG的紫外检测波长。

2.1.2 线性关系考察

移取DOX对照品溶液适量，甲醇作为溶剂，稀释配置成质量浓度为200 μg/mL的DOX储备液。精密移取该储备液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 mL分别置于10 mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得系列质量浓度为5、10、15、20、25、30、40 μg/mL的DOX对照品溶液，用紫外分光光度计在497 nm处测定其吸光度值。以DOX浓度C（μg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。同法绘制系列质量浓度为0.8、1、1.5、2、2.5、3 μg/mL的ICG对照品溶液的标准曲线。

2.1.3 精密度实验

精密量取DOX储备液0.5、1.0、1.5 mL和ICG储备液160、300、500 μL于10 mL量瓶中，甲醇溶液定容，得到低、中、高3种浓度的DOX溶液和ICG溶液，于当天连续测定5次吸光度值，连续测定5 d，计算得到低、中、高3个浓度DOX溶液和ICG溶液的日内精密和日间精密度RSD。以RSD＜2%表明仪器精密度良好，结果符合实验要求。

2.1.4 回收率实验

取“2.1.3”项下制备的低、中、高3种浓度的DOX、ICG溶液，DOX溶液加入1 mL处方比例的HSU/DSPE-PEG/ICG混合溶液，ICG溶液则加入100 μL处方比例的HSU/DSPE-PEG/DOX混合溶液，均用甲醇稀释定容，每个样品平行制备3份，分别于497、784 nm处测定吸光度，并计算DOX、ICG回收率。当RSD＜2%，且在200～800 nm检测波长范围内，DOX、ICG回收率达到95%～105%表明结果符合实验要求。

回收率＝（加样样品含量－样品含量）/加样量×100%

2.1.5 重复性实验

平行制备H/DP-D/I胶束供试品溶液6份，稀释3倍后分别于497、784 nm处测定吸光度，算得DOX和ICG含量，并计算RSD，以RSD＜2%表明实验重复性良好。

2.1.6 稳定性实验

取低、中、高3种浓度的DOX溶液和低、中、高3种浓度的ICG溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h在497、784 nm处测定吸光度，并计算药物含量和RSD，以RSD＜2%表明实验稳定性良好。

2.2 载药方法初步考察

采用HSU与DSPE-PEG为载体材料，以粒径、PDI、包封率和载药量为主要考察指标，当纳米药物的粒径在100～200 nm时，具有较好的血液循环稳定性和较长的体内滞留时间，PDI＜0.2则表明胶束粒径分布均匀^［8］，以此为标准初步确定载H/DP-D/I胶束的最佳载药方法为透析法，并进行工艺优化。

2.2.1 薄膜水合法

取载体材料HSU和DSPE-PEG各9 mg，混合后加入3 mL超纯水溶解，磁力搅拌下缓慢加入10 mg/mL DOX溶液和ICG溶液各250 μL，继续剧烈搅拌30 min；将上述溶液转移至圆底烧瓶中，旋转蒸发溶剂得到均匀薄膜，加入4 mL超纯水溶解，转移至EP管，加超纯水至10 mL；用离心机以3 000 r/min离心15 min，取上清液过0.8 μm滤膜，即得H/DP-D/I胶束。

2.2.2 直接溶解法

取载体材料HSU和DSPE-PEG各9 mg，混合后加入3 mL超纯水溶解，磁力搅拌下缓慢加入DOX和ICG粉末2.5 mg，剧烈搅拌30 min，探头超声30 min，转移至EP管，加超纯水至10 mL，用离心机以3 000 r/min离心15 min，取上清液过0.8 μm滤膜，即得H/DP-D/I胶束。

2.2.3 透析法

取载体材料HSU和DSPE-PEG各9 mg加3 mL超纯水溶解后，磁力搅拌下缓慢加入10 mg/mLDOX溶液和ICG溶液各250 μL，剧烈搅拌、探头超声各30 min，转移至透析袋，2 L超纯水透析过夜，用离心机以3 000 r/min离心15 min、过0.8 μm滤膜即得H/DP-D/I胶束。

2.3 透析法工艺优化

2.3.1 加药方式

固定HSU和DSPE-PEG投料质量比例为1∶2，DOX与ICG投药量均为2.5 mg。考察ICG与DOX分开加药和混合加药（按质量比1∶1混合）加入载体材料水溶液的不同对H/DP-D/I胶束的影响。

2.3.2 载体比例

固定载体材料总投料量18 mg，ICG和DOX投药量均为2.5 mg。考察HSU和DSPE-PEG质量比分别以0∶1、1∶0、2∶1、1∶1及1∶2时胶束载药情况。

2.3.3 投药量

固定载体总投料量18 mg，ICG和DOX质量比为1∶1。考察DOX的投药量分别2.0、2.5、3.0、3.5 mg时胶束载药情况。

2.4 包封率与载药量的测定

采用UV-Vis测定H/DP-D/I胶束的载药量及包封率。取新鲜制备的H/DP-D/I胶束溶液，用甲醇破坏胶束结构并稀释3倍后，按“2.1”项下方法测定DOX和ICG含量，并根据下列公式计算DOX和ICG的包封率、载药量。

包封率＝载入胶束中的药物量/投药量×100%

载药量＝载入胶束中的药物量/（载入胶束中的药物量＋投入载体质量）×100%

2.5 冻干制剂的制备及优化

以冻干制剂的外观、冻干前后粒径、复溶性、复溶后DOX与ICG含量变化作为评价指标，初步比较3种冻干保护剂（葡萄糖、乳糖、甘露醇）对冻干效果的影响^［9］，筛选出最佳冻干保护剂后，进一步考察不同浓度（0.5%、1.0%，2.0%、3.5%、5.0%）对H/DP-D/I胶束的冻干保护作用。具体操作为：最佳工艺制备的H/DP-D/I胶束溶液中加入适量最佳冻干保护剂，混合溶解后，按3 mL/瓶分装，于冰箱-20 ℃冷冻24 h后，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即得H/DP-D/I冻干制剂。

3 结　果

3.1 DOX与ICG含量检测方法学考察

3.1.1 紫外检测波长确定

DOX分别在波长233 nm和497 nm处含有2个吸收峰，但是在233 nm处HSU/DSPE-PEG和ICG均有吸收，为排除干扰，选择497 nm作为DOX含量的紫外检测波长。ICG的最大吸收波长为784 nm，在此波长处DOX和HSU/DSPE-PEG均无吸收，可以作为ICG含量检测波长。见图1。

3.1.2 标准曲线与线性范围

DOX的线性回归方程为A＝0.023 8C＋0.013 0（r＝0.999 9），结果表明DOX在质量浓度5～40 μg/mL范围内，与吸光度线性关系良好。ICG的线性回归方程为A＝0.269 2C＋0.009 1（r＝0.999 9），结果表明ICG在质量浓度0.8～3 μg/mL范围内，与吸光度呈良好的线性关系。

3.1.3 DOX、ICG日内精密度与日间精密度

采用本方法测定的DOX、ICG日间精密度与日内精密度结果见表1，计算DOX、ICG的日间精密度RSD和日内精密度RSD＜2%，说明仪器精密度良好。

3.1.4 DOX、ICG回收率实验结果

在200～800 nm检测波长范围内DOX和ICG回收率均在95%～105%，说明该方法的准确性高。见表2。

3.1.5 DOX、ICG的重复性实验结果

平行制备的6份H/DP-D/I胶束供试品溶液，稀释3倍后检测DOX和ICG吸光度，算得DOX、ICG含量分别为（235.71±4.43）、（217.40±4.54）μg/mL，RSD分别为1.88%、1.71%。RSD＜2%，表明本方法重复性良好。

3.1.6 DOX、ICG的稳定性实验结果

计算低、中、高3种浓度的DOX溶液和ICG溶液在24 h的RSD＜2%，表明DOX和ICG供试品溶液在24 h内稳定性良好。见表3。

3.2 不同载药方法对载药效果的影响

初步考察薄膜水合法、透析法、直接溶解法3种载药方法对H/DP-D/I胶束载药效果的影响。结果显示以透析法制备的H/DP-D/I胶束的DOX与ICG包封率、载药量均高于其余2种载药方法，且胶束粒径相对较小均一。因此，选择透析法作为H/DP-D/I胶束的载药方法，并进一步对透析法进行单因素考察。见表4。

3.3 透析法工艺单因素考察

3.3.1 加药方式对载药效果的影响

结果显示：DOX和ICG分开加药的包封率均高于混合加药，且粒径相对较小，但PDI偏大；DOX与ICG混合加药，PDI较小，粒径较均一。故本研究选择DOX与ICG混合加药的方式。见表5。

3.3.2 载体比例对载药效果的影响

当HSU与DSPE-PEG质量比为1∶0，即仅选用HSU作为载体材料时，DOX与ICG的包封率很低，均不超过20%，且粒径最大。HSU与DSPE-PEG共同作为载体材料时，H/DP-D/I胶束的粒径变小，DOX与ICG的包封率、载药量也得到显著提高；随着DSPE-PEG比例的增大，DOX的包封率、载药量呈上升趋势，ICG的包封率、载药量则是先增后减，而粒径表现为先减小后增大。当HSU与DSPE-PEG的质量比为1∶1时H/DP-D/I胶束的粒径、PDI最小，ICG的包封率、载药量最高，此时DOX的包封率为（92.42±1.45）%、载药量为（10.05±0.16）%，虽没有达到最高水平，但与DOX包封率最高时（HSU与DSPE-PEG的质量比为1∶1）相差不大。综合上述各指标确定HSU与DSPE-PEG质量比为1∶1。见表6。

3.3.3 DOX投药量对载药效果的影响

DOX投药量对H/DP-D/I胶束粒径影响不大。DOX和ICG的投药量越多，其载药量越高。DOX投药量为2.0、2.5 mg时其包封率比较无明显差异，而当DOX投药量增加至3.0、3.5 mg时，DOX和ICG的包封率反而降低。故从粒径、PDI、包封率、载药量及DOX原料药昂贵的价格等因素综合考虑，选择2.5 mg作为DOX的最佳投药量。见表7。

3.4 验证试验

以最佳制备工艺条件进行验证试验，制得H/DP-D/I胶束粒径为（178.3±2.1）nm，PDI为（0.100±0.020），DOX包封率、载药量分别为（92.09±1.67）%、（10.03±0.37）%，ICG包封率、载药量分别为（83.93±2.06）%、（9.12±0.20）%，表明优化后的制备工艺可重复性高，较为可靠。

3.5 冻干保护剂的筛选

不加冻干保护剂的H/DP-D/I冻干品外观最差，较难复溶。加入冻干保护剂冻干后，以甘露醇、葡萄糖为冻干保护剂的冻干品外观质地较次，复溶性较好；以乳糖为冻干保护剂的冻干品，外观最佳，复溶性较好。H/DP-D/I胶束冻干后药物含量均有所下降，以乳糖作为冻干保护剂的冻干品中DOX和ICG含量下降程度最低。综合考虑，选择乳糖作为H/DP-D/I胶束的冻干保护剂。见表8。

乳糖浓度为2.0%～5.0%时，冻干品易复溶但表面粗糙；乳糖浓度为1.0%时，冻干品表面平整、饱满，易复溶，DOX和ICG含量变化较小；乳糖浓度为0.5%时，冻干品中部略塌陷，复溶性稍差；因而选择1.0%乳糖作为H/DP-D/I胶束的冻干保护剂。H/DP-D/I胶束溶液加1.0%乳糖制备的冻干制剂用超纯水复溶前后粒径分别为（178.9±2.4）、（196.5±2.0）nm，PDI分别为（0.103±0.017）、（0.216±0.027），冻干前后H/DP-D/I胶束的粒径变化不明显。综合考虑，选择1.0%乳糖浓度最佳。见表9。

在验证试验中以1.0%乳糖作为冻干保护剂，制得的冻干制剂复溶后粒径为（195.9±0.3）nm，PDI为（0.209±0.014），DOX、ICG含量分别为（96.27±1.52）%、（94.16±0.60）%，表明此冻干工艺稳定性较好。

4 讨　论

通过初步筛选载药方法，发现透析法制备的胶束粒径、包封率和载药量最佳；且薄膜水合法、直接溶解法、透析法制备的H/DP-D/I胶束中DOX的包封率均大于ICG的包封率，可能是因为ICG是两亲性，而DOX的疏水性更强，更易载入胶束疏水内核。单因素实验结果显示：分开加药方式制备的胶束粒径不均一，产生多峰现象，可能是由于ICG易聚集，在加入过程中有一部分会自聚集形成二聚体，导致小粒径粒子的产生；混合加药方式制备的胶束PDI较小，可能是DOX与ICG混合后通过π-π共轭方式共组装^［10］，以纳米粒的形式进入胶束疏水内核，因此粒径较均一。本研究还发现当HSU∶DSPE-PEG比例为1∶1时，粒径最小且包封率、载药量最优，此时增加DOX投药量，其包封率先增后减，说明胶束对DOX和ICG的负载量已基本达饱和状态。综上所述，本研究制备了粒径较小、分散均一、具有高包封率和高载药量的H/DP-D/I胶束。该胶束增加了难溶性药物DOX、ICG的溶解度，从而降低了游离药物的毒副作用，为增强H/DP-D/I胶束抗癌疗效奠定了良好基础。

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