基于去卵巢大鼠骨骼肌与骨质量的变化探讨“筋骨并重”理论内涵

Exploring Theoretical Connotation of "Equal Emphasis on Bones and Muscles" Based on Changes in Skeletal Muscle and Bone Quality in Ovariectomized Rats

摘要

目的 观察雌性大鼠去卵巢术后4、8、12周股骨骨质量和骨骼肌形态及功能的变化情况，从而探讨“筋骨并重”理论的内涵。 方法 将36只3月龄SD雌性大鼠随机分为假手术组和去卵巢组各18只，去卵巢组切除双侧卵巢，假手术组切除卵巢周围与卵巢同等大小的脂肪组织。于术后4、8、12周各取6只，测定大鼠前肢抓力后，称量大鼠体质量，麻醉处死后取双侧腓肠肌称重并计算腓肠肌湿重比；HE染色观察腓肠肌纤维和股骨形态，并计算单位视野内骨小梁面积比；小动物X光机测定右侧股骨骨密度；力学三点弯曲实验检测右侧股骨最大载荷。 结果 与术后4周比较，假手术组术后8周前肢抓力、股骨骨密度、股骨最大载荷明显提高（P＜0.05），术后12周前肢抓力、体质量、腓肠肌湿重、股骨骨密度、股骨最大载荷明显提高（P＜0.05）；去卵巢组术后8周前肢抓力、体质量、股骨最大载荷明显提高（P＜0.05），腓肠肌湿重比明显降低（P＜0.05），术后12周前肢抓力、股骨最大载荷明显提高（P＜0.05），腓肠肌湿重比、股骨骨密度、股骨骨小梁面积比明显降低（P＜0.05）。与术后8周比较，假手术组术后12周前肢抓力、腓肠肌湿重、股骨骨密度、股骨最大载荷明显提高（P＜0.05）；去卵巢组术后12周前肢抓力明显提高（P＜0.05），腓肠肌湿重、股骨骨密度、股骨最大载荷、骨小梁面积比明显降低（P＜0.05）。与假手术组比较，去卵巢组术后8周体质量明显增加（P＜0.05），腓肠肌湿重比明显降低（P＜0.05）；术后12周前肢抓力、腓肠肌湿重、腓肠肌湿重比、股骨骨密度、股骨最大载荷、股骨骨小梁面积比明显降低（P＜0.05）。HE结果显示，术后8、12周去卵巢组大鼠腓肠肌细胞间距变宽且肌纤维间距增宽；术后12周去卵巢组股骨髁骨小梁稀疏、变细，间隙变宽，且部分骨小梁出现断裂、不连续等。 结论 卵巢切除后大鼠骨质量和骨骼肌形态、功能均发生不同程度退变，且肌肉退变早于骨骼，从实验角度探讨“筋骨并重”理论的科学内涵。

Abstract

Objective To observe the morphological and functional changes in femoral bone quality and skeletal muscle of female rats after ovariectomy at 4, 8, and 12 weeks, and to explore the connotation of the "equal emphasis on bones and muscles" theory. Methods A total of thirty-six 3-month-old female SD rats were randomly divided into sham surgery group and ovariectomy group, with 18 rats in each group. The ovariectomy group had bilateral ovaries removed, while the sham surgery group had adipose tissue removed of the same size as the ovaries. Six rats were selected from each group at 4, 8, and 12 weeks postoperatively for measurement of the forelimb grip and weighing. After anesthesia execution, the bilateral gastrocnemius muscles were weighed and the gastrocnemius muscle wet weight ratio was calculated. HE staining was used to observe the morphology of gastrocnemius muscle fibers and bone, and the area ratio of bone trabeculae per unit field of view was calculated; small animal X-ray machine was used to measure the bone density of the right femur; mechanical three-point bending experiment was used to detect the maximum load on the right femur. Results Compared with the 4th week post-operation, the sham surgery group showed a significant increase in forelimb grip, femoral bone density, and maximum femoral load on the 8th week post-operation (P<0.05), and a significant increase in forelimb grip, body weight, gastrocnemius muscle wet weight, femoral bone density, and maximum femoral load on the 12th week post-operation (P<0.05). Compared with the 4th week post-operation, the forelimb grip, body weight, and maximum femoral load in the ovariectomy group significantly increased on the 8th week post-operation (P<0.05), while the wet weight ratio of the gastrocnemius muscle significantly reduced (P<0.05); the forelimb grip and maximum femoral load significantly increased on the 12th week post-operation (P<0.05), while the wet weight ratio of the gastrocnemius muscle, femoral bone density, and trabecular area ratio of the femur significantly reduced (P<0.05). Compared with the 8th week post-operation, the sham surgery group showed a significant increase in forelimb grip, gastrocnemius muscle wet weight, femoral bone density, and maximum femoral load on the 12th week post-operation (P<0.05); the ovariectomy group showed a significant increase in forelimb grip, and a significant decrease in gastrocnemius muscle wet weight, femoral bone density, maximum femoral load, and trabecular area ratio of the femur on the 12th week post-operation (P<0.05). Compared with the sham surgery group, the ovariectomy group showed a significant increase in body weight on the 8th week post-operation (P<0.05), and a significant decrease in the wet weight ratio of the gastrocnemius muscle (P<0.05); the forelimb grip, gastrocnemius muscle wet weight, wet weight ratio of the gastrocnemius muscle, femoral bone density, maximum femoral load, and trabecular area ratio of the femur significantly reduced on the 12th week post-operation (P<0.05). The HE results showed that the distance between gastrocnemius muscle cells and muscle fibers widened in the ovariectomy group of rats on the 8th and 12th week post-operation; on the 12th week post-operation, the femoral condyle trabeculae in the ovariectomy group became sparse and thinner, with widened gaps, and some trabeculae appeared to be broken or discontinuous. Conclusion The bone quality and skeletal muscle morphology and function of rats undergo varying degrees of degeneration after ovariectomy, and muscle degeneration occurs earlier than bone. This study explores the scientific connotation of the "equal emphasis on muscles and bones" theory from an experimental perspective.

Graphical abstract

关键词

骨质疏松症 / 去卵巢大鼠 / 骨骼 / 骨骼肌 / 骨密度 / 筋骨并重

Key words

osteoporosis / ovariectomized rats / bones / skeletal muscle / bone density / equal emphasis on bones and muscles

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是因女性绝经后雌激素水平下降引起骨代谢失衡，导致骨量减少、骨强度下降、骨脆性增加等改变^［1］，对中老年妇女健康带来极大的危害^［2-3］。目前，对于PMOP发生的同时，骨骼肌变化情况越来越引起众学者的关注^［4-5］。有研究表明，PMOP患者出现握力及下肢肌力下降的情况^［4］，说明PMOP患者在骨骼发生退变的同时，骨骼肌也存在不同程度的退变，但骨骼肌开始发生退变的时间及退变情况尚未完全可知。当全身肌量和肌力减退时，会导致关节不稳，行走时平衡能力下降，增加跌倒的风险^［6］，脆性骨折发生率也相应增加。因此，通过观察女性绝经后骨骼肌退变的情况，对骨骼肌变化尽早实施有效干预，降低跌倒以及由跌倒引发的脆性骨折具有重要意义。近年来对骨骼肌功能及质量的改变关注相对较少，对骨质疏松症与骨骼肌退变的动物模型研究多为单一研究，对骨骼肌及骨质量共同退变的动物模型研究相对空缺^［7-9］。因此，本研究切除雌性大鼠卵巢并采用力学、形态学等方法观察卵巢切除后不同时间节点骨质量及骨骼肌质量的变化，并分析两者之间的相关性，旨在探求卵巢切除对骨骼和骨骼肌的影响，为临床应用提供实验依据，也从实验研究角度探讨“筋骨并重”的内涵。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级3月龄SD雌性大鼠36只，体质量（200±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2020-049，饲养于福建中医药大学医学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007。分笼饲养，自由饮水与标准SPF饲料进食，室温20～25 ℃，相对湿度45%，12 h光照/12 h黑暗。本实验方案经福建中医药大学动物伦理委员会审查并获得批准（3W2023124）。

1.2 实验试剂

0.9%生理盐水（货号：B6036）、4%多聚甲醛（货号：BL539A）均购自武汉博士德生物工程有限公司；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，货号：10009717）；二甲苯（上海沃凯生物技术有限公司，货号：x821391）；组织包埋盒（浙江硕华生命科学研究股份有限公司，货号：31050102W）；徕卡刀片（货号：G1120）、苏木素伊红染色试剂盒（货号：G1371）均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 实验仪器

高分辨率小动物数字X光机及骨密度分析系统（美国KUBTEC公司，型号：KU-21-Detector）；生物自动脱水机（型号：ZT-14S）、石蜡包埋机（型号：HM-325）均购自孝感市亚光医用电子技术有限公司；显微镜（日本尼康株式会社，型号：Ci-L）；智能组织切片分析系统（德国Leica公司，型号：APERIO VERSA）；小动物五合一痛觉测试系统（上海玉研科学仪器有限公司，型号：YAN125D）；生物力学测试仪（日本Shimadzu公司，型号：AG-IC 1KN）；电子天平（瑞士Mettler Toledo公司，型号：AL204）。

2 研究方法

2.1 分组与造模

将36只大鼠按照随机数字表法分为假手术组和去卵巢组，每组18只。2组大鼠按体质量40 mg/kg予2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经腹腔入路，切开皮肤后逐层分离筋膜、肌肉，切开腹膜，沿输卵管找到双侧呈桑葚状卵巢，去卵巢组将卵巢从蒂部以“0”号可吸收缝线结扎后切除，假手术组找到卵巢后切除卵巢周围相当大小的脂肪组织。切除后用生理盐水冲洗腹腔及切口，逐层缝合。

2.2 取材

2组大鼠分别于术后4、8、12周各取6只进行前肢抓力检测，检测结束禁水、禁食24 h后测量大鼠体质量，麻醉后处死，逐层剥离小腿后侧皮肤及筋膜，钝性分离直至完全暴露腓肠肌，沿股骨髁将腓肠肌完整游离，自跟腱止点处离断，将双侧腓肠肌完整取下称重，并计算双侧腓肠肌与体质量的质量比值，即腓肠肌湿重比。称重后将右侧腓肠肌用0.9%氯化钠溶液冲洗，置于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色观察。取下双侧腓肠肌后，将双侧下肢自髋、膝关节处离断，游离并完整取出双侧股骨，仔细剔除其上附着的软组织。将右侧股骨冲洗后置于5 mL EP管内并储存于-80 ℃冰箱，用于股骨骨密度及股骨力学性能检测；将左侧股骨冲洗后置于4%多聚甲醛固定，用于HE染色观察。

2.3 大鼠前肢抓力检测

采用小动物五合一痛觉测试系统测量大鼠前肢抓力。测量前将大鼠前肢放于抓板上适应5～10 s，待大鼠适应后，握住大鼠尾巴，待大鼠前肢抓稳后，用适量的力平行向后拖拽大鼠，直至大鼠掉落抓板，读取仪器显示数值，每只大鼠连续测量3次，取其平均值。

2.4 股骨骨密度检测

将大鼠右侧股骨于高分辨率小动物数字X光机及骨密度分析系统检测骨密度，每个样本进行3次检测并记录。

2.5 股骨力学性能检测

检测骨密度后在2组中随机选取3只大鼠的右侧股骨于生物力学测试仪上行三点弯曲实验检测其最大载荷。检测时将股骨放置于夹具，跨度为20 mm，以股骨中点为载荷施加部位，以2 mm/min的速率垂直施加载荷直至股骨断裂，记录其最大载荷值。

2.6 HE染色法观察腓肠肌病理变化

将4%多聚甲醛固定24 h后的右侧腓肠肌用流水冲洗30 min，用刀片仔细修切为5 mm×5 mm×5 mm大小并置于70%乙醇中12 h，逐步进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋及切片，进行苏木精-伊红染色，中性树胶封片，于显微镜下观察腓肠肌显微结构。

2.7 HE染色法观察股骨病理变化

左侧股骨4%多聚甲醛固定48 h后，自来水冲洗30 min，用10% EDTA溶液脱钙直至完全。切片后行HE染色，显微镜下观察骨小梁结构和形态，随机选取3个视野拍照，用智能组织切片分析系统分析单位视野内股骨髁骨小梁所占的面积比。

2.8 统计学方法

采用SPSS 24.0软件进行数据处理。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，组内不同时间点比较采用重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 2组术后前肢抓力比较

与术后4周比较，2组术后8、12周前肢抓力均明显提高（P＜0.05）；与术后8周比较，2组术后12周前肢抓力明显提高（P＜0.05）；与假手术组比较，去卵巢组术后12周前肢抓力明显降低（P＜0.05）。见表1。

3.2 2组术后体质量、腓肠肌湿重及腓肠肌湿重比比较

与术后4周比较，假手术组术后12周体质量和腓肠肌湿重均明显提高（P＜0.05）；去卵巢组术后8周体质量明显提高（P＜0.05），术后8、12周腓肠肌湿重比明显降低（P＜0.05）。与术后8周比较，假手术组术后12周体质量和腓肠肌湿重均明显提高（P＜0.05）；去卵巢组术后12周腓肠肌湿重明显降低（P＜0.05）。与假手术组比较，去卵巢组术后8周体质量明显提高（P＜0.05），术后12周腓肠肌湿重明显降低（P＜0.05），术后8、12周腓肠肌湿重比均明显降低（P＜0.05）。见表2。

3.3 2组术后股骨骨密度比较

与术后4周比较，假手术组术后8、12周股骨骨密度均明显提高（P＜0.05）；去卵巢组术后12周股骨骨密度明显降低（P＜0.05）。与术后8周比较，假手术组术后12周股骨骨密度明显提高（P＜0.05）；去卵巢组术后12周股骨骨密度明显降低（P＜0.05）。与假手术组比较，去卵巢组术后12周股骨骨密度明显降低（P＜0.05）。见表3。

3.4 2组术后股骨最大载荷比较

与术后4周比较，2组术后8、12周股骨最大载荷均明显提高（P＜0.05）。与术后8周比较，假手术组术后12周股骨最大载荷明显提高（P＜0.05）；去卵巢组术后12周股骨最大载荷明显降低（P＜0.05）。与假手术组比较，去卵巢组术后12周股骨最大载荷明显降低（P＜0.05）。见表4。

3.5 2组术后腓肠肌病理变化比较

假手术组大鼠术后腓肠肌纤维排列齐整，肌纤维间隙较窄，肌细胞大小较均匀，细胞间紧凑，排列整齐；去卵巢组大鼠术后8、12周腓肠肌肌细胞间距变宽，细胞形态不规则，排列逐渐紊乱，且肌纤维间距增宽。见图1。

3.6 2组术后股骨病理变化比较

2组大鼠术后4、8周股骨髁部骨小梁间距小，单位视野内骨小梁数目多，且骨小梁较宽，结构致密；去卵巢组术后12周股骨髁骨小梁稀疏、变细，间隙变宽，且部分骨小梁出现断裂、不连续等退行性改变。见图2。与术后4、8周比较，去卵巢组术后12周股骨骨小梁面积比明显降低（P＜0.05）；与假手术组比较，去卵巢组术后12周股骨骨小梁面积比明显降低（P＜0.05）。见表5。

4 讨　论

“筋骨”关系一直是中医理论体系中的重要组成部分。“筋”相当于现代医学中的肌肉、肌腱、韧带等软组织的统称^［10］，骨骼肌属于“筋”的范畴^［11］。“骨”包含人体骨骼和关节，是人体的支架。《黄帝内经》载：“骨为干，脉为营，筋为刚，肉为墙”，为“筋骨”关系奠定了理论基础。《说文解字》云：“筋，肉之力也；腱，筋之本，附着于骨”，说明筋和骨密不可分，筋依靠骨可以使机体屈伸，骨依靠筋得以伸缩活动，两者动态平衡，相互为用，故筋骨相关之本源体现在结构和功能上。在正常生理状态下，筋和骨维持着一种平衡状态，当筋与骨之间的平衡被打破时，两者之间会互相影响，形成恶性循环，共同致病^［12-13］。

清代医家吴谦在《医宗金鉴·正骨心法要旨》提出了“筋骨并重”的理论，认为在骨伤科疾病的诊治中，要从“筋骨”作为整体考虑^［14-15］，处理筋与骨之间的关系时，应从诊断、治疗、康复、预防等多方位遵循这一原则^［16］，现已成为中医骨伤科临床的四大基本原则之一^［17］。绝经后骨质疏松症伴骨骼肌退变属“痿证”范畴，女子七七，天癸竭，肝肾皆亏，气血俱虚，故不能荣养筋骨，筋骨则萎弱不用。在临床对于绝经前后中老年女性的诊断中，要应用中医骨伤科“筋骨并重”的诊治原则^［18］，不仅要关注天癸竭导致的骨枯、骨痿、骨痹等骨病，还要关注筋弛骨消、筋痿等病的发生，治骨之时在补肾基础上加以调肝舒筋之法，筋得肝血滋养以柔以韧，骨得肾精滋养以强以硬，肝肾同治以达筋骨平衡^［19］。

现代研究表明：骨骼和肌肉之间存在密切联系，两者可通过力学、旁分泌系统等因素相互影响^［20］。例如骨骼肌收缩引起的力学刺激会作用于骨骼^［10］，影响骨密度和骨质量^［21］。骨骼肌肌细胞分泌的肌肉生长抑制素（MSTN），在骨骼肌生长发育中起抑制作用，同时，MSTN可促进破骨细胞的形成和分化^［22-23］。PMOP的发生则与体内雌激素水平下降导致的成骨细胞与破骨细胞之间的平衡被打破有关^［24］。雌激素水平下降会导致体内骨代谢稳态失衡，同时通过调节骨骼肌中的线粒体解偶联蛋白3（UCP3）来调节能量代谢，还可以通过增强线粒体功能来增加骨骼肌细胞中ATP的有效产生^［25］。当PMOP发生时，骨骼肌功能发生退变的概率显著增高^［26］，且患者肌肉量和肌肉功能均低于绝经后骨质量正常的女性^［5］。同时有研究表明，补充雌激素能改善去卵巢大鼠的肌量和肌力^［27］。脆性骨折是骨质疏松症严重的并发症之一，跌倒是其独立的危险因素^［28］，跌倒的发生与患者自身体质量指数、肌力等密切相关。骨骼肌的退变则导致患者行走功能及机体平衡协调能力的下降，极大增加了跌倒的发生概率^［29］，故PMOP所致脆性骨折的发生除与骨骼脆性增加外，骨骼肌的退变也是不可忽视的关键因素^［30］。

研究发现：去卵巢组大鼠体质量及腓肠肌湿重在术后8周明显增加且达到最大，但腓肠肌湿重比随术后时间的延长而逐渐降低，且在术后12周腓肠肌湿重及其湿重比均低于同时期假手术组，与此同时腓肠肌结构和形态上发生了不同程度的退变，在8周时出现肌纤维间隙增宽，肌细胞间距变大，排列不整齐，至第12周时以上表现更明显，前肢抓力明显低于假手术组，说明在卵巢切除术8周后，大鼠骨骼肌的形态和质量上出现不同程度的退变，进而影响其肌力的大小。同时，卵巢切除后4周和8周大鼠股骨髁骨密度和股骨最大载荷均逐渐增大，至12周时则明显降低，且在术后12周时，股骨骨密度和最大载荷均明显低于假手术组，此时HE染色显示股骨髁部骨小梁变细、间距增宽、不连续甚至断裂，骨小梁面积比明显减少，说明卵巢切除后大鼠骨质量下降并非马上发生，而是至第12周时其骨骼退变才显现。以上结果均表明卵巢切除后大鼠骨骼肌和骨质量的退变具有时间相关性，且骨骼肌退变较骨质量更早。

综上，本研究表明卵巢切除术后大鼠骨骼肌和骨骼在结构和功能上均发生不同程度的退变，且骨骼肌退变较骨骼更早发生，提示临床在治疗绝经后骨质疏松症的同时，需高度重视骨骼肌的变化，治骨时亦需治筋，治筋以防骨病，从一定程度上阐释了“筋骨并重”的内涵，但二者退变的关联机制尚需进一步研究。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82374483)

福建省自然科学基金项目(2023J01130863)